专利名称：一种促进产气荚膜梭菌高产外毒素的培养基及其培养方法和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种促进产气荚膜梭菌高产外毒素的培养基及其培养方法和其应用。
背景技术：
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)又名魏氏梭菌,是一种重要的人畜共患病的病原体，可引起多种畜禽疾病，如仔猪红痢、鸡坏死性肠炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊肠毒血症、牛肠毒血症等，也能引起人的气性坏疽和食物中毒。人们根据其发病快的特征将其命名为“猝死症”。发病动物多以发病急、病程短、病死率高为特征，往往未见任何前期症状就来不及治疗而导致牲畜死亡，造成畜牧养殖业极大的经济损失。
孔繁德(孔繁德，陈琼，我国家畜促死症的病因与防治对策，《中国兽医杂志》，1999年，(3):50-52)等研究认为，“目前魏氏梭菌是家畜猝死症的主要病原”，引起猝死症的致病因子在于产气荚膜梭菌产生的外毒素。Haagsma (J.Haagsma.Pathogenetic anaerobic bacteria and the environment[J].Rev.sc1.tech.0ff.1nt.Eqiz.，1991，10(3):749-764)、柴同杰(柴同杰，马瑞华，常维山，等.产气荚膜梭状芽孢杆菌病的流行致病机制探讨，《中国预防兽医学报》，2001年，23 (I): 70-72)等研究指出，“魏氏梭菌的致病原因在于其分泌的毒素和代谢产物，无毒素产生则不会出现临床症状”，“动物魏氏梭菌感染导致的猝死症，主要由肠毒血症造成机体主要器官的衰竭所致”。迄今已发现α，β，γ，δ，ε，η，θ，ι，κ，λ，μ，ν12种外毒素,其中，以α，β，ε，ι外毒素较为常见。根据产生外毒素种类的不同,将产气荚膜梭菌分为Α、B、C、D、E五种毒素型。每种毒素型菌均可产生α毒素。A型菌主要产α毒素；B型菌主要产α、β、ε毒素；C型菌主要产α、β毒素；B型菌、C型菌的致病因素主要为β毒素；D型菌主要产α、ε毒素，且ε毒素为主要的致病因子；E型菌主要产α、ι毒素，但其发病率较低。外毒素的化学成分为蛋白质，具有较好的免疫原性。根据魏氏梭菌的发病机理，制备不同型的魏氏梭菌毒素，然后将其灭活脱毒制成类毒素疫苗或将类毒素制备成抗毒素，用于预防和治疗畜禽的“猝死症”，具有比菌苗更为高效、可靠的免疫效果。Uzal等(Uzal FA.,Kelly WR.Protection of goats against experimental enterotoxaemiaby vaccination with Clostridium perfringens type D epsilon toxoid.VeterinaryRecord，1998，142:722-725)以山羊为对象，设置ε类毒素疫苗免疫组、商用菌苗免疫组和不免疫对照组，研究了魏氏梭菌类毒素疫苗的免疫效果。结果表明，类毒素免疫组抗体效价最高，攻毒后获得保护；菌苗免疫组抗体效价较低，攻毒后有轻度的腹泻；未免疫对照组攻毒后出现严重的腹泻等症状。柴同杰等(柴同杰，刘文波，魏氏梭菌类毒素疫苗研制及其免疫家兔抗体消长规律，《中国预防兽医学报》，2006年，28(1):101-104)制备类毒素疫苗免疫家兔，保护效果可靠。魏氏梭菌类毒素疫苗可有效控制魏氏梭菌病的流行，用类毒素制备的抗毒素血清还能够用于患畜的紧急抢救治疗。
大量生长繁殖产气荚膜梭菌，使其分泌高效价的外毒素是制备高质量类毒素疫苗的关键。目前，一般使用厌气肉肝汤、厌气肉肝胃酶消化汤培养产气荚膜梭菌。这些培养基的配制工艺复杂，包括购肉、冷库保存、剔选、绞碎、保温消化、提清过滤等工序，需要消耗大量的人力、物力，且生产周期较长，并受肉品质的影响而影响培养基质量的稳定性，进而影响疫苗的品质。产气荚膜梭菌的产毒素能力与细菌菌株、培养基组成有关，还与培养温度、PH值、培养时间等培养条件相关。因此，研究适合产气荚膜梭菌生长繁殖且良好产毒的培养基及其培养方法具有十分重要的现实意义。发明内容
