专利名称：肠杆菌及其在生物絮凝中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及肠杆菌制备生物絮凝剂的方法及其用途。
背景技术：
我国是水资源短缺和污染比较严重的国家之一。要解决水资源短缺问题，除节约用水外，加强对污水的处理是目前亟待解决的问题。在水处理方法中，絮凝法是最常用的方法之一。在生活污水和各种工业废水中，常含有不同种类和数量的悬浮体和胶体，通过在水处理中加入絮凝剂，使这些溶胶和悬浮体脱稳，进而凝聚成大颗粒快速沉淀出来。絮凝剂的种类很多。无机絮凝剂如聚合氯化铝、聚合氯化铁等运行可靠，但耗资大，有一定危害，容易在消除一种污染的同时又带来另一种污染。以聚丙烯酰胺为代表的有机合成絮凝剂投加量少、速度快、适用范围广，但其在水中残留的单体不易被降解，具有强烈的“三致”效应。天然高分子絮凝剂类微生物絮凝剂的应用在20世纪60年代已有报道，70年代已有商品絮凝剂出售，如Allyn化学公司生产的Claron，Moglu公司生产的Moul-1aracel等。微生物絮凝剂可以分为:(I)直接利用微生物细胞的絮凝剂；(2)利用微生物细胞提取物的絮凝剂；(3)利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂。与常见的无机及有机合成絮凝剂相比，微生物具有许多独特的优点:(1)无毒无害，安全性高，能用于食品、医药等行业的发酵后处理；(2)易被降解，无二次污染；3)使用范围广，脱色效果独特，曾被用于水冶矿浆澄清、无机质悬浊液·分离、石油钻井、污水脱色、污泥脱水等方面，经微生物絮凝剂处理后的污水，更易于固液分离，沉淀物生成量少；(4)某些微生物絮凝剂的pH值稳定，热稳定性能好，用量小；(5)来源广泛，生产周期短，而且还能利用某些废水作为培养基，达到以废治废的目的。美国、日本、英国等是比较早对微生物絮凝剂进行研究的国家，相较于国外，我国起步较晚，但近来来也取得了很大的进展。也出现了大量的关于微生物絮凝剂的专利，如赵晓祥和夏莉莉申请的一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂对蓝藻的絮凝效果可达92% ;李强申请的一种放射状突然杆菌制备生物絮凝剂的方法中，该微生物絮凝剂耐热性好，对PH6-12范围的污水都有处理效果；何欢等申请的一种芽孢杆菌絮凝剂的制备方法中，该微生物絮凝剂对高岭土的絮凝效果可达90%以上。筛选高效絮凝剂产生菌仍是目前微生物絮凝剂中的重要研究内容，而且目前还未见到有关肠杆菌作为絮凝微生物的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种日沟维肠杆菌的新应用，该应用为污水的处理提供了新思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为:日沟维肠杆菌在制备微生物絮凝剂中的应用。所述日沟维肠杆菌菌种的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。进一步，所述的应用中，所述日沟维肠杆菌的生物保藏号为CCTCC M2013042。
本发明的目的之二在于提供微生物絮凝剂的制备方法及其制备的产品，该方法成本低,工艺稳定；所述产品pH值和温度耐受性好。为实现上述目的，本发明的技术方案为:微生物絮凝剂的制备方法，具体为:将日沟维肠杆菌菌种用适合于日沟维肠杆菌培养基发酵培养，并分离，所述菌体或菌液为微生物絮凝剂。进一步，所述的微生物絮凝剂的制备方法，具体包括以下步骤:A种子液的制备按下述比例制备种子培养基:葡萄糖，10.0g ;K2HP04，5.0g ;MgS04.7H20，0.2g ；KH2PO4, 2.0g ；NaCl,0.1g ;尿素，0.5g ;酵母粉，0.5g ;蒸馏水IL ;挑取固体培养基上的日沟维肠杆菌接种到灭菌后的所述种子培养基中，30±2°C通气培养24±6h，得种子液；B 发酵
将步骤A所得生长稳定期的种子液体按1-5%的接种量接种到发酵培养基中，30±2°C通气培养18±2h，离心分离，去除上清液，沉淀即为得到微生物絮凝剂，所述微生物絮凝剂的OD59tl为2.0-2.4 ;所述发酵培养基是按如下比例配制:葡萄糖，8.0-12.0g ；Κ2ΗΡ04,
