专利名称：一种通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种基因打靶载体，特别涉及一种通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体。
背景技术：
转基因动物生产研究在现代家畜育种，动物疾病模型研究及基因功能研究等领域都有重要的意义。自1985年Hammer等用原核注射法生产转基因兔以来，原核注射法一直是生产转基因动物的主要方法，但原核注射法存在只能对胚胎发育早期细胞进行操作，整合效率低，多拷贝随机插入等问题。在原核注射法出现的同时对对胚胎干细胞进行遗传修饰的技术也发展起来，并且生产了一些转基因动物，但大家畜的胚胎干细胞迄今尚未建系。1997年克隆羊多莉的诞生使以体细胞为遗传操作单位的转基因动物生产成为现实。基因工程技术结合核移植技术生产转基因动物方法已经成为生产转基因动物的主要方法，国内外报道用这种方法已经生产了转基因牛，转基因羊等动物。结合核移植技术生产转基因动物中，国内外学者应用了腺病毒载体法，腺病毒相关病毒载体法，慢病毒载体法，普通质粒载体法等一系列的方法对核移植供体细胞进行遗传操作并且已经产生出了多种转基因动物。但由于基因表达调控本身的复杂性以及这些方法介导的外源基因在动物基·因组中整合的随机性，使得外源基因在宿主动物体内的表达水平大多停留在一个较低水平，且个体间表达水平差异很大。基因打靶技术是一种定向改变细胞或生物个体遗传信息的实验手段，通过外源基因与基因组基因同源重组对细胞进行单拷贝基因定位修饰技术，因此可以克服随机整合的问题，自1987年首次报道用基因打靶技术对小鼠ES细胞进行遗传修饰以来，迄今为止用基因打靶方法已经生产了多种转基因动物。基因打靶也称为基因定点同源重组，是指通过外源DNA与染色体DNA同源序列之间的重组来改造基因组特定位点，从而改变生物遗传特性的方法。通过基因打靶可以纠正染色体特定位点上的自发突变，恢复细胞正常的生理功能；也可以把理想突变引入到基因组的某一位点，使之稳定地遗传下去。基因打靶的概念是20世纪70年代初在酵母研究中发展起来的，直到1985年Smithies等才首次报道在肿瘤细胞中实现人工打靶载体和内源β球蛋白基因间的同源重组，1987年Smithies和Capecchi的研究小组在小鼠胚胎干细胞实现了定点剔除，现在基因打靶技术在生命科学的多个领域都有应用。随着基因打靶技术的发展，已经出现了一些新的技术如ZFN技术和TALE技术，科学家利用ZFN技术和TALE技术在基因组特定位点产生双链断裂(DSB)，DSB的产生大大提高了体细胞同源重组的效率。基因打靶技术的关键是打靶载体的构建，已公布的专利申请中有许多基因打靶载体的构建，这些载体大多是通过增加同源臂的长度来提高同源重组的效率，这样势必会减小打靶载体负载外源目的基因的能力。基因打靶载体中的筛选基因和标记基因在筛选整合进细胞的同时一起随同源臂进入基因组中，筛选基因和标记基因的进入必将影响转基因克隆胚胎的发育和转基因动物个体的生理状况，从而影响该技术在生产中应用。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种通用型牛β_酪蛋白位点基因打靶载体，筛选合适长度的同源臂，有利于将感兴趣的目的基因插入到打靶载体的同源臂中间，可用于生产乳腺生物反应器转基因克隆动物。本发明是通过以下技术方案来实现:一种通用型牛酪蛋白位点基因打靶载体，包括5’同源臂和3’同源臂，以牛β -酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700 850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。所述的5’同源臂的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示，3’同源臂的核苷酸序列如如SEQ.1D.N0.2 所示。所述的5’同源臂的下游还连 接有包括剪切拼接位点SA、多克隆位点和两个同向Loxp的序列。所述的5’同源臂的下游连接的序列如SEQ.1D.N0.3所示。所述的多克隆位之间还插入有SV40PolyA序列。