具有高木糖消耗率的分离酵母菌株和使用所述菌株产生乙醇的方法
【专利摘要】本发明利用克隆和转化技术结合突变和菌株驯化技术来获得具有高木糖消耗率和乙醇产率的酵母。用于本发明中的所述克隆和转化可将木糖代谢基因转化到酵母中以解决一些酵母菌株无法利用木糖产生乙醇的问题。用于本发明中的所述突变和菌株驯化可提高木糖消耗率和乙醇产率以解决低消耗率和产率的问题。通过组合上文所提及的技术手段，本发明意外地获得具有高木糖消耗率和乙醇产率的突变体。
【专利说明】具有高木糖消耗率的分离酵母菌株和使用所述菌株产生乙醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及具有高木糖消耗率的分离酵母菌株和产生乙醇的发酵方法。具体来说，本发明提供具有高木糖消耗率的酵母属(Saccharomyces)菌株。
【背景技术】
[0002]过去数十年间对传统石化燃料(以石油为主的燃料)的大规模消费已付出了很高的代价并造成大量污染。而且，人们已认识到世界石油储量并非无穷无尽，且随着环境意识逐渐成长，已刺激人们开始研究替代性燃料的可行性，例如纤维乙醇，其可降低CO2产生。
[0003]目前用于产生乙醇的方法包括以下操作阶段:(a)使适当原材料发酵以获得发酵产物和(b)蒸馏通过发酵获得的产物，藉此产生乙醇。目前主要使用属于酵母属的酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为乙醇发酵的种菌。酿酒酵母细胞为圆形到卵形，直径为5 - 10微米且可有效利用己糖，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖等。上文所提及的发酵方法包括在含有氮源、碳源和微量元素等的培养基中接种酿酒酵母且在适当条件下执行发酵，且其涉及化学反应=C6H12O6 — 2CH3CH20H+2C02。
[0004]可使用各种生质原料进行酒精生产。用于通过发酵制造乙醇的多种多样的原材料可方便地分类为三种类型的农业原材料:糖、淀粉和木质纤维素材料。尽管生质乙醇可通过多种不同来源获得的糖或淀粉发酵来产生，但迄今为止，用于工业规模生产燃料酒精的底物是蔗糖和玉米淀粉。使用糖或淀 粉来生产乙醇的技术已发展成熟；然而，所述底物成本高，其可能与食品供应竞争且从所述来源生产乙醇不足以满足未来对燃料工业的需求。因此，业内对从木质纤维素生产乙醇的兴趣逐渐增加。由于木质纤维素可再生，资源丰富，不与食品供应竞争且可以相对较低的成本获得，所以木质纤维素是诸如玉米粒等其它乙醇原料的合意替代品。扩大燃料乙醇生产要求能使用较低成本的原料。目前，只有木质纤维素原料可从植物生物质获得足够数量来代替用于生产乙醇的作物。木质纤维素材料中的主要可发酵糖是葡萄糖和木糖，其分别占木质纤维素的约40%和25%。
[0005]然而，大多数能进行酒精发酵的酵母(如酿酒酵母)不能使用木糖作为碳源。工业为了能从木质纤维素水解产物生产乙醇，需要具有这些特性的生物体。科学家利用遗传技术或菌株驯化来改良用于产生乙醇的酵母或细菌的木糖发酵。US5789210提供能有效使单独的木糖发酵或同时使木糖与葡萄糖发酵的酵母菌株，其可使用重组DNA和基因克隆技术来产生,且所述技术已用于产生含有克隆木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XD)和木酮糖激酶(XK)基因的重组酵母，所述基因与不受葡萄糖的存在抑制的启动子融合。US6582944涉及经木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶基因转化的新颖重组酵母菌株，其能将木糖还原为木糖醇并因此能在活体内产生木糖醇。伯恩(Bjorn)等人提供酵母菌株TMB3001，其通过用木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶基因转化来解决不能代谢木糖以产生乙醇的问题(伯恩J(Biorn J)、巴贝HH(Barbel HH).非氧化性磷酸戊糖途径控制木糖的发酵速率但不控制 TMB3001 中的木糖(The non-oxidative pentose phosphate pathway controls thefermentation rate of xylose but not of xylose in TMB3001), 2002,欧洲微生物学会联合会酵母研究(FEMS Yeast Research) 2:227-282)。然而，其仍具有以下问题:木糖消耗率低(0.13g木糖/g生物质/小时)和乙醇产率低(0.15g产物/g所消耗木糖)。为解决这些问题，约翰松(Johansson)等人另外将转醛醇酶基因转化到酿酒酵母中以获得新菌株TMB3026，其可将木糖消耗率从0.12提高到0.23。(伯恩J，巴贝HH.