5.0g ；MgS04.7Η20，0.2g ；KH2PO4, 2.0g ；NaCl,0.1g ;硝酸钠，1.0-1.5g ;蒸馏水 IL0进一步，所述的微生物絮凝剂的制备方法，步骤A中的种子培养基中的葡萄糖或步骤B中所述发酵培养基中的葡萄糖可等重量替换为蔗糖、乳糖、甘露醇和淀粉中的任一种或多种；步骤A中的种子培养基中的硝酸钠或步骤B中所述发酵培养基中的硝酸钠可等重量替换为蛋白胨、尿素、牛肉膏和硫酸铵中的任一种或多种。进一步，所述的制备方法，所述日沟维肠杆菌菌种的生物保藏号为CCTCCM2013042。所述的方法获得的微生物絮凝剂。进一步，所述微生物絮凝剂为菌体沉淀。其中，所述的微生物絮凝剂，所述日沟维肠杆菌菌种的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。本发明的目的之三在于提供污水中污泥沉淀的方法，该方法适用对象广，效果明显。为实现上述目的，本发明的技术方案为:运用所述的微生物絮凝剂强化污水处理中污泥沉淀的方法，将所述微生物絮凝剂投放至待处理污水中，所述微生物絮凝剂与待处理污水的比例以体积计为2% -10%，处理不少于0.5分钟。本发明的有益效果:1)在PH3-10范围下，本微生物絮凝剂的絮凝率均能达到90%以上，具有良好的PH稳定性；2)在20-70°C的温度范围内，本微生物絮凝剂的絮凝活性无明显差异；3)本微生物絮凝剂的絮凝时间短，效率高，且无需依赖金属离子作为添加剂。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。图1是日沟维肠杆菌在油镜下的形态图。图2是不同活性成分的分布图。
图3是图3不同碳源对日沟维肠杆菌絮凝活性的影响。图4是不同氮源对日沟维肠杆菌絮凝活性的影响。图5是不同pH环境下日沟维肠杆菌絮凝活性的变化。图6不同作用温度前处理对日沟维肠杆菌絮凝活性的影响。图7不同静置时间下日沟维肠杆菌絮凝活性的变化。图8是不同用量对日沟维肠杆菌絮凝效果的影响。图9不同金属离子对日沟维肠杆菌絮凝效果的影响。图10是在污水处理中的应用效果图片，左侧试管为处理前，右侧试管为处理后。本发明中，将日沟维肠杆菌eth_2 (Enterobacter gergoviae eth_2)送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏编号为CCTCC M2013042，地址位于中国武汉武汉大学，收到日期为2013年I月23日。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。本发明中的接种量，是以体积作为比较单位，比如移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。实施例中，絮凝率测定方法具体为:在50ml量筒内加入0.2g高岭土(4g/L)，Iml质量体积分数为I %的CaCl2水溶液(终浓度为0.2mg/ml)，Iml所述微生物絮凝剂(OD59tl值为2.0-2.4)，然后加水至50ml，上下颠倒摇匀20次，静置5min，同时以不加微生物絮凝剂的高岭土悬液为对照。取2cm处上清液，用分光光度计在550nm波长下测定吸光度值。絮凝率RF计算公式为:RF = (A-B)/AX 100%。式中:A为对照上清液的吸光度；B为样品上清液的吸光度。实施案例I高效絮凝菌的筛选与鉴定絮凝菌株从活性污泥、垃圾渗滤液中筛选，将分离获得的各菌株分别接入装有50ml种子培养基(下参实施例3)的250ml广口三角瓶中，置于摇床中于30°C、200rpm培养24h，取培养液进行絮凝率测定方法。得到一株絮凝活性最高的日沟维肠杆菌菌株，其生物保藏号为CCTCC M2013042菌株，命名为eth-2。并将其用作后续实验的作用对象。鉴定方法:eth-2如图1所示，通过16S rRNA测序(测序结果如SEQ ID NO:1所不)并在 NCBI 中比对，与 Enterobacter.Gergoviae (AB682278.1)相似度达到 99% 实施例2培养基的配制—、培养基配制1、固体平板培养基:胰蛋白胨，10.0g ;酵母粉，5.0g ；NaCl, 10.0g ;琼脂粉，20.0g ；蒸馏水，1L。 2、种子培养基:葡萄糖，10.0g ；K2HPO4, 5.0g ；MgS04.7H20，0.2g ；KH2PO4, 2.0g ；NaCl’0.1g ;尿素，0.5g ;酵母粉，0.5g ;蒸懼水 1L。3、发酵培养基:葡萄糖，10.0g ；K2HPO4, 5.0g ；MgS04.7H20,0.2g ；KH2PO4, 2.0g ；NaCl70.1g ;硝酸钠，1.0g ;蒸懼水 1L。二、微生物的培养和发酵条件:所述固体平板培养基培养条件:eth_2菌株接种于所述固体培养基中30°C培养I天，培养成熟后放在4 C冰箱中保存。所述种子培养基培养条件:种子培养基在115°C灭菌20min，灭菌后接入所述种子平板培养基菌种，30°C通气培养24h左右。所述发酵培养基发酵条件:发酵培养基在115°C灭菌20min，灭菌后，按照1%的接种量将菌种接种至发酵培养基中，30°C通气培养18h左右。三、微生物絮凝剂的制备:将生物保藏号为CCTCC M2013042为eth_2菌种接种到灭菌的种子培养基中，24h后取Iml种子液接种到发酵培养基中，在温度为30°C条件下培养18h后发酵液离心分离，去除上清沉淀即为得到生物絮凝剂。