所述的两个同向Loxp的序列之间还依次设有以下元件:PTK启动子、抗生素筛选基因、PolyA、CMV启动子、荧光标记基因和SV40PolyA。所述的5’同源臂和3’同源臂构建于PMD19-T载体上，在5’同源臂和3’同源臂之间还依次设有以下元件:剪切拼接位点SA、多克隆位点、SV40PolyA、LoxpU PTK启动子、抗生素筛选基因、PolyA、CMV启动子、荧光标记基因、SV40PolyA和Loxp2。所述的抗生素筛选基因为neo,突光标记基因为EGFP。一种通用型牛β -酪蛋白位点基因打靶载体的构建方法，包括下列步骤:I)以引物Ρ5ΗΑ1、Ρ5ΗΑ2作为引物对，以牛基因组为模板扩增5’同源臂序列，凝胶回收PCR产物；双酶切PCR产物和pMD19-T载体后T4DNA连接酶连接，构建载体ρ5ΗΑ ；2)以引物Ρ3ΗΑ1、Ρ3ΗΑ2作为引物对，以牛基因组为模板扩增3’同源臂序列，凝胶回收PCR产物；双酶切PCR产物和载体ρ5ΗΑ后T4DNA连接酶连接，构建载体pHA ；3)合成如SEQ.1D.N0.3所示的序列，并将该序列克隆到载体pHA中5’同源臂的下游，构建载体PHA-SM ；4)克隆载体pMCIneoployA中的筛选基因neo及其启动子，并双酶切所克隆的序列和载体pHA-SM后T4DNA连接酶连接，构建载体pHA-SMN ；5)克隆载体pEGFP-Cl中的标记基因EGFP及其启动子，并双酶切所克隆的序列和载体pHA-SMN后T4DNA连接酶连接，构建得到载体pTCSN2。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:本发明提供的通用型牛β_酪蛋白位点基因打靶载体及其制备方法，打靶载体中留有酶切位点可以用于将感兴趣的目的基因插入到打靶载体的同源臂中间，其中，通过锌指核酸酶在DNA的特定位点产生缺口，通过同源重组末端接合来实现基因敲除，从而大大提高了基因敲除的效率；然后利用同源重组的方法将目的基因整合到体细胞的靶位点上，在打靶载体筛选基因和标记基因的两端加上Loxp序列便于后续工作中去除筛选基因和标记基因，从而提闻体细胞克隆的效率。
图1是通用型牛β -酪蛋白位点基因打靶载体的构建示意图；图2是5’同源臂和3’同源臂的PCR扩增电泳图谱，泳道1:5’同源臂PCR产物；泳道2:3’同源臂PCR产物；M:Marker。图3是载体p5HA的鉴定电泳图谱；泳道1:p5HA质粒；泳道2:p5HA单酶切(EcoR I )产物;泳道 3:p5HA 双酶切(EcoR I，BamH I )产物;MiMarker0图4是载体pHA的鉴定电泳图谱；泳道1:pHA质粒；泳道2:pHA单酶切(EcoR I )产物;泳道 3:pHA 双酶切(EcoR I ,HindIII)产物;MiMarker0图5是鉴定载体pHA-SM电泳图谱，泳道1:pHA-SM质粒；泳道2:pHA-SM单酶切(Acc III)产物;泳道3:pHA-SM单酶切(Avr II)产物;泳道4:pHA_SM单酶切(Bgl II)产物；泳道5:pHA-SM单酶切(Cla I )产物；泳道6:pHA-SM单酶切(Nhe I )产物；泳道7:pHA-SM单酶切(Xho I )产物；泳道8:pHA-SM单酶切(Mlu I )产物；泳道9:pHA-SM单酶切(Sal I)产物;M:Marker。图6是鉴定载体pHA-SMN电泳图谱，泳道1:pHA-SMN单酶切(Bgl II )产物；泳道2:pHA-SMN 双酶切(Bgl II，Mlu I )产物;MiMarker0图7是鉴定载体pTCSN2电泳图谱，泳道1:pTCSN2单酶切(Acc III)产物；泳道2:pHA-SMN 双酶切(Vsp I ,Mlu I )产物;MiMarker0图8是打靶载体pTCSN2与锌指核酸酶共转染牛胎儿成纤维细胞，A:明场；B:暗场
