体外慢病毒介导bmp-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法

专利名称：体外慢病毒介导bmp-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
技术领域：
:本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种软骨分化的方法，特别是一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法。
背景技术：
:近些年来，使用滑膜间充质干细胞进行半月板软骨修复是关节外科的热点问题。经典的组织工程学方法是将体外增殖诱导干细胞形成种子细胞，种植种子细胞在生物支架上，将支架移回生物体并添加各种细胞因子进行修复。既往许多研究者选择骨髓间充质干细胞(bone marrow-dervied mesenchymalstem cells, BMSCs)作为种子细胞。但是当De Barii发现了滑膜间充质干细胞(synovium-dervied mesenchymal stem cells, SMSCs)后，其迅速取代了 BMSCs。原因在于:尽管SMSCs在细胞形态、免疫表型、集落形成能力和分化潜能方面和BMSCs相似，但其具有更强的软骨分化潜能；此外，生理上当半月板出现损伤时，滑膜作为SMSCs的储存器，会移行定植到损伤处，和局部细胞一起，完成修复过程。所以选择SMSCs，更符合生理过程，并有更专一的软骨分化潜能。目前为止，有个案报道研究者采用转化生长因子3(TGF-0 3)和骨形成蛋白2(BMP-2)作为介导SMSCs向软骨分化的诱导因子。Sakaguchii1、Shirasawaiii和HorieMiv等利用TGF-β 3、BMP-2和地塞米松(Dex)，成功诱导SMSCs向纤维软骨分化。但这一过程中仍存在诸多问题:诱导所需的BMP-2浓度需要非常高(50 200g/L甚至更高)，且时间很长，这就导致SMSCs有向骨分化的可能。且体外反复应用细胞因子存在降解失活的可能，并大大增加培养费用。所以在本发明的实验中，采用慢病毒介导兔BMP-2基因转染SMSCs，并加入EGFP基因作为报告基因，从而为应用组织工程学方法进行软骨修复提供新思路和新方法
发明内容
:本发明的目的在于提供一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，所述的这种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法要解决现有技术中体外诱导滑膜间充质干细胞向软骨分化的方法成功率低、而且时间和成本高的技术问题。本发明提供了一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，包括一个将滑膜间充质干细胞分离、培养的步骤，还包括一个构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤，一个制备转染慢病毒的病 毒液的步骤，一个将转染慢病毒转染滑膜间充质干细胞的步骤，在所述的构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤中，首先根据BMP-2基因设计引物，通过逆转录反应扩增BMP-2基因，将已经包含EGFP报告基因的pFUGW质粒和BMP-2基因重组，构建重组质粒pFUGW-oBMP-2，在所述的制备转染慢病毒的病毒液的步骤中，利用所述的重组质粒pFUGW-oBMP-2加上包装质粒，共同构建转染慢病毒，然后再加入缓冲液培养、孵育、移去上清、过滤后得到转染慢病毒的病毒液，在所述的将转染慢病毒转染滑膜间充质干细胞的步骤中，取第三代以上的滑膜间充质干细胞和解冻的转染慢病毒的病毒液混合，将混合物离心、培养40-52小时，然后将上述的培养物加入不完全成软骨诱导培养液诱导培养液中诱导，诱导14天以上即可获得软骨细胞。进一步的，在所述的制备转染慢病毒的病毒液的步骤中，首先扩增重组质粒pFUGW-oBMP-2、包装质粒psPAX2和pMD2.G，提纯浓缩；其次将293T细胞的细胞密度调至IO7,放入培养瓶中培养，所述的培养瓶内含有DMEM培养基，所述的培养基中还包含有青霉素G、链霉素、小牛血清、聚赖氨酸，所述的青霉素G在DMEM培养基中的浓度为100U/ml、所述的链霉素在DMEM培养基中的浓度为100 μ g/ml、所述的小牛血清在DMEM培养基中的质量百分比浓度为10%、所述的聚赖氨酸DMEM培养基中的浓度为5%，将293T细胞于培养瓶孵育后加入含有pFUGW-oBMP-2、psPAX2、pMD2.G的缓冲液，孵育、移去上清、过滤后得到转染慢病毒的病毒液。进一步的，在所述的构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤中，将oBMP_2的cDNA用Agel和Nhel双酶切，同时，将已经包含EGFP报告基因的pFUGW用Agel和Nhel双酶切，然后加入T4DNA反应得到pFUGW-oBMP-2重组质粒。