本发明的目的在于提供一种促进产气荚膜梭菌高产外毒素的培养基，所述培养基由下述重量份的成分组成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaCl3-6重量份，加水至1000重量份。
本发明的优选技术方案中，所述培养基由下述重量份的成分组成:牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaC15重量份,加水至1000重量份。
本发明的优选技术方案中，所述培养基的pH值为7.0-8.5，优选pH值为7.5-8.0。
本发明的优选技术方案中，所述的产气荚膜梭菌选自A型产气荚膜梭菌、B型产气荚膜梭菌、C型产气荚膜梭菌、D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌的任一种或其组合，优选为C型产气荚膜梭菌。
本发明的另一目的是提供一种促进产气荚膜梭菌高产外毒素的培养方法，包括下述步骤:
I)一级种子的培养:将产气荚膜梭菌接种于血平板，在33_37°C下培养16_24h，制得产气荚膜梭菌的一级种子；
2)二级种子的培养:从产气荚膜梭菌的一级种子培养物中挑取有双层溶血环的单菌落，将其接种于培养基中，在33-37°C下培养16-18h，制得产气荚膜梭菌的二级种子；
3)发酵培养:按照70% (v/v)在发酵罐中加入本发明所述的培养基，以培养基体积计，加入0.1% (v/v)的消泡剂，高压灭菌，将培养基降至35°C ±3°C，再按1%-3% (v/v)的接种量接种产气荚膜梭菌的二级种子，在33-37°C下和pH值6.5-8.0下培养5_7h，制得产气荚膜梭菌的发酵培养物，优选在116°C高压蒸汽灭菌30min ；
其中，所述培养基由下述重量份的成分组成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份,葡萄糖4-8重量份，NaC13-6重量份,加水至1000重量份，优选所述培养基由下述重量份的成分组成:牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaCl5重量份，加水至1000重量份。
本发明的优选技术方案中，所述产气荚膜梭菌的培养方法选自厌氧培养、静置培养、静置厌氧培养的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述培养基的pH值为7.0-8.5，优选pH值为7.5-8.0。
本发明的优选技术方案中，所述的产气荚膜梭菌选自A型产气荚膜梭菌、B型产气荚膜梭菌、C型产气荚膜梭菌、D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌的任一种或其组合，优选为C型产气荚膜梭菌。
本发明的优选技术方案中，发酵培养温度为35_36°C。本发明的优选技术方案中，发酵培养中采用氨水调节其pH值，优选pH值7.0-7.4。本发明的另一目的在于将本发明的产气荚膜梭菌外毒素或其提取物用于预防由产气荚膜梭菌引起的相关疾病的药物或疫苗中的应用。本发明的优选技术方案中，所述产气荚膜梭菌外毒素或其提取物经灭活脱毒制成的类毒素用于制备用于预防由产气荚膜梭菌引起的相关疾病的药物或疫苗中的应用。本发明的优选技术方案中，所述的相关疾病选自仔猪红痢、鸡坏死性肠炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊肠毒血症、牛肠毒血症、人气性坏疽、食物中毒的任一种或其组合。本发明的另一目的在于提供外毒素提取物的灭活脱毒方法，包括下述步骤:在37°C条件下，在外毒素或其提取物中加入甲醛，混合均匀，使其终浓度为0.4%-0.5%，放置，即得，优选放置3-8日，更优选放置3-5日。本发明的另一目的在于提供一种产气荚膜梭菌类毒素疫苗，所述的疫苗由灭活脱毒的毒素液与20%氢氧化招胶按体积比为5:1均匀混合而成。