专利名称：真菌固体发酵法的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，提供了一种用于真菌发酵培养，尤其是固体发酵培养的培养基，以及对真菌的发酵工艺进行了优化。
背景技术：
固体发酵(solid-state fermentation, SSF)是在指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度固态基质中，用一种或多种微生物进行的一个生物反应过程(Singhaniaet al., 2009)。从生物反应过程的角度考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程，更为具体的，我们可以认为固体发酵是一种在培养基为固体微粒的情况下进行利用的一种发酵手段(Mitchell et al.，2000b)。固体发酵与液体发酵相比有许多显著的优点:培养基更为便宜、低能耗、投入成本低、更容易控制发酵体积、产生的废水较少(Pandey Aet al., 2000; Pandey A et al.，2008)。以培养基的用料为例，用于固体发酵的培养基比较单纯，一般来说，例如谷物类、小麦麸、小麦草、大宗谷物或农产品等均可被使用，所以发酵原料成本较经济。对于大多数的微生物而言，其生长的环境并没有大量的自由水存在。即便是海洋中的微生物，其中有超过98%的种类是生长于水下表层的固体介质中的，对于真菌而言，所有已知的真菌中只有不到1%的种类是在海洋中发现的(Carlile & Watkinson, 1994;Kelecom, 2002)。也正是因为如此，固体发酵能够较好地模拟真菌的生长环境，从而适用于真菌的生物发酵。到目前为止，有许多人研究了影响固体发酵进程的生物化学和工程学的因素(Mitchell et al., 2000a, 2000b; Pandey, 2003)，但是 SSF 中的许多技术问题仍然没有得到解决(H01ker et al.，2004)。即便如此，SSF在生物技术中的运用已经很广泛了(Raimbault, 1998; Pandey et al., 2000, 2001)。在许多综述中可以查到运用SSF技术生产的一些生物 产品或代谢物，如次级代谢产物(Balakrishnan & Pandey,1996; Robinson et al., 2001)、黄曲霉素(Barrios-Gonzalez & Tomasini, 1996)、工程酶(Pandey et al., 1999)、细菌酶(Babu & Satyanarayana, 1996)、淀粉糖化酶(Selvakumar et al., 1998)、纤维素酶(Cen & Xia, 1999)、中国食品(Han et al.,2001)、木质素的生物转化(Tengerdy & Szakacs, 2003)、食用菌种植和天然香料的生产(Wang, 1999)、富蛋白食物(Nigam & Singh, 1996)等。关于固体发酵工艺的优化，一般情况下，都会从温度、培养基、初始pH、含水量、接种量、种龄、发酵时间等角度考虑，而关于培养基，更是涉及了碳源、氮源和无机盐的选择(Davood Mazaheri et al., 2012; Tamires Carvalho dos Santos et al., 2012;Madhuri Narra et al., 2012; Fatma Chaari et al., 2012)。以含水量为例，在蛋白酶和脂肪酶的生产中，高含水量会降低培养基质的多孔性，从而妨碍气体的交换，而低含水量则会减少微生物的生长，从而使酶的产量下降(Mahanta et al.，2008)。再以发酵时间(发酵进程)对固体发酵的影响为例，Biazus等人在采用玉米麦芽糖进行研究的时候发现，发酵开始时，产物的量很低，而随后产物的量就迅速上升直到达到最大值，在达到最大产物量后，产物的生成就受到了抑制，并且产物的活性也会下降(Biazus et al.，2006)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种真菌固体发酵法，采用该真菌固体发酵法能够快速有效地得到产气霉属真菌固体发酵的产物。