进一步的，在扩增BMP-2基因的过程中，所述的5’端的引物序列如SEQ IDNO:1所示，所述的3’端的引物序列如SEQ ID N0:2所示。进一步的，所述的不完全成软骨诱导培养液培养液是一个含TGF-P3、地塞米松、2-磷酸-抗坏血酸、脯氨酸、丙氨酸、1:100稀 释的ITS+Premix溶液的H-DMEM培养液；其中，在所述的H-DMEM培养液中，TGF- β 3的浓度为10ng/mL、地塞米松的浓度为I X IO^mol/L、2-磷酸-抗坏血酸的浓度为50μ g/mL、脯氨酸的浓度为40 μ g/mL、丙氨酸的浓度为lOOyg/mL、所述的1:100稀释的ITS+Premix溶液中含有胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、牛血清白蛋白、亚油酸，在所述的1:100稀释的ITS+Premix溶液中，胰岛素的浓度为6.25 μ g/mL、转铁蛋白的浓度为6.25μ g/mL、亚硒酸的浓度为6.25ng/mL、牛血清白蛋白的浓度为
1.25mg/mL、亚油酸的浓度为5.35mg/mL。尽管SMSCs和BMSCs在细胞形态、免疫表型、集落形成、分化潜能方面均类似，但SMSCs具有更强的软骨分化潜能，所以本发明选用SMSCs作为软骨修复的种子细胞。目前被认定可以促进SMSCs向软骨分化的细胞因子包括=TGF-P 1、BMP_2、IGF-1、DEX。TGF-β I可以增强SMSCs的扩增，并抑制其向骨和脂的分化，TGF-β I的作用机理通过ERK1/2MAPK信号通路实现的。ΒΜΡ-2被公认为最强的成骨因子。但是近年来的研究认为其亦可以诱导间充质干细胞向软骨分化。尽管目前对其机理知之甚少，但是其应用却日渐增广。但其应用过程中，仍然存在诸多问题:ΒΜΡ-2的制造工艺非常复杂，产量很低；且新陈代谢很快，诱导时间较短；且作为外来蛋白，当大量应用时可对机体产生有害作用。一些研究者尝试利用支架搭载缓释ΒΜΡ-2，但ΒΜΡ-2对材料高度敏感，当置于支架上，其活性会降低。所以为解决上述问题，采用将ΒΜΡ-2基因导入慢病毒，并转染SMSCs，从而使得BMP-2蛋白随SMSCs增殖而生成。有趣的是，在的实验结果看来，BMP-2可能是诱导SMSCs向软骨分化的关键因子。相比于其他的病毒载体，慢病毒载体不仅可以转染分裂期细胞，还可以转染非分裂期细胞。且目的基因的表达稳定、长效。EGFP，作为报告基因，可以直接被观测到。其在470nm处吸收可见光，并在510nm处发出绿色荧光。只要表达足够强烈，其可直接在活体观察。不同于其他荧光标记物，例如LacZ> Luc、β -galactosidase,其应用中无需再添加其他因子。所以，在本发明的实验中，使用了已经包含EGFP基因的pFUGW来转染SMSCs，从而使得观察变得简单明了。转染后，免疫荧光和Western blot结果均证实有BMP-2蛋白生成。被转染后的SMSCs，其安全性尤为重要，因为其决定了是否可以被用作种子细胞。相关的生长曲线表明细胞数量在第7天趋于稳定，表明其分化能力非无限制的。流式细胞仪被用于测定DNA含量，结果提示无假二倍体细胞，被转染的SMSCs均为正常的二倍体细胞。此外，核型分析显示SMSCs中含44条染色体。致瘤性试验表明其无致瘤性。这些结果都证实了SMSCs是安全的，可以被用作种子细胞。之后将安全的SMSCs放在不完全成软骨培养基上。发现其细胞形态从梭形细胞转为多边形细胞。通过RT PCR可检测到I型胶原、2型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达。间接免疫荧光结果亦表明有I型胶原和2型胶原生成。在正常的软骨发育不全病例中，可见MicroRNA_130a表达缺失。其在软骨形成过程中表达逐渐减少。其靶基因Runx3在软骨发育不全病例中亦表达缺失。Micro-145，作为正常关节软骨中Sox9的直接调节者，其通过结合3’ -UTR的特定结合位点而下调了 Sox9的表达。在人软骨表型中，Micix)-145非常重要。当其水平升高时，会降低特异性软骨细胞外基质基因(C0L2A1和聚集蛋白聚糖)和组织特异小RNA (miR-675and miR-140)的表达，同时升高RUNX2和MMP13的表达，后两者在骨性关节炎病例中多见。所有上述的结果均显示BMP-2可诱导SMSCs向软骨分化。本发明提供了一种用于半月板修复的新的种子细胞。经plentiV6-oBMP-2转染的SMSCs足够安全，为正常的二倍体细胞，无致瘤性，且在体外可自发向软骨分化。