eth-2菌落小，约0.5mm,浅黄色，不透明，圆形，边缘及表面光滑，湿润，隆起。实施案例3eth_2作微生物絮凝剂的制备1、将最终得到的一定体积的培养液8000rpm,5minl离心,分别收集上清和沉淀，且沉淀用蒸馏水洗3次后重悬于相当体积的蒸馏水中，比较上清、沉淀悬液和发酵液分别对高岭土的絮凝效果，以确定絮凝活性的分布。结果如图2所示，发酵液、菌悬液和上清液的絮凝率分别为90.45%、94.36%和63.20%，表明eth_2的絮凝活性主要分布在菌体沉淀中，所以以下的实验中均使用经蒸馏水反复洗3次后重悬于蒸馏水的菌体沉淀作为微生物絮凝剂。2、碳源对微生物絮凝剂活性的影响:选取葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、淀粉、柠檬酸，各10g，作为发酵培养基的碳源，发酵培养基的其它成分为:K2HP04，5.0g ；MgS04.7Η20，0.2g ;KH2P04，2.0g ；NaCl,0.1g ;尿素，0.5g ;酵母粉，0.5g ;蒸馏水IL0对比不同碳源对絮凝活性的影响。结果如图3所示:eth_2除了柠檬酸不能利用外，其他碳源都能利用，其中利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖和甘露醇的絮凝率分别为86.17%,78.03%,55.67%,86.31%和81.48%。因为葡萄糖相较乳糖的成本较低，且两者絮凝率差别较小，所以选择葡萄糖作为后续实验发酵培养基的碳源。3、氮源对微生物絮凝剂活性的影响:选取单一的物质包括蛋白胨、尿素、牛肉膏、硝酸钠、硫酸铵，各0.lg，及混合物质0.5g尿素和0.5g酵母粉作为发酵培养基的氮源，发酵培养基的其他成分为:葡萄糖，IOg ;Κ2ΗΡ04，5.0g ； MgSO4.7Η20，0.2g ；KH2PO4, 2.0g ；NaCl,0.lg;蒸馏水1L。对比不同氮源各1.0g对絮凝活性的影响。结果(图4)说明eth-2能利用以上全部氮源，利用胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、尿素、NaNOjP (NH4)2SCU乍为氮源的絮凝率分别为95.03%,98.04%,53.63%,92.40%,98.00%和96.50%。其中利用酵母粉和NaNO3的絮凝率都能达到98%以上，考虑到NaNO3的成本低于酵母粉，且两者絮凝率相差较小，所以选择NaNO3作为后续实验发酵培养基的氮源。实施案例4eth_2微生物絮凝剂的稳定性1、eth-2微生物絮凝剂的pH稳定性将实施案例3中制备的微生物絮凝剂加入到pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的高岭土悬液中，按照上述絮凝率测定方法测试。絮凝结果(图5)表明，在PH3-10范围下，eth-2 的絮凝率分别为 95.80%,90.28%,93.63%,91.85%,94.10%,93.97%,92.32%和94.70%，都能达到90%以上，具有良好的pH稳定性。2、eth-2 微生物絮凝剂的温度稳定性
将实施案例3中制备的微生物絮凝剂分别置于20°C、30°C、50°C、7(rC和90°C水浴30min，按照上述絮凝率测定方法测试，絮凝结果如图6，处理后的絮凝率分别为87.89%,90.02%,82.58%、82.63%和 60.69%，除了 90°C处理后絮凝率有明显降低外，20°C、30°C、50°C和70°C水浴30min处理对絮凝活性影响不大。3、静置时间对微生物絮凝剂活性的影响将实施案例3中制备的微生物絮凝剂按照上述絮凝率测定方法测试，静置时间分别为0.5min、2min、5min、10min和15min,并以相应时间点的不加微生物絮凝剂的高岭土悬液的吸光度作为对照。结果(图7)表明eth-2在作用时间为0.5min时的絮凝率即可达到 97.82%，之后 2min、5min、IOmin 和 15min 絮凝率分别为 96.10%,94.35%,92.39%和93.33%，说明eth-2微生物絮凝剂的絮凝时间短，实际应用中有助于缩短絮凝时间。4、微生物絮凝剂用量对絮凝效果的影响将实施案例3中制备的微生物絮凝剂以0.05ml,0.1ml,0.5ml、1.0ml和2.0ml (OD59tl为2.0)不同用量做絮凝测试，测试结果如图8，以上用量的絮凝率分别为10.54%、42.25%、87.81%、95.08%和94.61。以上结果(图 8)表明用量为 0.5ml (OD59tl 为