非氧化性磷酸戊糖途径控制木糖的发酵速率但不控制TMB3001中的木糖，2002，欧洲微生物学会联合会酵母研究2:227-282);然而，仍未满足对工业生产的要求。凯撒(Kaisa)等人另外产生经转化酵母TMB3057，其改良木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶以及缺失的醛糖还原酶基因(GR3)的基因表达，从而提高乙醇产率并降低木糖醇副产物的形成(凯撒K、罗曼F (Romain F)、巴贝HH、玛丽GG (Marie GG).木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的高活性通过重组酿酒酵母改良木糖发酵(High activity of xylose reductase and xylitol dehydrogenase improvesxylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae), 2007,应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.73:1039-1046))。然而，此菌株仍具有木糖消耗率低(0.25g木糖/g生物质/小时)和乙醇产率低(0.27g产物/g所消耗木糖)的问题。此外，伊丽莎白(Elizebath)等人使用基因经修饰的酵母424A(LNH-ST)，其经粗糙链孢霉(N.crassa)和近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)的木糖还原酶基因以及树干毕赤酵母(P.stipitis)的木糖醇脱氢酶基因转化且具有三个氨基酸的优化密码子(伊丽莎白C、米洛斯拉夫 S.(Miroslav S.)、南希 W YH (Nancy W YH)、内森 SM (Nathan SM),乙酸和 pH 对葡萄糖与木糖通过遗传改造的酿酒酵母菌株共发酵为乙醇的效应(Effect of acetic acidand pH on the cofermentation of glucose and xylose to ethanol by a geneticallyengineered strain of Saccharomyces cerevisiae), 2010,欧洲微生物学会联合会酵母研究10:385-393)。此菌株也利用GAPDH启动子来控制TKLl、TALl、RKLl和RPEl的磷酸戊糖途径。然而，其仍具有以下问题:木糖消耗率低(在PH5下0.27g木糖/g生物质/小时)和乙醇产率低(0.785g产物/g所消耗木糖)和对乙酸的耐受性低(在培养基含有lg/L乙酸时，木糖消耗率从0.354降低到015)。
`[0006]因此，业内非常需要生物质(例如木糖)到乙醇的转化率改良的菌株和以较高产率产生乙醇的方法。
【发明内容】
[0007]本发明提供分离酵母菌株，其木糖消耗率高于1.1g木糖/克生物质/小时且包含一种或一种以上得自DSMZ保藏号25508的酿酒酵母菌株FENC-OOO的木糖代谢基因。
[0008]本发明另外提供产生乙醇的方法，其包含以下步骤:(a)在适宜发酵条件下用本发明的分离酵母菌株使含有木糖或葡萄糖来源的培养基发酵；和(b)从所述培养基回收乙醇。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1显示实例2中所提及不同菌株的木糖消耗率。
[0010]图2显示实例3中所提及酿酒酵母突变株的木糖消耗率。【具体实施方式】
[0011]本发明利用克隆和转化技术以及突变和菌株驯化技术来获得具有高木糖消耗率和乙醇产率的酵母。用于本发明中的克隆和转化可将木糖代谢基因转化到酵母中以解决一些酵母菌株无法利用木糖产生乙醇的问题。用于本发明中的突变和菌株驯化可提高木糖消耗率和乙醇产率以解决消耗率和产率低的问题。通过组合上文所提及的技术手段，本发明意外地获得具有高木糖消耗率和乙醇产率的突变株。
[0012]提供以下术语和方法的解释以更好地阐述本发明并引导所属领域技术人员实践本发明。除非上下文明确指示其它含义，否则本文所用“包含”意指“包括”且单数形式“一(a或an)”或“所述”包括复数含义。除非上下文明确指示其它含义，否则术语“或”是指所述二选一要素或两个或两个以上要素的组合中的单一要素。
[0013]除非 另有解释，否则本文所用所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解相同的意义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文阐述适宜的方法和材料。材料、方法和实例仅具有说明性而不打算进行限制。从以下详细说明和权利要求书可显而易知本发明的其它特征。
[0014]本文所用术语“产率”是指相对于起始材料的量的所产生产物的量。