:图1是转染前贴壁后I天光镜下(100X) SMSCs的形态学照片，光镜显示为梭形细胞。图2是转染前贴壁后14天光镜下(100X) SMSCs的形态学照片，光镜显示为梭形细胞。图3是转染前贴壁后14天电镜SMSCs的形态学照片，电镜显示核质比大。图4是免疫荧光试验。A、B、C、D依次为为绿色荧光显示波形蛋白生成；绿色荧光显示a -SMA生成；红色荧光显示有0ct4表达；红色荧光显示有Sox9表达。图5 是流式细胞仪结果。A、B、C、D、E 依次为 CD44(98.25%)、CD90 (98.75%)、CD29 (99.14%)、CD34 (几乎无)、CD45 (几乎无)。图6是多向分化实验结果。A、B、C依次为成骨诱导、成脂诱导、成软骨诱导。可见AKP染色(+)、油红染色(+)、碱性甲苯胺蓝染色显示有胞外基质GAG生成。图7显示慢病毒转染后的图；其中A为流式细胞仪显示转染率超过80% ；B为对应荧光图(100X)。图8显示转染培养后细胞形态(200 X)的照片。A为在不完全成软骨培养基上，细胞由梭形细胞变为多边形细胞；B为实验对照组中细胞形态几乎无变化。图9显示RT-PCR结果。实验组表达I型胶原、2型胶原等，且2型胶原更多；实验对照组少量表达I型胶原和2型胶原等；空白对照组不表达。图10显示免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色实验(200 X)的照片。红色荧光显示有I型胶原生成，绿色荧光显示有2型胶原生成，实验组被甲苯胺蓝染色，实验对照组和空白对照组均无染色。图11显示MiCT0RNA分析。A为在实验组、实验对照组、完全对照组、基线组中M1-130a的表达，B为在实验组、实验对照组、完全对照组、基线组中M1-145的表达。
具体实施方式
:实施例1:SMSCs的获取、分离和鉴定1.1 获取 SMSCs准备了 6只3月龄的新西兰大白兔(SPF级，Slack实验动物中心，中国科学院，http://www.slaccas.com)(平均体重2.1±0.3kg,雌雄不限)。固定麻醉后，取館旁直切口，逐层打开至关节囊，用组织剪取髌上囊滑膜组织。将取得的滑膜剪碎，37°C下用2型胶原酶(0.2%, Sigma-Aldrich 公司，http: //www.sigmaaldrich.com)消化 3 小时,经 200-lm滤网(佳宝公司，http://www.caiRou.com.cn/c20931)过滤后获取组织块，并培养于含20%FBS (Hyclone 公司 http: //www.hyclone.com)的 DMEM (GibcolBRL 公司，http: //www.gel company, com/products/gibco~brl)中。上述所有过程均在超净台(Sff_CJ_lF,佳宝公司，http: //www.caigou.com, cn/c20931)内完成。随后保存于 5%C02 孵箱中(CCL-170A-8,ESCO公司，http://escoglobal.com/home, php)中孵育14小时。随后再次剪碎、过滤后保存于含10%PBS的60mm培养皿中。每24小时换液以去除未贴壁的细胞。1.2SMSCs的分离 和纯化培养皿中包含多种细胞。基于阴性分离法原理分离SMSCs。向细胞群中加入了含有CD14 的戴诺磁珠(111-49D, Dynabeads CD14,卓康牛.物科技公司，http://www.caigou.com.cn/c42082),随后经过磁珠分选仪(KingFisher,安诺生物科技公司，http://ww.hbzhan.com/st31204/product 1832042.html)即得到纯化的 SMSCs。将这些细胞按照 IOOcells/cm2的密度培养14天后冻存于_80°C下作为Pl代。1.3形态学鉴定每天都通过倒置相差显微镜观察Pl代细胞的生长状况。将细胞消化成悬液后，随机选取100个视野，测量所见细胞的直径。同时，还进行了电镜观察。将P2代细胞用0.25%Trypsin/EDTA (YW003,宜滕生物公司，http://www.yitbi0.com)消化后,使用2.5%戍二醒和锇酸(帝科化工公司，http://www.whdic0.com/index, htm)固定90分钟。再用70%酒精饱和醋酸液铀染色,经酒精和丙酮脱色后包埋于环氧树脂618中(博伟化工公司，http://cqtnbw.qjyl68.com)。随后切成90nm超薄切片，再经乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染色后，于透射电镜(H-7650，HITACHI公司，http://www.hitach1.c0.jp)下镜检。结果:贴壁后2天，已经有一些梭形细胞；14天后，细胞几乎均为梭形细胞。此外，透射电镜显示核质比较大，核仁较大而细胞质却不发达(图1、2、3)，符合干细胞的形态学特征。