为了清楚地表述本 发明的保护范围，本发明对术语进行如下界定:本发明所述的产气荚膜梭菌外毒素又称产气荚膜梭菌毒素、产气荚膜梭菌分泌毒素、产气荚膜梭菌培养分泌毒素，是指从产气荚膜梭菌培养菌液离心后获得的毒素上清液。本发明所述的牛肉浸粉购自上海盛思生化科技有限公司，货号为SSC004。本发明所述的大豆蛋白胨购自北京双旋微生物培养基制品厂，货号02-19。本发明所述的血平板购自广东环凯微生物科技有限公司，货号024070。本发明采用小鼠最小致死量方法测定外毒素的含量。测定方法为:用生理盐水将Iml培养物上清液作200倍稀释，再以0.13ml,0.16ml,0.2ml,0.25ml,0.3ml,0.4ml对体重16 20g昆明小鼠进行尾静脉注射，每组的实验动物数为2只。观察小鼠在24小时内的存活情况，计算最小致死量(MLD)或Iml上清液含有的小鼠MLD数。若静脉注射0.2ml能使小鼠致死，则MLD为(0.2/200) ml=0.001ml, Iml上清液含有的小鼠MLD数为1000，即1000小鼠MLD。本发明所述类毒素含量的计算方法为:若脱毒前外毒素含量为A，浓缩前、后的毒素上清体积分别为V1、V2，浓缩回收率按85%计，则浓缩后的类毒素含量为(AX Vl X 85%) /V2。除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果:1、本发明改进产气荚膜梭菌的培养基组成，所述培养基含有牛肉浸粉、大豆蛋白胨、葡萄糖、NaCl等商品化生物化学试剂，具有培养基组成成份获取方便，且其培养方法具有工艺简便、质量稳定、生产周期短、制造成本低等优点。2、本发明的产气荚膜梭菌培养基可在适宜环境下实现产气荚膜梭菌的静置发酵培养，且相较于厌气肉肝胃酶消化汤(培养时间为16_20h)的发酵培养时间更短(仅需5-7h)，还利于促进产气荚膜梭菌高产外毒素，其外毒素的含量可达到500-1200小鼠MLD/ml，具有极好的产业应用价值。
3、本发明的外毒素或其提取物经灭活脱毒后制成类毒素，可用于预防由产气荚膜梭菌引起的相关疾病，所述的相关疾病选自仔猪红痢、鸡坏死性肠炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊肠毒血症、牛肠毒血症、人气性坏疽、食物中毒的任一种或其组合。
图1C型产气荚膜梭菌外毒素的SDS-PAGE蛋白电泳分析结果。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
实施例1本发明培养基的组成及其制备方法
技术领域：
本发明培养基的组成为:
牛肉浸粉 25g
大豆蛋白胨IOg
葡萄糖5g
NaCl5g
蒸馏水适量，将培养基定容至1000ml。
本发明培养基的制备方法，包括下述步骤:按照上述培养基组成称取所需量的组份，均匀混合后，加入适量的蒸馏水，充分溶解后，用ION氢氧化钠调pH值7.5-8.0，再加入蒸懼水定容至1000ml, 116°C灭菌30min,即得。
实施例2产气荚膜梭菌高产外毒素的培养方法
技术领域：
本发明所述产气荚膜梭菌高产外毒素的培养方法，包括下述步骤:
I) 一级种子的培养:将生产用冻干菌种C型产气荚膜梭菌C59-2 (由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应)接种于血平板，于培养箱中33-37°C厌氧培养16-24h ；
2) 二级种子的培养:挑取有双层溶血环的单菌落，接种于本发明所述的培养基，于培养箱中33-37°C静置培养16-18h ；
3)发酵罐培养:按发酵罐容积的70% (v/v)加入实施例1制得的培养基，以培养基体积计，加入0.1% (v/v)的消泡剂，116°c高压蒸汽灭菌30min，将培养基降至35°C ±3°C，再按1%-3% (v/v)接种量接入二级种子，静置培养，在35-36°C和pH7.0-7.4条件下培养5-7h,即得。
实施例3产气荚膜梭菌外毒素的制备方法