[0015]本文所用术语“菌株”是指具有共同特征的一种特定物种的微生物。除非指示相反含义，否则术语“菌株”与“细胞”在本文中可互换使用。如所属领域技术人员将认识到，微生物菌株是由个别酵母细胞构成。另外，个别微生物细胞具有特定特征，所述特征可将所述细胞鉴别为其特定菌株的成员。
[0016]本文所用术语“亲本株”是指经历诱变以产生本发明微生物的微生物菌株。因此，词组“亲本株”的使用不一定等同于词组“野生型”或提供关于所提及菌株的历史的信息。
[0017]本文所用术语“突变”是指核酸分子中的插入、缺失或取代。
[0018]本文所用术语“诱变”是指一种方法，通过这种方法可在生物体的遗传材料(例如DNA)中产生一个或一个以上突变。使用“随机”诱变时，无法预测确切的突变位点，其出现于微生物染色体中的任何位置。
[0019]本文所用词组“诱变循环”一般是指用诱变剂或诱变剂的组合处理细胞，之后培养所述细胞以使存活细胞可繁殖。在多种情形下，将在每一诱变循环后筛选经诱变细胞以鉴别那些具有特定特征的细胞。另外，作为诱变循环的一部分，可在诱变后即刻或在仍暴露于诱变剂中时，使经诱变剂处理的细胞暴露于选择剂或选择培养基中。
[0020]本文所用术语“适宜发酵条件” 一般是指可以pH、温度、通气量等调节的发酵培养基和条件，优选地，最适条件使得微生物可产生所关注的碳基产物。为确定培养条件是否允许产生产物，可将微生物在接种后培养约24小时到一周且可获得并分析样品。测试合意产物在样品细胞中或在生长细胞的培养基中的存在。
[0021]根据上述说明，本发明提供分离酵母菌株，其木糖消耗率高于1.1g木糖/克生物质/小时且包含一种或一种以上得自DSMZ保藏号25508的酿酒酵母菌株FENC-OOO的木糖代谢基因。在一优选实施例中，分离酵母菌株是具有DSMZ保藏号25508的酿酒酵母FENC-OOO的分离菌株。
[0022]在一实施例中，本发明酵母菌株展现高木糖消耗率；优选地高于1.1g木糖/g生物质/小时。更优选地，木糖消耗率高于1.5g木糖/g生物质/小时。[0023]根据本发明，本发明酵母菌株包括(但不限于)酵母属菌株、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株、毕赤酵母属(Pichia)菌株和假丝酵母属(Candida)菌株。更优选地，本发明酵母菌株包括(但不限于)酿酒酵母菌株、卡尔斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)菌株、博伊丁酵母(Saccharomyces bulderi)菌株、巴尼特酵母(Saccharomyces barnetti)菌株、少抱酵母(Saccharomyces exiguus)菌株、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)菌株、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)菌株、卡尔斯伯酵母菌株、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)菌株、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)菌株、真菌克鲁维酵母(Kluyveromyces fungus)菌株、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)菌株、星形假丝酵母(Candida stellata)菌株和休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)菌株。最优选地,本发明提供具有DSMZ保藏号25508的酿酒酵母FENC-OOO的分离菌株。
[0024]木糖是可由多种生物体分解代谢或代谢为可用产物的五碳醛糖(戊糖，单糖)。根据本发明，木糖代谢基因包括一种或一种以上选自由以下组成的群组的基因:木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因、木酮糖激酶基因和木糖异构酶。
[0025]根据本发明，本发明酵母菌株是基于遗传克隆、转化、诱变、诱变循环和菌株驯化来产生。在一实施例中，本发明酵母菌株是通过克隆木糖代谢基因和将这些基因转化到亲本株中以获得经转化菌株来产生。可构筑载有抗生素抗性标记基因(例如kan，其编码卡那霉素(kanomycin)抗性)的质粒并使用其作为载体来将合意木糖代谢基因递送到染色体中。木糖代谢基因可通过用适宜限制性酶消化来分离并将其纯化，且随后通过转化或电穿孔将其引入宿主细胞中。在本发明一实施例中，酿酒酵母BCRC22743是用于转化的宿主。