1.4免疫突光分析将P3代细胞种植于玻片上，用4%多聚甲醛固定，然后浸入2%BSA/PBS中10分钟。一抗包含 0ct4 (羊抗，1:50, Sigma-Aldrich 公司，http://www.sigmaaldrich.com)、波形蛋白和 a-SMA (均来源于鼠抗，1:200, Sigma-Aldrich 公司，http: //www.sigmaaldrich.com)和 Sox_2 (鼠抗，1:400, Sigma-Aldrich 公司，http://www.sigmaaldrich.com)。培养 24小时后，加入二抗，二抗包含 FITC-羊抗鼠 IgG (1:100, Sigma-Aldrich 公司，http://www.sigmaaldrich.com)、Cy3_ 羊抗鼠 IgG 和 Cy3_ 驴抗羊 IgG (均为 1:150, KPL 公司，http: //www.kpl.com)ο随后DAPI染色观察。结果:免疫荧光分析显示P3代细胞表达了波形蛋白和a -SMA，此二者为SMSCs的细胞表面标志物。此外，0ct4和Sox2表达也很强烈(图4)，尤其是0ct4，表明细胞有多向分化潜能。所以可以认为P3代细胞基本都为间充质干细胞了，并且有多向分化潜能。1.5流式细胞仪检测将P3代细胞使用0.25%Trypsin/EDTA消化。随后选取I X IO5细胞，加入多种荧光标记抗体，有 CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD44-FITC (均来源于晶美生物公司，http://www.jinRme1.com)和相应的同型对照抗体,混合均勻后避光室温静置20分钟。随后加入2mlPBS，离心5分钟，移去上清，加入300 μ 1PBS,再次离心，上机检测(FACSCalibur type, Becton Dickinson 公司，http: //www.bd.com)计数阳件细胞百分比，所有数据通过配套的CellQuest软件分析(Becton Dickinson)。结果:流式细胞仪结果显示上述细胞表达了 SMSCs的分子标记物，例如⑶44(98.25%)、CD29 (99.14%)、CD90 (98.75%)。而造血干细胞的分子标记物CD34、CD4却几乎没有表达(图5)。上述结果证实了扩增的细胞为SMSCs。1.6细胞多向分化潜能测定为了成脂，细胞被培养在含0.5 μ M地塞米松、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、50 μ M吲
哚美辛的成脂培养基上。4天后0.3%油红染色观察。为了成骨，细胞被培养在含IOOnM地塞米松、IOmM β -甘油磷酸盐、50 μ M抗坏血酸的成骨培养基上。21天后,使用他171^1 法(研晶公司，111^0://￥￥￥.yjbi0.com)分析碱性磷酸酶的表达。为了成软骨，细胞被培养在含500ng/ml的BMP-2、10ng/ml TGF-β 3、1(Γ7Μ地塞米松、50ug/ml2-磷酸-抗坏血酸、40ug/ml脯氨酸、100ug/ml丙氨酸，以及I比100稀释的 ITS+Premix (含 6.25ug/ml 胰岛素，6.25ug/ml 转铁蛋白，6.25ng/ml 亚砸酸，1.25mg/mlBSA,以及5.35mg/ml亚油酸)的DMEM培养基上。颗粒包埋切片后用甲苯胺蓝染色。成骨诱导的AKP染色显示兔SMSCs为阳性，阳性细胞中可见棕黄色的染色颗粒。成脂诱导，可见有大滴脂肪被油红染色。成软骨诱导可见细胞形态转为多角形，碱性甲苯胺蓝染色显示有胞外基质GAG成分(图6 )。上述结果证实兔SMSCs具有多向分化潜能。实施例2载体构建和转染

2.1引物设计兔BMP-2 的 GenBank 编号为 ΝΜ_0010826507，阅读框为 70_1257bp。据此利用 S⑶^#(http://www.yeastgenome.0rg/cgi—bin/web—primer) 十弓I夺勿。弓I物设计为 5，端:5’-CTAGCTAGCTGGAGGCTCTTTCAATGG-3’ (SEQ ID NO:1)。GCTAGC 为限制性内切酶 Nhel 的酶切位点，ATG为终止密码子；3’端:5’-GGGTTTACCGGTAAAGCAAAAACAAACCAA-3’ (SEQ ID NO:2)。ACCGGT 为限制性内切酶Agel的酶切位点，AAG为终止密码子。2.2BMP-2 扩增使用Trizol (Gibco 公司，http://zh.1nvitrogen.com)来抽提兔肝脏的总 RNA,使用5IU MMLV (业力公司，http://www.业力bio, cn)讲行逆转录反应。经70°C下反应5分钟，37 °C下反应60分钟，95 °C下反应5分钟的循环后，cDNA即被合成。使用PCR(TC9600-G-230V,Labnet 公司，http://www.labnet.net)将 oBMP-2 扩增至 1.2kb。反应条件为:94°C下2分钟；94°C下5秒、58°C下45秒、72°C下45秒、每30秒后一次循环；72°C下5分钟。2.3PlentiV6-oBMP2 包装将Agel 和 Nhel (TakaRa 公司，http: //www.takara.com, cn)从 IOunits/ μ L 稀释到lunit/μ L。