产气荚膜梭菌外毒素提取物的制备方法，包括下述步骤:将实施例2制得的产气荚膜梭菌的发酵培养物经管式离心机(GQ105B，上海知正离心机有限公司生产)，14800g离心，取上清，即得。
实施例4产气荚膜梭菌外毒素的检测
I)外毒素含量的测定
采用小鼠最小致死量方法测定外毒素的含量。实施例2培养后的产气荚膜梭菌的外毒素含量可达到500-1200MLD/ml。
2 ) SDS-PAGE 蛋白电泳将实施例3制得的产气荚膜梭菌外毒素上清进行SDS-PAGE蛋白电泳，结果见图1。电泳结果表明，实施例3制得的产气荚膜梭菌外毒素主要含有分子量约为43KD的α毒素和约为34KD的β毒素2条蛋白条带。实施例5本发明类毒素疫苗的制备本实施例类毒素疫苗的制备方法，包括下述步骤:I)外毒素的灭活脱毒:在实施例3制得的外毒素上清中加入甲醛，使其终浓度为0.4%-0.5%，在37°C条件下作用3-8日，期间振荡数次；2)外毒素的脱毒检验:将脱毒后的毒素液静脉注射16_20g小鼠2只，每只0.4ml,观察24小时，若均健活，即脱毒完全；若有死亡，则要继续脱毒；3)类毒素的浓缩:采用Pellicon切向流超滤系统(改良聚醚砜膜包，货号为P2B005A05)对类毒素进行适当倍数的浓缩，并计算浓缩后的类毒素含量；4)类毒素疫苗的制备:取类毒素浓缩液与20%氢氧化铝胶按5:1混合，制成疫苗，其中，类毒素含量为2000MLD/ml (以脱毒前计算)。实施例6本发明类毒素疫苗的评价试验I)安全检验用体重1.5_2kg的健康家兔4只`，各肌肉注射疫苗4ml，观察10日，观察是否健活，有无局部或全身异常反应。在观察期内，试验兔全部健活，食欲正常，体温正常，接种部位无红肿发热现象，表明制备的类毒素疫苗安全性较好。2)效力试验①血清中和法用1.5-2.0kg健康家兔4只，各肌肉注射疫苗0.4ml，免疫后14日采血并分离血清。将4只家兔的血清等量混合，取混合血清Iml与等量的C型产气荚膜梭菌毒素(含10小鼠MLD)混合，置37°C作用40分钟后，静脉注射体重16_20g小鼠2只，每只0.2ml ;同时，用同批小鼠2只，静脉注射I小鼠MLD的C型产气荚膜梭菌毒素作为对照组。观察24小时，判定结果。统计各组小鼠的健活情况。结果显示，对照组小鼠全部死亡，血清中和组小鼠全部健活，效力检验合格。②怀孕母猪定量免疫、仔猪定量攻毒试验将4头怀孕69-74日左右的初胎母猪设置为免疫组和不免疫对照组，每组2头。免疫组于临产前40-45日和15-20日各接种I次，每次每头接种2ml。母猪分娩后，对免疫组和不免疫对照组母猪所产I日龄仔猪各取5头，耳静脉注射致死量的C型产气荚膜梭菌毒素，另设不免疫对照组母猪所产仔猪5头为正常对照，攻毒后连续观察14日，统计各试验组仔猪的发病和保护情况。结果显示，免疫母猪所产I日龄仔猪，经耳静脉注射致死量的C型产气荚膜梭菌毒素，连续观察14日，各仔猪均健活，保护率均为100% ;对照组I日龄仔猪攻毒后在24小时内全部死亡，结果见表I。表IC型产气荚膜梭菌毒素攻毒试验结果
权利要求
1.一种促进产气荚膜梭菌高产外毒素的培养基，所述培养基由下述重量份的成分组成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaC13_6重量份，加水至1000重量份，优选所述培养基由下述重量份的成分组成:牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaC15重量份,加水至1000重量份。
2.根据权利要求1所述的培养基，所述培养基的pH值为7.0-8.5，优选pH值为7.5—8.0 ο
3.根据权利要求1-2任一项所述的培养基，所述的产气荚膜梭菌选自A型产气荚膜梭菌、B型产气荚膜梭菌、C型产气荚膜梭菌、D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌的任一种或其组合，优选为C型产气荚膜梭菌。