[0026]之后，用诱变剂使经转化菌株突变。本发明并不限于展现高木糖消耗率和乙醇产率的细胞。换句话说，本发明包括特征为在培养生长指定时间段时能大量消耗木糖的细胞。在具体实施例中，本发明菌株是通过以下方式产生:使染色体上含有相关木糖代谢基因的酵母细胞在非天然启动子控制下经历I个、2个、3个、4个、5个或更多个循环的诱变，随后筛选以鉴别显示高木糖消耗率的细胞。
[0027]业内已知众多种执行诱变的方法且其可用于产生本发明的细菌菌株。一般来说，这些方法涉及使用化学试剂或辐射来诱导突变。用于诱变程序中的化合物类别的实例包括(但不限于)甲烷磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N-亚硝基脲N-亚硝基-N，N- 二乙胺(NDEA)和N-乙基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(ENNG)、羟胺、亚硫酸氢盐和硝基呋喃(例如7-甲氧基-2-硝基萘并[2，Ι-p]呋喃)，业内已知其可诱导核酸分子突变。所属领域技术人员可了解如何调节诱变剂的浓度和/或特定条件以达成合意突变率。
[0028]在细胞经历诱变后，可对其进行筛选以确定其是否具有如本发明所述的特定特征。所述特征的实例包括高木糖消耗率和乙醇产率。本发明菌株可通过使用多个诱变和筛选的循环来产生。在每次诱变处理后，可针对提高的木糖消耗率筛选经诱变细胞。
[0029]根据上述说明，本发明提供产生乙醇的方法，其包含以下步骤:(a)在适宜发酵条件下用本发明的分离酵母菌株使含有木糖或葡萄糖来源的培养基发酵；和(b)从所述培养基回收乙醇。
[0030]根据本发明，使用本发明的分离酵母菌株来使包含木糖或葡萄糖来源的碳源发酵。木糖或葡萄糖来源可为木糖或葡萄糖本身或可为包含木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚物或多聚物，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉和诸如此类。对于从所述碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元，可将适当碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和诸如此类)添加到发酵培养基中，或可通过经转化宿主细胞来产生所述酶。在后一情形下，经转化宿主细胞可经遗传改造以产生并分泌所述碳水化合物酶。在一优选方法中，经转化宿主细胞使木糖和葡萄糖二者发酵。除了作为碳源的木糖(和葡萄糖)来源外，发酵培养基将另外包含经转化宿主细胞生长所需的适当成份。业内非常熟悉用于诸如酵母等微生物生长的发酵培养基的组合物。
[0031]发酵方法是用于产生诸如以下等发酵产物的方法:乙醇、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙烯酸、柠檬酸、3-羟基-丙酸、氨基酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、β -内酰胺抗生素(例如青霉素G(Penicillin G)或青霉素V和其发酵衍生物)和头孢菌素。发酵方法可为好氧或厌氧发酵方法。厌氧发酵方法在本文中定义为在不存在氧的情况下运行或实质上不耗氧(例如小于5mmol/L/h)的发酵方法，且其中有机分子用作电子供体和电子受体二者。在不存在氧的情况下，无法通过氧化磷酸化来氧化在糖酵解和生物质形成中产生的NADH。为解决此问题，许多微生物使用丙酮酸盐或其衍生物中的一种作为电子和氢受体，由此使NAD+再生。因此，在优选厌氧发酵方法中，使用丙酮酸盐作为电子(和氢受体)且将其还原为诸如以下等发酵产物:乙醇、乳酸、1，3-丙二醇、乙烯、乙酸或琥珀酸。
[0032]发酵方法优选地在最适于经转化宿主细胞的温度下运行。因此，对于大多数酵母，在低于38°C的温度下执行发酵方法。对于酵母或丝状真菌宿主细胞，优选地在低于37、36、35、34、33、32、31、30、29或28°C的温度下且在高于20、21、22、23、24或25°C的温度下执行发酵方法。
[0033]根据本发明，在所述方法中，乙醇容积生产率优选地为至少0.6g乙醇/升/小时；优选地至少0.7g乙醇 /升/小时、0.8g乙醇/升/小时、0.9g乙醇/升/小时、1.0g乙醇/升/小时、1.1g乙醇/升/小时、1.5g乙醇/升/小时、2.0g乙醇/升/小时、2.5g乙醇/升/小时、3.0g乙醇/升/小时、3.5g乙醇/升/小时、4.0g乙醇/升/小时、4.5g乙醇/升/小时或5.0g乙醇/升/小时；更优选地约0.6g乙醇/升/小时到约2.5g乙醇/升/小时，或约1.0g乙醇/升/小时到约3.0g乙醇/升/小时。在方法中基于木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选地为至少50%、60%、70%、80%、90%、95或98%。