再将oBMP-2的cDNA双酶切，并于70°C下灭活10分钟。IOOV电泳后从1%琼脂糖胶上的1.2kb条带处割胶。同时，将已经包含EGFP报告基因的pFUGW用Agel和Nhel双酶切，静置2小时。将双酶切好的载体和割下的胶带按照1:3的比例在16°C下反应I小时，期间加入T4DNA (业力公司，http: //www.yelibi0.cn)。即得到pFUGW_oBMP-2重组质粒。随后，扩增重组质粒pFUGW-oBMP-2，包装质粒psPAX2和pMD2.G (Didier Tro实验室，http://www.lentiweb.com);提纯浓缩至I μ g/ μ L备用。转染的前I天，先将293Τ细胞(本实验室保存)细胞密度调制107，再放入75ml培养瓶中，瓶内含DMEM培养基，包含有青霉素G( 100 U/ml )、链霉素(100 μ g/ml )、10%FBS、聚赖氨酸。将培养瓶保存于37°C下的5%C02 孵箱中 24 小时。另小心加入 pFUGW-oBMP-231 μ g、psPAX29 μ g、pMD2.GlO μ g 到双馏水中，将总容量调至1600 μ L，再加入150 μ LCaCl2 (2.5mol/L)和1750 μ LBES (业力公司，http://www.yelibi0.cn),混合均勻后室温下放置20分钟。然后逐滴将上述混合物加入含293T细胞的培养瓶中。将培养瓶再次保存于37°C下的5%C02孵箱中16小时.然后移去上清，用0.45 μ m滤纸滤过。将所得的病毒液冻存于-80°C下备用。同样做了对照组，除去不包含oBMP-2，其余所有步骤同上述相同。2.4plentiV6-oBMP-2转染SMSCs及其转染效率分析取P3代SMSCs，消化和计数后，选取5 X 104细胞和解冻的病毒液混合。将混合物离心(2500r/min)3小时后，重植回12孔板上。每孔加入Iml含10%FBS的L-DMEM，每2天更换培养基。每次更换培养基时，均使用荧光显微镜观察EGFP的表达情况。当混合物培养24小时后，通过荧光相差显微镜观察是否有绿光。每次更换培养基时，均使用荧光相差显微镜观察绿色荧光，取相同视野的荧光相和自然光相做比较，从而确定转染效率。同时还使用了流式细胞仪分析阳性率。此外，还进行了 Western blot检测。取培养转然后SMSCs的上清液，用3%PBS固定细胞3小时后，加入oBMP-2抗体和FITC-羊抗兔IgG，反应小时后，加入10mlNBT/BCIP,避光反应15分钟后行SDS-PAGE检测。结果:因为plentiV6-oBMP-2内含EGFP报告基因，所以可以直接在荧光显微镜下观察。被成功转染的SMSCs细胞可发出绿色荧光，而未成功转染的则无荧光。实时观察表明48小时后EGFP表达的绿色荧光达到最高峰，流式细胞仪结果显示此时表达率约为80%(图 7)。选取培养SMSCs的上清液做SDS-PAGE，随后转胶做Western blot。实验组在40000处有条带显出，而对照组则无。说明被plentiV6-oBMP-2转染后的SMSCs可表达BMP-2蛋白。实施例3转染后SMSCs安全性鉴定3.1细胞增殖动力学分析将转染后的SMSCs按50Cells/Cm2的密度种植于24孔板后，放入CO2孵箱中。每天选取3孔，用200 μ L0.25%Trypsin/EDTA消化后，用移液枪反复吹打成单细胞悬液。直到取完所有孔，之前培养基均不更换。每天每孔中的细胞数量都被计数后取均值记录。按照数值，依据方程绘制生长曲线并依次计算倍增时间。使用到的方程为TD=tlog2/log(N/N0)(t:从开始培养到被计数日的时间，单位小时；N:时间T时的细胞计数；N0:细胞总数)。结果:计数了 7天的细胞数，然后据此绘制了细胞生长曲线。按照相关公式，计算了细胞倍增时间，约为30.2±2.4小时。曲线显示细胞数量呈S行分布，到第7天时，细胞数量几乎保持稳定。结果说明SMSCs的生长并非无限制倍增的。3.2核型分析 首先制备了转染后SMSCs的染色体样本。SMSCs被加入到含0.1 μ g/ml秋水仙碱的营养液中培养4小时，随后用0.25%Trypsin/EDTA消化，用移液枪反复吹打成单细胞悬液。再用PBS洗涤2次后，离心混合液并取其沉淀物。随后用0.075M氯化钾低渗液重悬后，放置在37°C下30分钟，再次离心(IOOOrpm)，取其沉淀，用甲醇/冰醋酸(3:1)重悬固定15分钟。将细胞悬液从20cm高处逐滴滴在冰玻片上，过火3次，再用Giemsa染色10分钟。最后使用光镜观察计数染色体。然后使用流式细胞仪分析DNA含量。用PBS洗涤SMSCs3次，随后用0.25%Trypsin/EDTA消化，用移液枪反复吹打成单细胞悬液。经离心分离后，取其细胞沉淀用75%酒精重悬固定，放置在-20°C环境下24小时。之后用75%酒精和PBS洗涤细胞3次，再加入100100 μ g/ml核糖核酸酶。37°C下30分钟后，用40 μ g/ml碘化丙啶染色。同时，选取了兔股骨骨髓细胞，去除红细胞后作为同型对照。