专利名称：一种鉴定水稻和陆稻的方法
技术领域：
本发明涉及到一种鉴定栽培稻水稻或陆稻生态型的方法，尤其涉及到一种利用SSR标记快速、高效鉴定栽培稻地方品种水稻或陆稻生态型的分子方法。
背景技术：
栽培稻是世界上最重要的粮食作物之一，为全球一半以上的人口提供粮食。栽培稻生产消耗的水占全部农业用水的一半以上，我国有超过60%的水田会受到不同程度的干旱危害，因此干旱缺水成为威胁我国粮食安全的重要问题之一。在这样严峻的形势下，节水抗旱稻(water-saving and drought-resistant rice, W)R)的研发就成为了水稻育种工作中重要的方向，它可以为水稻生产的可持续发展和和谐生态社会的建设做出贡献。节水抗旱稻的核心理念，就是将陆稻中普遍存在的抗旱性导入到高产的水稻中，培育出在常规条件下产量高、质量好且能在轻度或中度干旱胁迫条件下仍能保持较高产量和品质的栽培稻品种。因此收集、鉴定、保存和利用水稻、陆稻种质资源是发展和培育节水抗旱稻和维持我国粮食生产可持续发展的关键和保障。水稻(irrigatedrice)和陆稻(upland rice)是亚洲栽培稻中两种最重要的生态型，分别占栽培稻种质面积的55%和12%。其中水稻适应于存在灌溉与蓄水设施的农业生境，具有优质、高产、抗病虫害等特性；而陆稻往往种植于中低产田，并且缺乏灌溉和蓄水条件，因此有耐旱、节水、营养高效等特性。但是水稻和陆稻在表型上难以区分，以往的种质收集与保存工作中往往根据资源采集时的生境简单分类，因此容易造成栽培稻种质资源水、陆生态 型的混淆，给种质资源的利用与研究造成了极大的困扰。因此无论在栽培稻种质资源的收集与利用，以及节水抗旱稻的研发中，都亟需一种可靠和快速的方法对栽培稻地方种的水稻和陆稻生态型进行鉴定。虽然水稻、陆稻没有十分明显的表型差异，但由于水稻和陆稻长期处于不同的农业生境和以及人类差异化的选择作用下，水稻种质和陆稻种质必然会在遗传上产生一定水平的分化，这种分化集中体现在与干旱胁迫相关的基因上。
发明内容
本发明的目的是提供一种可靠和快速的区分鉴定栽培稻中水稻和陆稻种质资源的方法，其采用的方法是利用位于干旱诱导的基因内部的简单重复序列(SSR)分子标记快速区分水稻、陆稻的分子鉴定方法。具体是利用水稻和陆稻群体中多个产生显著遗传分化位点的DNA序列的特异性差异片断，设计扩增引物组合及其衍生物，对偏水稻型等位基因型和陆稻型等位基因型分别进行赋值，并根据这些多位点鉴定值之和来确定水稻和陆稻生态型的方法。为了实现上述的技术目的，本发明提供一种鉴定栽培稻水稻或陆稻种质生态型方法，其包含的步骤有:从水稻植株的组织或器官提取DNA样品，对DNA样品进行聚合酶链(PCR)扩增，对PCR产物进行电泳检测，利用分析软件读取PCR产物片段大小，确定PCR产物的基因型，对PCR基因型进行赋值，计算综合鉴定值，根据综合鉴定值的大小，确定水稻或陆稻的生态型。本发明的优先实施方案是，所述水稻植株的组织或器官包含有水稻的种子、幼苗、成株、莖、叶。本发明的优先实施方案是，所述的聚合酶链(PCR)扩增体系为三引物PCR体系。本发明的优先实施方案是，所述三引物PCR体系中每组引物包含三条序列，所述三条序列包括一对SSR特异性引物和一条M13通用引物。本发明的优先实施方案是，所述一条M13通用引物5’端荧光标记。本发明的优先实施方 案是，所述一对SSR特异性引物中退火温度较高的一条引物5’端连接一段M13序列。本发明的优先实施方案是，所述M13序列为CACGACGTTGTAAAACGAC。本发明的优先实施方案是，所述基因型为5对长度为13_40bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列的
权利要求
1.一种鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，包括如下步骤:从水稻植株的组织或器官提取DNA样品，对DNA样品进行聚合酶链(PCR)扩增，对PCR产物进行电泳检测，利用分析软件读取PCR产物片段大小，确定PCR产物的基因型，对PCR基因型进行赋值，计算综合鉴定值，根据综合鉴定值的大小，确定水稻或陆稻的生态型。
2.根据权利要求1所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述水稻植株的组织或器官包含有水稻的种子、幼苗、成株、茎、叶。
3.根据权利要求1所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述的聚合酶链(PCR)扩增体系为三引物PCR体系。
4.根据权利要求3所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述三引物PCR体系中每组引物包含三条序列，所述三条序列包括一对SSR特异性引物和一条M13通用引物。
5.根据权利要求4所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述一条M13通用引物5’端突光标记。
6.根据权利要求4所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述一对SSR特异性引物中退火温度较高的一条引物5’端连接一段M13序列。
7.根据权利要求6所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述M13序列为CACGACGTTGTAAAACGAC。
8.根据权利要求3所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述的聚合酶链(PCR)扩增体系的反应条件(20uI体系)为 1)10 X Taq 缓冲液(含 25mM MgC12)2 U I 2)IOmM dNTP Mixture0.4u I 3)20 u M 引物 I0.1 4)20iiM 后引物 2 (含 M13 序列)0.04iil 5)20iiM荧光标记M13引物0.16iil 6)Taq DNA PolymeraseIUnit 7)DNA 模板20-30ng 8)ddH20(双蒸水)补足至20 ill。
9.根据权利要求8所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述的聚合酶链(PCR)扩增体系的反应程序(20uI体系)为: 1)94°C预变性5分钟； 2)94 °C变性40秒； 3)退火温度=55-57.5°C，退火时间:30秒； 4)72 °C延伸40秒； 5)循环2)、3)、4)步骤，共34个循环6)72 °C延伸10分钟。
10.根据权利要求1所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述电泳检测为荧光毛细管电泳。
11.根据权利要求1所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述电泳检测为聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
12.根据权利要求1所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述基因型为5对长度为13-40bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列的SSR引物，所述5对SSR引物遗传信息如表I所示:
13.根据权利要求1或12所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，所述5个SSR 位点各不同基因型的水稻、陆稻鉴定值的信息如表2所示:
14.根据权利要求13所述的鉴定水稻和陆稻的方法，其特征在于，综合所述鉴定值的大小，确定水稻或陆稻的生态型的依据如表3所示:
全文摘要
本发明属于生物鉴别与种质资源利用领域，具体涉及一种快速、高效鉴定栽培稻地方种水稻和陆稻生态型的方法,本发明是利用5个在水稻、陆稻生态型间存在较大差异的水稻微卫星(SSR)位点，设计了一种快速、高效鉴定栽培稻水、陆生态型的分子方法。该方法包括样品DNA的提取，三引物体系PCR扩增，电泳检测扩增产物，根据大量实验的结果对不同基因型进行赋值，综合计算5个位点的综合鉴定值并通过鉴定值的大小对栽培稻的水、陆生态型进行判断。该方法准确率高，适用性广，快速便捷，在栽培稻种质收集、鉴定、研究和利用方面有着广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK103146831SQ20131008700
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者夏辉, 陈亮, 杨华, 楼巧君, 罗利军 申请人:上海市农业生物基因中心