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种真菌固体发酵法，将真菌按照0.1~0.3% (质量％)的接种量接种至真菌固体发酵培养基上，在黑暗中于23 28°C的发酵温度下发酵5 10天；真菌固体发酵培养基由以下成分组成:熟小米100g、珍珠岩19 21g和营养液24 26ml ；熟小米的制备方法为:在IOOg生小米中加入55飞5ml 土豆汁，用灭菌锅于12(Tl22°C加热1Γ16分钟，得熟小米；营养液的制备方法为:将葡萄糖0.5 3g、脱脂大豆粉5 7g,蛋白胨(peptone)I 5g，磷酸二氢钾0.3 0.55g，硫酸镁0.15g，用25 50ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液(呈糊状)。作为本发明的真菌固体发酵法的改进:将真菌按照0.2^0.3% (质量％)的接种量接种至真菌固体发酵培养基上，在黑暗中于24 26°C的发酵温度下发酵5 8天；真菌固体发酵培养基由以下成分组成:熟小米100g、珍珠岩20g和营养液25ml ；熟小米的制备方法为:在IOOg生小米中加入60ml 土豆汁，用灭菌锅于121°C加热15分钟，得熟小米；营养液的制备方法为:将葡萄糖0.5g，脱脂大豆粉7g，蛋白胨1.0g,磷酸二氢钾0.55g，硫酸镁0.15g，用25ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液。作为本发明的真菌固体发酵法的进一步改进:营养液的制备方法中用浓度为
4.8 5.2mol/L (较佳为5 mol/L)的NaOH溶液调节pH。作为本发明的真菌固体发酵法的进一步改进:真菌为产气霉属真菌。具体而言:真菌为植物内生真菌。例如可选用保藏号为CGMCC 2864的内生真菌Muscodor sp.ZJLQ070。作为本发明的真菌固体发酵法的进一步改进:接种量为0.2^0.3%，发酵温度为25°C，发酵时间为5 8天。作为本发明的真菌固体发酵法的进一步改进:用于接种的Z几Q070菌株的种龄为6天。在本发明中，土豆汁采用常规方法制备而得，即，土豆汁的制备方法为:将200g新鲜去皮土豆切块，用90(T990 ml的水煮沸30min后用4层纱布过滤，滤液自然冷却至室温后用蒸懼水定容至IL备用，pH为自然pH。本发明的真菌固体发酵培养基的制备方法为:将营养液、熟小米和珍珠岩均匀搅拌后，于121°C高压(1.05 X IO5Pa)灭菌锅灭菌20分钟后备用。在本发明中:用于制备真菌固体发酵培养基的各项成分可通过市购的方式获得，例如，脱脂大豆粉可购自河北省秦皇岛金海食品工业有限公司生产的食品级的低温脱脂大豆粉；蛋白胨可购自生工公司生产的PN5247型号的P印tone。本发明包括优化培养基，温度，种龄和接种量。本发明采用正交设计和单因素实验设计，分别从培养基配方、培养基营养液pH、发酵温度、接种量、种龄这五个方面全面探索了ZJLQ070菌株的固体发酵工艺。此外，本发明采用DNS法、钥酸铵比色法、中性甲醛法、质量差法测定了固体发酵过程中相关生物量参数(浸出液中的还原糖、总糖、溶磷和氨基氮及氨氮，质量损失率，含水量)在不同发酵时间的水平，最终得到了这些相关生物量参数随发酵进程进行改变的发酵曲线。通过对发酵曲线的综合分析推测在摇瓶小量固体发酵时，菌株的对数生长期开始于发酵起始后的第5-6天，结束于发酵起始后的第8天。本发明中涉及的真菌，尤其是植物内生真菌，是定殖于健康植物组织中并不表现出病害症状的一类真菌，这些内生真菌从分类上来讲，主要是一些子囊菌，也有一些是担子菌和卵菌。它们能与植物建立起互利共生的互作关系。这种共生互作为寄主植物带来的好处是使植物增加了对病原微生物的抵抗能力，促进了植物的生长和对逆境的忍受能力。本发明中涉及的产气霉属Muscodor内生真菌，已知分布于中美洲、南美洲、东亚、东南亚和澳大利亚的热带、亚热带植物中。它们的一个重要特征就是能够产生易挥发的有机化合物(volatile organic compounds, VOCs),这些VOCs能够抑制甚至杀死许多的植物病原菌、线虫甚至昆虫和一些与人类疾病有关的病原菌。真菌例如选用保藏号为CGMCC 2864的内生真菌Muscodor sp.ZJLQ070。备注说明:ZJLQ070在专利2009 10153511.6有告知,保藏号为CGMCC2864。本发明具有如下优点:1、首次尝试产气霉属真菌的固体发酵，开创先例；2、能够快速有效地得到产气霉属真菌固体发酵的产物。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1:不同生小米与土豆汁比例下的固体发酵情况。