其余所有操作均相同。使用流式细胞仪分析DNA含量。结果:使用流式细胞仪确定了 DNA含量。可见G2-M期、GO-Gl期的曲线较为平滑，表明没有假二倍体。SMSCs在GO-Gl期、G2-M期、S期的分布为87.41%,0.00%、12.59%，表明SMSCs为正常的干细胞。3.3致瘤性分析将P3代的2 X IO7SMSCs注射到N0D/SCID小鼠(n=3)的左侧腹股沟皮下(SPF级，Slack实验动物中心，中国科学院，http://www.slaccas.com)。观察3个月看是否有肿瘤生成。结果:每周观察被注射了的N0D/SCID小鼠，共计3个月，并未发现任何肿瘤生成。表明被转染的SMSCs无致瘤性。上述结果共同证实被转染的SMSCs为正常的二倍体细胞，非无限增殖，且无致瘤型，是安全的，因而可作为种子细胞用于后续的实验。
实施例4转染后的SMSCs向软骨定向分化4.1RT PCR分析基因表达后续的所有实验中，均设置了以下3组，分别为实验组:经plentiV6-oBMP_2转染的SMSCs，记为plentiV6-oBMP-2(+);实验对照组:经plentiV6转染，但不包含oBMP-2的，记为plentiV6-oBMP-2(_);空白对照组:未经转染的SMSCs。将实验组细胞放置在DMEM上培养，含5mlFBS、5 μ L地塞米松(lmol/L)、5OyLTGF-0 3(lOyg/ml)。14天后，于光镜下观察细胞形态。此外，利用RT PCR分析I型胶原、2型胶原和细胞外基质的聚集蛋白聚糖的mRNA等的表达。结果:SMSCs在非完全成软骨培养基中培养14天后，可以发现细胞形态发生了很大改变，原本的梭形细胞逐渐变成了类似软骨细胞的多边形，而实验对照组形状并未改变(图8)(空白对照组无需观察)。使用Trizol 抽提总 RNA 后冻存在-70°C下。Oligo dT-Adaptor 引物(Bio-Rad 实验室，http: //www.biorad, com)、Rase Free dH20 (浩然生物公司，http:// www.haoranbi0.com)、dNTP 混合物(Promega 公司，http: //www.promega.com.cn)> RNase 抑制剂(浩然生物公司，http://www.haoranbi0.com)、M-MMLV 逆转录酶(Promega 公司,http: //www.promega.com, cn)等被用于进行逆转录反应。引物设计如下:I 型胶原(正义链:5’ -AGGTCCACATGGCCCCGTGG-3’ (SEQ ID NO:3))，反义链:5’ -AAAGGGGCCCAGAGGTCTTCCT-3’ (SEQ ID NO:4))；2 型胶原(正义链:5’ -AACACTGCCAACGTCCAGAT-3’ (SEQ ID NO: 5))，反义链:5’-AGTGGATATCGGCTA GACG-3’ (SEQ ID N0:6))；兔BMP-2 (正义链:5’ -TTGCTGGACACCCGGCTGAT-3’ (SEQ ID NO:7)，反义链:5’ -AGACCCTTACTGGTCACCTT-3’ (SEQ ID N0:8))；RhoA (正义链:5，-AAAAGGAACAGATTTAAGAAGT-3，(SEQ ID NO:9)，反义链:5’-TTTTGGAGTTCCCCTCACAGTC-3’ (SEQ ID NO:10))；Sox9 (正义链:5’-TTCCGTGACGTGGACATCGGC-3’ (SEQ ID NO: 11)，反义链:5， -AGCCTGACCCCCCTGGGGACCAG-3’ (SEQ ID NO:12));GAPDH (正义链:5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’ (SEQ ID NO: 13)，反义链:5’ -GAGGCATTGCTGATGATCTTG-3’ (SEQ ID NO:14))。合成过程在FASMAC (Fasmac 公司，http: //www.fasmac.c0.jp)中完成。使用IOXRNAPCRBuffer (博光生物公司，http://shiadingQ6545.11467.com)、dNTP混合物、Taq酶(TakaRa公司，http://www.takara.com, cn),以及上述提及的引物一起，在RT PCR中进行逆转录反应。结果:培养14天后，通过RT PCR结果，可见实验组明显表达软骨细胞特有的I型胶原、2型胶原，以及软骨分化信号分子的RhoA和Sox-9，此外还明显表达BMP-2蛋白。而实验对照组和空白对照组表达不明显(图9)。表明实验组细胞正在向软骨分化。