2.0)时即可得到较好的絮凝效果，使得絮凝率达到87%以上。5、金属离子添加对微生物絮凝剂活性的影响配制金属离子浓度为0.09mol/L的下列溶液:NaCl、KCl> MgCl2> CaCl2、AlCl3和FeCl3。将以上溶液分别添加Iml到量筒中，再设置一组未添加任何离子的空白，将实施案例3中制备的微生物絮凝剂按照上述絮凝率测定方法测试。测试结果如图9所示，NaCl、KCl、MgCl2' CaCl2' A lCl3, FeCl3 和空白的絮凝率分别为 94.31%,94.83%,95.94%,97.35%,66.88%,20.16%和95.13%。结果(图9)表明金属离子的添加并没有显著提高eth_2的絮凝率。未添加金属离子情况下，eth-2的絮凝率仍可达到95%以上。实施案例5实际应用测试取泸州老窖污水处理过程中进入CASS池前的水48ml加入50ml量筒中，加入Iml质量分数为I %的CaCl2溶液和Iml的_eth_2悬液(OD59tl为2.4)，常温下上下颠倒摇匀20次，静置沉淀5min，同时以不加絮凝剂的污水为对照。取2cm处上清液，用分光光度计在550nm波长下测定吸光度值。经测定，eth-2微生物絮凝剂对污水的絮凝率可达90%。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.日沟维肠杆菌在制备微生物絮凝剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述日沟维肠杆菌的生物保藏号为CCTCCM 2013042。
3.微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，具体为:将日沟维肠杆菌菌种用适合于日沟维肠杆菌的培养基发酵培养，并分离，所述菌体或菌液为微生物絮凝剂。
4.根据权利要求3所述的微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤: A种子液的制备 按下述比例制备种子培养基:葡萄糖，10.0g ;Κ2ΗΡ04，5.0g ；MgS04.7Η20，0.2g ；KH2PO4,.2.0g ；NaCl,0.1g ;尿素,0.5g ;酵母粉,0.5g ;蒸懼水IL ;挑取固体培养基上的日沟维肠杆菌接种到灭菌后的所述种子培养基中，30±2°C通气培养24±6h，得种子液； B发酵 将步骤A所得生长稳定期的种子液体按1-5%的接种量接种到发酵培养基中，30±2°C通气培养18±2h，离心分离，去除上清液，沉淀即为得到微生物絮凝剂，所述微生物絮凝剂的OD59tl为2.0-2.4 ;所述发酵培养基是按如下比例配制:葡萄糖，8.0-12.0g ；K2HP04, 5.0g ；MgSO4.7Η20，0.2g ；KH2P04, 2.0g ；NaCl,0.1g ;硝酸钠，1.0-1.5g ;蒸馏水 IL0
5.根据权利要求4所述的微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，步骤B中所述发酵培养基中的葡萄糖进行等重量替换为蔗糖、乳糖、甘露醇和淀粉中的任一种或多种；步骤B中所述发酵培养基中的硝酸钠进行等重量替换为蛋白胨、尿素、牛肉膏和硫酸铵中的任一种或多种。
6.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述日沟维肠杆菌菌种的生物保藏号为CCTCC M 2013042。
7.权利要求3所述的方法获得的微生物絮凝剂。
8.根据权利要求7所述的微生物絮凝剂，其特征在于，所述微生物絮凝剂为菌体沉淀。
9.根据权利要求7所述的微生物絮凝剂，其特征在于，所述日沟维肠杆菌菌种的16SrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
10.运用权利要求7所述的微生物絮凝剂强化污水处理中污泥沉淀的方法，其特征在于，将所述微生物絮凝剂投放至待处理污水中，所述微生物絮凝剂与待处理污水的比例以体积计为2% -10%，处理不少于0.5分钟。
全文摘要
本发明属于微生物技术领域，具体涉及肠杆菌制备生物絮凝剂的方法及其用途，具体为日沟维肠杆菌在制备微生物絮凝剂中的应用，其作为微生物絮凝剂的制备方法为将菌种接种到灭菌的种子培养基中，培养后取种子液接种到发酵培养基中，在温度为30℃条件下培养18h后发酵液离心分离，去除上清沉淀即为得到生物絮凝剂；本发明工艺简单，成本低；制得的絮凝剂活性高、耐热性强、pH耐受性好、无二次污染，在污水处理中可强化污泥的沉降性，絮凝率可达到90％，具有良好的应用前景。
文档编号C12N1/20GK103232951SQ20131006187
公开日2013年8月7日 申请日期2013年2月27日 优先权日2013年2月27日
发明者宋立岩, 唐薇, 乔婧, 黄亦存, 尹雅洁, 李斗 申请人:重庆绿色智能技术研究院