A:生小米:土豆汁=1:0.75、营养液土豆汁用量为50%，培养基有明显的结块；B:生小米:土豆汁=1:0.50、营养液土豆汁用量为25%，无法观测到菌体的生长；C:生小米:土豆汁=1:0.60、营养液土豆汁用量为25%，菌体生长且体系松散不结块；D:生小米:土豆汁=1:0.60、营养液土豆汁用量为25%，可见到分布均匀的白色菌丝(B卩，D是C的放大图)。图2:发酵10天时发酵体系的质量损失率(％)与营养液初始pH的关系。图3:发酵10天时发酵体系的质量损失率(％)与种龄的关系。图4:25°C下ZJLQ070菌株在PDA平皿上的生长速率。图5:发酵10天时发酵体系的质量损失率(％)与接种量的关系。图6:发酵10天时发酵体系的质量损失率(％)与发酵温度的关系。图7:发酵产物浸出液中还原糖的含量与发酵时间的关系。图8:发酵产物浸出液中总糖的含量与发酵时间的关系。图9:发酵产物浸出液中溶磷的含量与发酵时间的关系。
图10:发酵产物浸出液中氨氮的含量与发酵时间的关系。图11:发酵体系中的含水量与发酵时间的关系。图12:发酵体系的质量损失率与发酵时间的关系。图13:ZJLQ070菌株固体发酵曲线。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。实施例1:固体发酵培养基含水量的确定在固体发酵中，培养基的含水量将影响微生物的生长，含水量过高，将在培养过程中形成结块，从而影响发酵的进行。本实施例中，通过改变熟小米的制备中，生小米与土豆汁之间的料水比以及营养液中土豆汁的用量来改变培养基的含水量。按照上述设计理论，在进行了大量初步选择培养基的基础上，选用了以下三个培养基配方进行试验，从而确定培养基中较优含水量。配方一的固体发酵培养基由以下成分组成:熟小米100g，珍珠岩20g，营养液25ml ο制备过程如下:I)、熟小米制备:100g生小米中加入75ml 土豆汁，用灭菌锅于121°C加热15分钟，得熟小米。2)、营养液制备:将葡萄糖3.0g,低温脱脂大豆粉5.0g,蛋白胨(peptone) 5.0g,磷酸二氢钾0.3g,硫酸镁0.15g，用50ml的土豆汁溶解后再用浓度为5mol/L的NaOH溶液调节pH至6，得营养液(糊状)。3)、将25ml营养液与IOOg熟小米和20g珍珠岩混拌在一起，121 °C高压(1.05*105Pa)灭菌锅灭菌20分钟后备用。备注说明:按照上述配方一所得的培养基，灭菌前(即，步骤3)中营养液、熟小米和珍珠岩混拌后)的理论含水量约为54.62%。配方二的固体发酵培养基由以下成分组成:熟小米100g，珍珠岩20g，营养液25ml ο制备过程如下:I)、熟小米制备:100g生小米中加入50ml 土豆汁，用灭菌锅于121°C加热15分钟，得熟小米。2)、营养液制备:将葡萄糖3.0g,低温脱脂大豆粉5.0g,蛋白胨(peptone) 5.0g,磷酸二氢钾0.3g,硫酸镁0.15g，用25ml 土豆汁溶解后再用浓度为5mol/L的NaOH溶液调节pH至6，得营养液(糊状)。3)、将25ml营养液与IOOg熟小米和20g珍珠岩混拌在一起，121 °C高压(1.05*105Pa)灭菌锅灭菌20分钟后备用。备注说明:按照上述配方二所得的培养基，灭菌前(即，步骤3)中营养液、熟小米和珍珠岩混拌后)的理论含水量约为 28.35%。
配方三的固体发酵培养基由以下成分组成:熟小米100g，珍珠岩20g，营养液25ml。制备过程如下:I)、熟小米制备:100g生小米中加入60ml 土豆汁，用灭菌锅于121°C加热15分钟，得熟小米。2)、营养液制备:将葡萄糖3.0g,低温脱脂大豆粉5.0g,蛋白胨(peptone) 5.0g,磷酸二氢钾0.3g,硫酸镁0.15g，用25ml 土豆汁溶解后再用浓度为5mol/L的NaOH溶液调节pH至6，得营养液(糊状)。3)、将25ml营养液与IOOg熟小米和20g珍珠岩混拌在一起，121 °C高压(1.05*105Pa)灭菌锅灭菌20分钟后备用。备注说明:按照上述配方三所得的培养基，灭菌前(即，步骤3)中营养液、熟小米和珍珠岩混拌后)的理论含水量约为40.64%。