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图9是G418筛选的阳性克隆PCR鉴定，MiMarker ；1~24泳道:阳性克隆。上游引物设在5’同源臂上游(5’ -TTATGTGGGACAAAGGGGAGA-3’)，下游引物设在3’同源臂下游(5，-CAGGCTCCTCCTCTATGGGATTTT-3’)。图10是验证Loxp序列功能的电泳图谱，MiMarker ;泳道1:未打靶细胞；泳道2:打靶细胞未转染Cre酶；泳道3:打靶细胞转染Cre酶。图11是验证剪切拼接位点(SA)功能，A:载体pEGFP-EI和载体pEGFP_EIS构建说明图；B:牛胎儿成纤维细胞转染pEGFP-EI ；C:牛胎儿成纤维细胞转染pEGFP-EIS。图12是打靶载体pTCSN2的质粒图谱。
具体实施例方式本发明首先构建含有HBD3和绿色荧光蛋白(EGFP)基因的气管上皮细胞特异性表达载体Mucl-EGFP-HBD3，然后用电转染法将外源性表达载体Mucl-EGFP_HBD3导入牛胎儿成纤维细胞，荧光显微镜观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性细胞，经PCR鉴定，证实目的基因HBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；最后，将转染HBD3基因的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚。具体所涉及的试剂和材料如下:G418、DMEM培养基购自美国GIBICO(Invitrogen)公司，EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，胎牛血清购自GIBICO(Invitrogen)公司，细胞培养板和培养皿为丹麦Nunclon公司产品，质粒提取试剂盒购自上海生物工程公司，细胞基因组提取试剂盒购自天根公司，Hot start DNA聚合酶和T4DNA连接酶购自Takara公司，电转染仪(ECM2001)购自美国BTX公司，限制性内切酶购自MBI公司。Opt1-MEM⑧IReduced Serum Media 购自 Invitrogen 公司。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、同源臂序列的确定及其同源重组方案I)以牛酪蛋白位点为整合位点，利用锌指核酸酶在牛酪蛋白位点第二内含子的锌指核酸酶识别处(只有一处识别位点)产生双链断裂(DSB)，在断裂位点上下游各扩增700 SOObp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂，具体的上游扩增5’同源臂745bp，下游扩增3’同源臂789bp。利用同源重组的方法将目的基因整合到体细胞的靶位点CSN2上。锌指核糖核酸酶(ZFN)由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成(一般3 4个),每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时(6 8bp)，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到DNA定点剪切的目的。锌指核酸酶可以在基因序列的特定位点切开一个缺口，激活细胞内的DNA修复机制。通过同源重组，或非同源末端接合来实现高效的基因敲除或插入。传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源重组，其效率非常低，通常为10_6级。而本发明通过锌指核酸酶在DNA的特定位点产生缺口，通过同源重组末端接合来实现基因敲除，从而大大提高了基因敲除的效率。2 )剪切拼接位点(SA)、多克隆位点(MCS )进一步在5’同源臂的下游设计剪切拼接位点(SA)，剪切拼接位点(SA)的插入便于转录后mRNA (同源重组后的mRNA)的正确拼接。多克隆位点(MCS)为稀少的酶切位点，从而便于将不同的目的基因插入到打靶载体中。3)筛选基因及Lxop序列的设计将筛选基因(neo)和标记基因(EGFP)分别插入到5’同源臂和3’同源臂之间，其中，在筛选基因(neo)和标记基因(EGFP)两端加入同向的Loxp序列,插入同向的Loxp序列便于去除筛选基因和标记基因。2、载体构建所用到的载体及试剂I)载体:pMD19_T(TAKARA), pMCIneopolyA(stratagen), pEGFP-Cl(Clontech)2)菌株:DH5Ci (TAKARA)3)试剂:内切酶(NEB公司)，T4DNA连接酶(TAKARA)，质粒小提试剂盒(上海生工)，胶回收试剂盒(上海生工)，LAtaq 酶(TAKARA)，dNTP (TAKARA)，G418(SIGMA 公司)。4)合成如下引物:P5HA1:5’ -GGAATTCCCCAGAATCTAAGACATATC-3’P5HA2:5’ -GGGATCCTGAGATAGTGGATGAACGT-3’P3HA1:5’ -GGTCGACTATGGGACCACAAGTCTGAG-3，