4.2间接免疫荧光实验和甲苯胺蓝染色转染后14天，取细胞用PBS洗涤3次后，用4%多聚甲醛固定30分钟。然后加入一抗(I 型胶原和 2 型胶原，均来自于 Sigma-Aldrich 公司，http: //www.sigmaaldrich.com)培养24小时，再加入二抗(FITC-羊抗鼠IgG (1:100 )、Cy3_羊抗鼠IgG (1:500 ))观察。细胞仅加入二抗的作为对照组。此外，还进行了甲苯胺蓝染色。将细胞用PBS洗涤3次后，用丙酮固定15分钟。然后再次洗涤，并用0.1%甲苯胺蓝染色。使用酒精和对二甲苯梯度脱水后光镜下观察。结果:实验组经慢病毒转染的SMSCs在不完全软骨培养基中诱导14天后表达1、II型胶原，且II型胶原更多，更偏向于纤维软骨，和RT-PCR结果类似；实验对照组由于培养基中仍有部分成软骨因子，因而表达部分1、II型胶原，但表达量明显较实验组少；空白对照组未表达1、II型胶原。而碱性甲苯胺蓝细胞化学染色结果显示实验组产生了软骨分化过程中特有的GAG,细胞形态上也更趋向于软骨样细胞的多边形，而实验对照组则没有GAG表达，空白对照组亦无表达。说明诱导分化的细胞具备软骨细胞特异的分泌特性。而未经诱导的SMSCs则不分泌GAG (图10)。4.3Real-Time PCR 分析 MicroRNA用Trizol抽提了 3个实验组的总RNA后，培养10天。逆转录体系包含:Iyg总RNA,dNTP 混合物 2 μ I,RTlOXBuffer2 μ 1、AMV 逆转录酶(λ 5 μ I 和 RNasin0.5 μ I (均来源于 Promege 公司，http://www.promega.com.cn)。弓I物设计如下:Mi 130a:5’ -GTCGTATCCAGTGCGCUCUUUUACAUUCUCUAATTGCACTGGATACGACCGCATT-3’ (SEQ IDNO:15)，Mi 145:
5’ -GTCGTATCCAGTGCGCAGUUUCCAGGAAUCCCUUAATTGCACTGGATACGACCGCATT-3’ (SEQID NO: 16).所有反应在 Gene Amp PCR System9700 (Applied Biosysytem 公司，http://www.appliedbiosystems, com)中完成，U6 作为内参照。29 μ L Real-Time PCR 的反应系统包含:25 μ L2 X Real qPCR MasterMix (包含 Modified DNA 聚合酶、SYBR Green 1、Optimized PCR buffer,5mM MgCI2、包含 dUTP的 dNTP 混合物。均来自于 Genencor 公司，http://www.genencor.com), I μ L 正引物、IuL 逆引物(Mil30a:F5，-CGGGGCAGTGCAAATGTTAAAA-3’ (SEQ ID NO: 17)，Mil45:F5’ -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCC-3’ (SEQ IDNO:18)，common:R5’ -AGTGCGAACTGTGGCGAT-3’(SEQ ID N0:19)和 2yL cDNA 模板。使用 ABISt印one Plus Real-Time PCR (ABI 公司，http: / / www.appliedbiosy stems, com)来计算 Ct 值(循环阈值)。上述实验重复3次，以取得Ct平均值。差别用双侧的方差分析。组间比较采用Bonferroni法，当P〈0.05认为有统计学差异。上述统计过程利用SAS8.02软件完成。结果:Real-Time PCR结果提示被plentiV6-oBMP_2转染后，SMSCs中与软骨分化相关的MicroRNA，M1-130a和M1-145的含量均显著升高(图11)。对于Mi_130a，以空白对照组的SMSCs作为基线，实验组为plentiV6-oBMP-2 (+)，而阴性对照组为plentiV6-oBMP-2(-)0完全对照组取自正常兔半月板组织。从结果图上可见，实验组为基线的7.8倍，实验对照组为1.2倍，完全对照组为15.5倍。统计学分析表明F值为5822.03(P〈0.001)，表明各组间存在有差异，进一步的Bonfeironi分解显示，实验组和基线组差别小于0.05，而实验对照组和基线组差别大于0.05。
对于M1-145，实验组为基线组的4倍，实验对照组为1.2倍，完全对照组为4.7倍。F值为135.52 (P〈0.001)，表明组间存在差异，进一步的Bonferroni分解显示，实验组和基线组差别小于0.05，而实验对照组和基线组差别大于0.05。上述两结果显示，被plentiV6-oBMP-2转染后，SMSCs内的MicroRNA含量接近正常半月板组织，未转染BMP-2组和基线组几乎都无差别。提示BMP-2可能在向软骨分化的过程中起关 键性作用。
权利要求