[0034]分离酵母菌株具有意外的木糖消耗率和高乙醇产率，因此所述酵母菌株有利于通过发酵方法产生乙醇。
[0035]SM
[0036]实例I木糖代谢基因的克隆和重组质粒的构筑
[0037]培养30个得自食品工业发展研究所(FoodIndustry Research and DevelopmentInstitute, FIRDI)的野生型菌株并使用含有10%乙醇的SX培养基进行选择，且选择一个对高含量乙醇具有高耐受性的菌株，即酿酒酵母BCRC22743。在以下条件下使用聚合酶链式反应(PCR)来克隆以下基因:
[0038]l.pGK 启动子
[0039]长度:643bp
[0040]类型:DNA
[0041]原始菌株:酿酒酵母[0042]基因注释:pGK启动子
[0043]正向引物:GACTACGCATGCGGCGCGAATCCTTTATTTTGGCTTC(SEQID NO:1)
[0044]反向引物:TGAATTACTGAACACAACATTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG(SEQ ID NO:2)
[0045]2.木糖还原酶
[0046]长度:957bp
[0047]类型:DNA
[0048]原始菌株:树干毕赤酵母
[0049]基因注释:木糖还原酶
[0050]正向引物:AAAACAATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCT(SEQ ID NO: 3)
[0051 ]反向引物:CAATTCAATTCAATTTAGACGAAGATAGGAATCTTGTC (SEQ ID NO:4)
[0052]3.木糖醇脱氢酶
[0053]长度:l，092bp
[0054]类型:DNA
[0055]原始菌株:树干毕赤酵母
[0056]基因注释:木糖醇脱氢酶
[0057]正向引物:GACTACGCGGCCGCGGCGCGAATCCTTTATTTTGGCTTC(SEQIDNO:5)
[0058]反向引物:AAGGAAGGGTTAGCAGTCATTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG(SEQID NO:6)
[0059]4.木酮糖激酶
[0060]长度:l，803bp
[0061]类型:DNA
[0062]原始菌株:酿酒酵母
[0063]基因注释:木酮糖激酶
[0064]正向引物:AAAACAATGT TGTGTTCAGTAATTCAGAG(SEQID NO:7)
[0065]反向引物:CAATTCAATTCAATTTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTCG(SEQIDNO:8)
[0066]5.DGK 终丨 h子
[0067]长度:433bp
[0068]类型:DNA
[0069]原始菌株:酿酒酵母
[0070]基因注释:pGK终止子
[0071 ]正向引物:GACTCTCATCTAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAG (SEQ IDNO: 9)
[0072]反向引物:
[0073]TAGAGTCCCGGGAGTCTGCTCGAGGAGATGCGGCCGCGACTTTTTTTGTTGCAAGTGGGAT(SEQ IDNO:10)
[0074]使用业内已知的遗传改造技术将经克隆基因引入pAURlOl质粒中以构筑重组载体[李L(Li L)、舒秋 C(Shuqiu C)、安雅 J VB (Anja J VB)、埃里克 BK (Eric BK).通过经修饰单链寡核苷酸载体引导的Rad51p和Rad54p而非Rap52p在酿酒酵母中提升基因修复(Rad51p and Rad54p, but not Rap52p, elevate gene repair in Saccharomycescerevisiae directed by modified single-stranded oligonucleotide vectors), 2002,核酸研究(Nucleic Acids Research) 30:2742-2750]。处理酿酒酵母 BCRC22743 以形成感受态细胞且用重组载体转化，从而使得可将木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因引入酿酒酵母BCRC22743的基因组DNA中。选择所得转化株以获得能使用木糖并产生乙醇的经转化菌株。
[0075]实例2所选转化株的木糖代谢和乙醇产生