P3HA2:5’ -GAAGCTTTGCCTCTGAATGAACACTAT-3’3、构建过程及方法(如图1所示)I)以引物P5HA1 (引入EcoR I酶切位点)及P5HA2 (引入BamH I酶切位点)为扩增引物，以牛基因组为模板扩增5’同源臂序列，凝胶回收PCR产物(其电泳结果如图2所示)，所扩增的5’同源臂序列的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。EcoR I ,BamH I双酶切PCR产物和pMD19_T载体，0.8%凝胶回收PCR酶切产物和酶切载体PMD19-T，T4DNA连接酶连接PCR酶切产物和酶切载体pMD19_T，4°C过夜，转化大肠杆菌DH5a，鉴定正确连接单克隆，命名载体为p5HA;鉴定结果如图3所示，表明p5HA构建成功。2)以引物P3HA1 (引入Sal I酶切位点)及P3HA2 (引入Hind III酶切位点)作为引物，以牛基因组为模板扩增3’同源臂序列，凝胶回收PCR产物(电泳结果如图2所示)，3’同源臂序列的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示。Sal I ,Hind III双酶切3’同源臂序列PCR产物和载体p5HA，0.8%凝胶回收PCR酶切产物和酶切载体P5HA，T4DNA连接酶连接PCR酶切产物和酶切载体p5HA，4°C过夜，转化大肠杆菌DH5a，鉴定正确连接单克隆，命名载体为pHA ;鉴定结果如图4所示，表明pHA构建成功。3)合成含有剪切拼接位点(SA)和多克隆位点(MCS)的序列，该序列是的核苷酸序列如下所示(即SEQ.1D.N0.3所示，具体可委托南京金斯瑞公司合成):GGATCCTAGGAAAATATTTAATAATGAGTTGACTGTGGGAACTAAAGTGTTTTTTTTTCTCTTTAGTCCGGAGGGCCCCCTAGGTGATCAAGATCTATCGATGGCCGGCCGCTAGCCGTACGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTCGAGATTAATACGCGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGAC ；划线的序列为剪切拼接位点(SA)，其后为多克隆位点(MCS)的序列，这段序列的酶切位点顺序是:Acc III, Apa I，Avr II，Bcl I，Bgl II，Cla I，Fse I，Nhe I，Spl I，Loxpl, Xho I , Vsp I ,Mlu I , Loxp2, Sal I ,序列上除稀少的酶切位点外还有两段34bp的回文序列Loxp，该序列合成后利用BamH I和Sal I位点克隆到载体pHA上，鉴定正确连接单克隆，命名载体为pHA-SM;鉴定结果如图5所示，表明pHA-SM构建成功。其中剪切拼接位点SA保证转录后同源重组mRNA的正确剪切和拼接。而多克隆位点(MCS)将所感兴趣的目的基因定点插入到打靶载体中。回文序列Loxp包括同向的Loxp回文序列Loxpl和Loxp2,在Cre酶的作用下,Loxpl和Loxp2之间发生位点特异性重组,可以有效切除Loxpl和Loxp2之间的序列进一步，在MCS之后还设置SV40PL0YA序列(其序列如SEQ.1D.N0.4所示)，在合成其序列后(可由南京金斯瑞公司合成)直接插入到MCS的Spl I位点，其作用是终止插入在MCS中的目的基因的转录。