分别用配方一、配方二和配方三所得的培养基进行固体发酵，即将内生真菌Muscodor sp.ZJLQ070以接种量0.2% (质量％)于25°C下黑暗培养发酵，发酵时间10天，定期(每隔24小时)观察固体发酵体系中真菌的生长状况:实验结果如图1所示:当用配方 一所得的培养基时，即当生小米与土豆汁的料水比为1:0.75、营养液土豆汁用量为50% (灭菌 前理论含水量为54.62%)时，发酵7天时，ZJLQ070生长旺盛，且培养基有明显的结块，并且结块不易消除(图1A)；当用配方二所得的培养基时，即料水比仅为1:0.5、营养液土豆汁用量为25% (灭菌前理论含水量为28.35%)时，ZJLQ070将难以生长，在发酵体系中无法观测到菌体的生长(图 1B)；当用配方三所得的培养基时，即在料水比为1:0.6、营养液土豆汁用量为25% (灭菌前理论含水量为40.64%)时，有较好的发酵结果，在发酵7天时，能够见到明显的菌体生长，且培养体系松散不结块(图1C)，仔细观看，可见到培养基中分布均匀的白色菌丝(图1D)。因此，适用于ZJLQ070菌株固体发酵的料水比为生小米:土豆汁=1:0.60，即配方三，此时的灭菌前理论含水量为40.64%。实施例2:固体发酵培养基配方的优化采用的培养基为确定了含水量的固体发酵培养基，其配方如实施例1中配方三。培养基的优化采用正交设计，如表I所示，以葡萄糖的用量为因素一，蛋白胨的用量为因素二，低温脱脂大豆粉的用量为因素三，磷酸二氢钾的用量为因素四，进行4因素3水平的正交设计。因素与水平、以及正交设计表如下表2:表1:4因素3水平的正交设计表(单位:克):
权利要求
1.真菌固体发酵法，其特征是:将真菌按照0.Γ0.3% (质量％)的接种量接种至真菌固体发酵培养基上，在黑暗中于23 28°C的发酵温度下发酵5 10天； 所述真菌固体发酵培养基由以下成分组成:熟小米100g、珍珠岩19 21g和营养液24 26ml ； 所述熟小米的制备方法为:在IOOg生小米中加入55飞5ml 土豆汁，用灭菌锅于12(Tl22°C加热1 Γ16分钟，得熟小米； 所述营养液的制备方法为:将葡萄糖0.5 3g、脱脂大豆粉5 7g，蛋白胨f5g，磷酸二氢钾0.3^0.55g，硫酸镁0.15g，用25 50ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液。
2.根据权利要求1所述的真菌固体发酵法，其特征是: 将真菌按照0.2^0.3% (质量％)的接种量接种至真菌固体发酵培养基上，在黑暗中于24 26°C的发酵温度下发酵5 8天； 所述真菌固体发酵培养基由以下成分组成:熟小米100g、珍珠岩20g和营养液25ml ； 所述熟小米的制备方法为:在IOOg生小米中加入60ml 土豆汁，用灭菌锅于121°C加热15分钟，得熟小米； 所述营养液的制备方法为:将葡萄糖0.5g，脱脂大豆粉7g，蛋白胨1.0g,磷酸二氢钾0.55g，硫酸镁0.15g，用25ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液。
3.根据权利要求1或2所述的真菌固体发酵法，其特征是:所述营养液的制备方法中用浓度为4.8 5.2mol/L的NaOH溶液调节pH。
4.根据权利要求3所述的真菌固体发酵法，其特征是:所述真菌为产气霉属真菌。
5.根据权利要求4所述的真菌固体发酵法，其特征是:接种量为0.2^0.3%，发酵温度为25 °C，发酵时间为5 8天。
6.根据权利要求5所述的真菌固体发酵法，其特征是:用于接种的Z几Q070菌株的种龄为6天。
全文摘要
本发明属于微生物发酵领域。具体而言，本发明公开了一种真菌固体发酵法，将真菌按照0.1~0.3%的接种量接种至真菌固体发酵培养基上，在黑暗中于23~28℃的发酵温度下发酵5~10天；真菌固体发酵培养基由以下成分组成熟小米100g、珍珠岩19~21g和营养液24~26ml；熟小米的制备方法为在100g生小米中加入55~65ml土豆汁，用灭菌锅于120~122℃加热14~16分钟，得熟小米；营养液的制备方法为将葡萄糖、脱脂大豆粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁用25~50ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液。采用本发明的方法能够快速有效地得到产气霉属真菌固体发酵的产物。
文档编号C12P1/02GK103215313SQ201310111048
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月31日 优先权日2013年3月31日
发明者林福呈, 刘诚, 章初龙, 冯晓晓 申请人:浙江大学