[0076]根据实例I中所述的程序从1，000多个酿酒酵母转化株中选择5个能使用木糖并产生乙醇的经转化菌株，并将其命名为酿酒酵母RG352、酿酒酵母RG758、酿酒酵母RG316、酿酒酵母RG527和酿酒酵母RG589。在所选菌株中，酿酒酵母RG589能在5%SX培养基中产生最高乙醇浓度(16g/L)且达成0.21g木糖/g生物质/小时的木糖消耗率。然而，上文所提及的结果优于菌株TMB3001，但与菌株TMB3026、TMB3057和424A (LNH-ST)无显著差异。比较木糖消耗率展示于图1中。
[0077]实例3酿酒酵母RG589突变株的制备
[0078]用甲磺酸乙酯(EMS)溶液将酿酒酵母RG589细胞处理20分钟以获得突变株。将所得溶液离心并移除上清液。将残留细胞沉淀用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6)洗涤两次。在适当稀释后，将细胞接种于5%SX培养基(4.7g/L酵母氮源基础和50g/L木糖)中并在30°C和200rpm振荡下培养。如果在50g/L木糖浓度下培养的突变株可利用木糖来维持、生长、代谢并产生乙醇，则其使用木糖的能力更佳。在50g/L木糖浓度下将突变株培养三天后，取出突变株且随后将上文所提及的突变和培养方法执行二十次。将所得突变株平铺于SX培养基板上以供突变株选择。在两天后，选择快速生长的突变株并命名为酿酒酵母FENC-OOO，其由德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZelIkulturen，DSMZ)以保藏号25508来保藏。在将所选突变株用SX5%培养基在30°C和200印111振荡下培养24小时后，木糖消耗率达到1.54g木糖/g生物质/小时，其为RG589和424A(LNH-ST)的5倍到7.14倍。结果展示于图2中。
[0079]实例4使用酿酒酵母FENC-OOO的乙醇产生和比较产率
[0080]在30°C和200rpm振荡下用与一种或两种碳源混合的SX培养基培养实例3中提及的酿酒酵母FENC-000(SPDSMZ25508)和实例2中提及的酿酒酵母RG589。乙醇产率展示于
下表中。
[0081]
【权利要求】
1.一种具有 DSMZ 保藏号 25508 的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FENC-000 的分离菌株。
2.根据权利要求1所述的分离菌株，其具有选自由以下组成的群组的木糖代谢基因:木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因、木酮糖激酶基因和木糖异构酶。
3.根据权利要求1所述的分离菌株，其是通过以下方式获得:克隆一个或一个以上木糖代谢基因，将所述基因转化到宿主酵母菌株中，用诱变剂使所得菌株突变且选择木糖消耗率高于1.1g木糖/克生物质/小时的酵母菌株。
4.根据权利要求1所述的分离菌株，其可产生乙醇和以下物质中的至少一种:乳酸、乙酸、琥珀酸、丙烯酸、柠檬酸、3-羟基-丙酸、氨基酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、β -内酰胺抗生素和头孢菌素。
5.一种用于产生乙醇的方法，其包含以下步骤:(a)在适宜发酵条件下用根据权利要求I所述的分离菌株使含有木糖或葡萄糖来源的培养基发酵；和(b)从所述培养基回收所述乙醇。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述来源是包含木糖或葡萄糖单元的碳水化合物寡聚物或多聚物。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述碳水化合物寡聚物或多聚物是木质纤维素、木聚糖、纤维素或淀粉。
8.根据权利要求5所述的方法，其另外产生以下物质中的至少一种:乳酸、乙酸、琥珀酸、丙烯酸、柠檬酸、3-羟基-丙酸、氨基酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、β -内酰胺抗生素和头孢菌素。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述乙醇的生产率为至少1.0g乙醇/升/小时。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述乙醇的生产率为至少1.5g乙醇/升/小时。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述乙醇的生产率在约0.6g乙醇/升/小时到约2.5g乙醇/升/小时范围内。
12.根据权利要求5所述的方法，其中所述乙醇产率为至少70%。
【文档编号】C12R1/865GK103695329SQ201310074168
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年3月8日 优先权日:2012年9月27日
【发明者】庄育泉, 蔡秀虹 申请人:远东新世纪股份有限公司