4)利用Xho 1、Sal I双酶切载体pMCIneoployA得到抗生素筛选基因(neo),凝胶回收(neo)基因，同时用Xho I酶切载体pHA-SM并且0.8%凝胶回收骨架载体，T4DNA连接酶连接neo基因和胶回收酶切骨架载体pHA-SM，4°C过夜，转化大肠杆菌DH5 α，鉴定正确连接单克隆(见图6，其中 neo基因插入到载体pHA-SM中Loxpl下游Xho I酶切位点处)，命名载体为pHA-SMN。需要说明的是PTK是neo的启动子，和neo基因一起从载体pMCIneoployA中剪切下来的，用于启动neo基因的表达。5)在pHA-SMN载体的Loxp2的上游插入EGFPVsp 1、Mlu I双酶切载体pEGFP-Cl得到荧光标记基因EGFP，胶回收EGFP基因，同时用相同的酶酶切载体pHA-SMN并且0.8%凝胶回收骨架载体片段，T4DNA连接酶连接标记基因(EGFP)和胶回收酶切骨架载体pHA-SMN，4°C过夜，转化大肠杆菌DH5 α，鉴定正确连接单克隆(鉴定结果见图7)，命名载体为pTCSN2。4、载体的转染及验证I)将载体PTCSN2与锌指核酸酶表达载体(购自西格玛公司)共转染牛胎儿成纤维细胞，具体的采用电穿孔的方法共转染牛胎儿成纤维细胞。锌指核酸酶表达载体表达的锌指核酸酶在牛胎儿成纤维细胞基因组CSN2位点产生双链断裂，促进打靶载体PTCSN2与基因组发生同源重组。2)成功转染的细胞 表达绿色荧光蛋白(表达结果如图8所示)，转染的细胞在药物G418 (600 μ g/ml)的作用下可以筛选出稳定转染的阳性克隆细胞。转染48小时后在荧光显微镜下镜检，转染打靶载体的细胞可以观察到绿色荧光蛋白的表达。稳定转染打靶载体的细胞由于表达了新霉素抗性基因neo，对G418有抗性。而没有稳定转染打靶载体的细胞在600 μ g/ml的作用下会死亡，因此可以利用G418筛选出稳定转染的阳性克隆细胞。3)利用同源臂外侧PCR的方法可以鉴定出发生同源重组的阳性克隆细胞，阳性克隆鉴定结果如图9所示。在同源臂外侧PCR检测中:上游引物(5’ -TTATGTGGGACAAAGGGGAGA-3’)设在5’同源臂上游，下游引物设在3’同源臂下游(5 ’ -CAGGCTCCTCCTCTATGGGATTTT-3，)。发生同源重组的细胞克隆可以扩增出1900bp和5700bp两条带，1900bp为野生型的等位基因，5700bp为敲入外源基因的等位基因(结果如图9所示)。4)将纯化的Cre酶蛋白转染发生同源重组的阳性克隆细胞中验证Loxp序列的功倉泛将纯化的Cre酶蛋白加到细胞培养液中，浓度150ng/ml，培养72小时；72小时后提取转染Cre酶的阳性克隆细胞和未转染Cre酶的阳性克隆细胞的基因组，设计引物扩增Loxp之间的序列:上游引物 P1: 5 ’ -GCCCAGTCATAGCCGAATAGC-3 ’，下游引物P2:5，-TTTAGTTCCCACAGTCAACTCA-3 ’比较如图10所示的两组的凝胶电泳图谱，发现转染Cre酶的阳性克隆细胞扩增出来的2600bp片段明显比未转染Cre酶的弱,说明Loxp序列在与Cre酶蛋白作用后,能够在打靶成功后的基因组中去除筛选和标记基因。5)将打靶载体pTCSN2中5’同源臂序列上的CSN2第二外显子翻译起始位点ATG至第二内含子中锌指核酸酶识别切割位点的序列克隆并插入到载体pEGFP-Nl(购自CL0NTECH公司)多克隆位点，构建载体pEGFP-ΕΙ (见图11)，将打靶载体中5’同源臂序列上的CSN2第二外显子翻译起始位点ATG至剪切拼接位点(SA)的序列克隆并插入到载体pEGFP-Nl多克隆位点，构建载体pEGFP-EIS (见图12)，其中CSN2第二外显子翻译起始位点ATG位于5’同源臂第514个碱基处。
分别将载体pEGFP-EI和载体pEGFP_EIS分别转染牛胎儿成纤维细胞(见图11)，转染pEGFP-EI的细胞无绿色荧光蛋白表达，而转染pEGFP-EIS的细胞有绿色荧光蛋白表达，说明剪切拼接位点(SA)有功能，能够使插入打靶载体PTCSN2多克隆位点的目的基因完成转录后的正确剪 切拼接，从而表达表达出需要的目的蛋白。
权利要求