1.一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，包括一个将滑膜间充质干细胞分离、培养的步骤；其特征在于:还包括一个构建重组质粒pFUGff-oBMP-2的步骤，一个制备转染慢病毒的病毒液的步骤，一个将转染慢病毒转染滑膜间充质干细胞的步骤，在所述的构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤中，首先根据BMP-2基因设计引物，通过逆转录反应扩增BMP-2基因，将已经包含EGFP报告基因的pFUGW质粒和BMP-2基因重组，构建重组质粒pFUGW-oBMP-2，在所述的制备转染慢病毒的病毒液的步骤中，利用所述的重组质粒pFUGW-oBMP-2加上包装质粒，共同构建转染慢病毒，然后再加入缓冲液培养、孵育、移去上清、过滤后得到转染慢病毒的病毒液，在所述的将转染慢病毒转染滑膜间充质干细胞的步骤中，取第三代以上的滑膜间充质干细胞和解冻的转染慢病毒的病毒液混合，将混合物离心、培养40-52小时，然后将上述的培养物加入不完全成软骨诱导培养液诱导培养液中诱导，诱导14天以上即可获得软骨细胞。
2.如权利要求1所述的一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于:在所述的制备转染慢病毒的病毒液的步骤中，首先扩增重组质粒pFUGW-oBMP-2、包装质粒psPAX2和pMD2.G，提纯浓缩；其次将293T细胞的细胞密度调至107，放入培养瓶中培养，所述的培养瓶内含有DMEM培养基，所述的培养基中还包含有青霉素G、链霉素、小牛血清、聚赖氨酸，所述的青霉素G在DMEM培养基中的浓度为100U/ml、所述的链霉素在DMEM培养基中的浓度为100 μ g/ml、所述的小牛血清在DMEM培养基中的质量百分比浓度为10%、所述的聚赖氨酸DMEM培养基中的浓度为5%，将293T细胞于培养瓶孵育后加入含有pFUGW-oBMP-2、psPAX2、pMD2.G的缓冲液，孵育、移去上清、过滤后得到转染慢病毒的病毒液。
3.如权利要求1所述的一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于:在所述的构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤中，将oBMP_2的cDNA用Agel和Nhel双酶切，同时，将已经包含EGFP报告基因的pFUGW用Agel和Nhel双酶切，然后加入T4 DNA反应得到pFUGW-oBMP-2重组质粒。
4.如权利要求1所述的一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于: 在扩增BMP-2基因的过程中，所述的5’端的引物序列如SEQID NO:1所示,所述的3’端的引物序列如SEQ ID NO:2所示。
5.如权利要求1所述的一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于:所述的不完全成软骨诱导培养液培养液是一个含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸-抗坏血酸、脯氨酸、丙氨酸、1:100稀释的ITS+Premix溶液的H-DMEM培养液；其中，在所述的H-DMEM培养液中，TGF-β 3的浓度为10 ng/mL、地塞米松的浓度为I X 1(Τ mol/L、2-磷酸-抗坏血酸的浓度为50 μ g/mL、脯氨酸的浓度为40 μ g/mL、丙氨酸的浓度为100 μ g/mL、所述的1:100稀释的ITS+Premix溶液中含有胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、牛血清白蛋白、亚油酸，在所述的1:100稀释的ITS+Premix溶液中，胰岛素的浓度为6.25 μ g/mL、转铁蛋白的浓度为6.25 μ g/mL、亚硒酸的浓度为6.25 ng/mL、牛血清白蛋白的浓度为1.25 mg/mL、亚油酸的浓度为5.35 mg/mL。
全文摘要
本发明一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，包括一个将滑膜间充质干细胞分离和培养的步骤，一个构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤，一个制备转染慢病毒病毒液的步骤，一个利用转染慢病毒病毒液转染滑膜间充质干细胞的步骤，在制备转染慢病毒病毒液的步骤中，利用重组质粒pFUGW-oBMP-2和包装质粒共同构成转染慢病毒，在利用转染慢病毒病毒液转染滑膜间充质干细胞的步骤中，取第三代以上的滑膜间充质干细胞，和转染慢病毒的病毒液混合，然后加入不完全成软骨细胞诱导培养液中诱导后得到软骨细胞。本发明证明经转染慢病毒转染的SMSCs足够安全，在体外可自发向软骨分化。
文档编号C12N15/867GK103146755SQ201310065020
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者符培亮, 张雷, 丁喆如, 吴海山, 吴宇黎, 丛锐军, 陈松 申请人:中国人民解放军第二军医大学