4.一种促进产气荚膜梭菌高产外毒素的培养方法，包括下述步骤: 1)一级种子的培养:将产气荚膜梭菌接种于血平板，在33-37°C下培养16-24h，制得产气荚膜梭菌的一级种子； 2)二级种子的培养:从产气荚膜梭菌的一级种子培养物中挑取有双层溶血环的单菌落，将其接种于培养基中，在33-3 7°C下培养16-18h，制得产气荚膜梭菌的二级种子； 3)发酵培养:按照70%(v/v)在发酵罐中加入培养基，以培养基体积计，加入0.1% (v/V)的消泡剂，高压灭菌，将培养基降至35°C ±3°C，再按1%-3% (v/v)的接种量接种产气荚膜梭菌的二级种子，在33-37°C下和pH6.5-8.0下培养5_7h，制得产气荚膜梭菌的发酵培养物，优选在116 °C高压蒸汽灭菌30min ； 其中，所述培养基由下述重量份的成分组成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaC13-6重量份,加水至1000重量份,优选所述培养基由下述重量份的成分组成:牛肉浸粉25重量份,大豆蛋白胨10重量份,葡萄糖5重量份，NaC15重量份，加水至1000重量份。
5.根据权利要求4所述的培养方法，所述产气荚膜梭菌的培养方法选自厌氧培养、静置培养、静置厌氧培养的任一种或其组合。
6.根据权利要求4-5任一项所述的培养方法，发酵培养中采用氨水调节其pH值，优选pH 值为 7.0-7.4。
7.根据权利要求4-6任一项所述的培养方法，所述培养基的pH值为7.0-8.5，优选pH值为 7.5-8.0。
8.根据权利要求4-7任一项所述的培养方法,发酵培养温度为35-36°C。
9.根据权利要求4-8任一项所述的培养方法，所述的产气荚膜梭菌选自A型产气荚膜梭菌、B型产气荚膜梭菌、C型产气荚膜梭菌、D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌的任一种或其组合，优选为C型产气荚膜梭菌。
10.一种产气荚膜梭菌外毒素提取物，由下述方法制备得到:将权利要求4-9任一项制得的产气荚膜梭菌的发酵培养物在4°C条件下14800g离心，取上清，即得。
11.一种产气荚膜梭菌外毒素提取物的制备方法，包括下述步骤:将将权利要求4-9任一项制得的产气荚膜梭菌的发酵培养物在4°C条件下14800g离心，取上清，即得。
12.权利要求4-11任一项制得的产气荚膜梭菌外毒素或其提取物用于预防由产气荚膜梭菌引起的相关疾病的药物或疫苗中的应用，优选所述产气荚膜梭菌外毒素或其提取物经灭活脱毒制成的类毒素用于预防由产气荚膜梭菌引起的相关疾病的药物或疫苗中的应用，所述的相关疾病选自仔猪红痢、鸡坏死性肠炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊肠毒血症、牛肠毒血症、人气性坏疽、食物中毒的任一种或其组合。
13.—种外毒素提取物的灭活脱毒方法，包括下述步骤:在37°C条件下，在权利要求10所述的外毒素提取物中加入甲醛，混合均匀，使其终浓度为0.4%-0.5%，放置，即得，优选放置3-8日，更优选放置3-5日。
14.一种产气荚膜梭菌类毒素疫苗，所述的疫苗由类毒素液与20%氢氧化铝胶按体积比为5:1均匀混合 而成。
全文摘要
本发明公开了一种促进产气荚膜梭菌高产外毒素的培养基及其培养方法和其应用。本发明所述培养基由牛肉浸粉、大豆蛋白胨、葡萄糖、NaCl和蒸馏水组成，产气荚膜梭菌在适宜环境下厌氧静置发酵培养，外毒素的含量可达到500-1200小鼠MLD/ml。外毒素经灭活脱毒制成的类毒素用于预防由产气荚膜梭菌引起的相关疾病的药物或疫苗中的应用。本发明培养基具有原料易得，制备工艺简便、质量稳定，生产周期短，外毒素产量高，制造成本低等优点。
文档编号C12P21/00GK103160555SQ20131008623
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者熊媛媛, 蒋玉文, 漆世华, 黄涛, 郑佳, 朱薇, 谢红玲, 温文生 申请人:武汉中博生物股份有限公司