1.一种通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体，其特征在于，包括5’同源臂和3’同源臂，以牛β -酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700 850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。
2.如权利要求1所述的通用型牛β_酪蛋白位点基因打靶载体，其特征在于，所述的5’同源臂的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示。
3.如权利要求1所述的通用型牛β_酪蛋白位点基因打靶载体，其特征在于，所述的5’同源臂的下游还连接有包括剪切拼接位点SA、多克隆位点和两个同向Loxp的序列。·
4.如权利要求3所述的通用型牛β_酪蛋白位点基因打靶载体，其特征在于，所述的5’同源臂的下游连接的序列如SEQ.1D.N0.3所示。
5.如权利要求3所述的通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体，其特征在于，所述的多克隆位之间还插入有SV40PolyA序列。
6.如权利要求3所述的通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体，其特征在于，所述的两个同向Loxp的序列之间还依次设有以下元件:ΡΤΚ启动子、抗生素筛选基因、PolyA、CMV启动子、荧光标记基因和SV40PolyA。
7.如权利要求1所述的通用型牛β_酪蛋白位点基因打靶载体，其特征在于，所述的5’同源臂和3’同源臂构建于PMD19-T载体上，在5’同源臂和3’同源臂之间还依次设有以下元件:剪切拼接位点SA、多克隆位点、SV40PolyA、LoXpl、PTK启动子、抗生素筛选基因、PolyA, CMV启动子、荧光标记基因、SV40PolyA和Loxp2。
8.如权利要求6或7所述的通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体，其特征在于，所述的抗生素筛选基因为neo,突光标记基因为EGFP。
9.一种通用型牛β_酪蛋白位点基因打靶载体的构建方法，其特征在于，包括下列步骤: 1)以引物Ρ5ΗΑ1、Ρ5ΗΑ2作为引物对，以牛基因组为模板扩增5’同源臂序列，凝胶回收PCR产物；双酶切PCR产物和pMD19-T载体后T4DNA连接酶连接，构建载体ρ5ΗΑ ； 2)以引物Ρ3ΗΑ1、Ρ3ΗΑ2作为引物对，以牛基因组为模板扩增3’同源臂序列，凝胶回收PCR产物；双酶切PCR产物和载体ρ5ΗΑ后T4DNA连接酶连接，构建载体pHA ； 3)合成如SEQ.1D.N0.3所示的序列，并将该序列克隆到载体pHA中5’同源臂的下游，构建载体PHA-SM ； 4)克隆载体pMCIneoployA中的筛选基因neo及其启动子，并双酶切所克隆的序列和载体pHA-SM后T4DNA连接酶连接，构建载体ρΗΑ-SMN ； 5)克隆载体pEGFP-Cl中的标记基因EGFP及其启动子，并双酶切所克隆的序列和载体ρΗΑ-SMN后T4DNA连接酶连接，构建得到载体pTCSN2。
全文摘要
本发明公开了一种通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体及其构建方法。所构建的载体包括5’同源臂和3’同源臂，以牛β-酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700～850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。本发明通过锌指核酸酶在DNA的特定位点产生缺口，通过同源重组末端接合来实现基因敲除，从而大大提高了基因敲除的效率；然后利用同源重组的方法将目的基因整合到体细胞的靶位点上，在打靶载体筛选基因和标记基因的两端加上Loxp序列便于后续工作中去除筛选基因和标记基因，从而提高体细胞克隆的效率。
文档编号C12N15/65GK103160534SQ20131010021
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者刘旭, 张涌, 郭文江, 华松 申请人:西北农林科技大学, 杨凌科元克隆股份有限公司