单管荧光PCR技术检测GJB2基因235delC突变的方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种利用荧光定量PCR技术检测耳聋基因GJB2235delC突变位点的方法及试剂盒。针对GJB2235delC突变位点，设计特异性突变型探针和野生型探针并分别标记不同颜色的荧光，在突变位点两侧设计扩增引物。对一个待测样本用含野生型探针、突变型探针及扩增引物的PCR反应体系进行扩增，通过与质控品比较荧光曲线模式分析样本的基因型，判断样本是否存在GJB2235delC突变。本发明能为耳聋患者的病因诊断提供有价值的临床参考，也能筛查新生儿、孕期夫妇是否为携带者，为耳聋的产前诊断、新生儿先天耳聋病因诊断提供帮助。本试剂盒具有闭管高通量自动化操作及分析的特点，尤其适合临床实验室使用。
【专利说明】单管荧光PCR技术检测GJB2基因235de IC突变的方法及其 试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测【技术领域】，特别涉及一种探针特异性的实时定量PCR技术检 测耳聋相关基因GJB2 235delC突变的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 耳聋发病率高，目前证实约60%的耳聋由遗传因素引起，由遗传因素引起的耳聋， 30%的患者属于综合征型耳聋6!11)，70%的患者属于非综合征型耳聋（呢!11)。呢!11中 常染色体隐性遗传占75% -80%，即患儿双亲听力正常，但均是致病基因突变的肯定携带 者，多散发存在，目前认为约50%的常染色体隐性遗传性NSHI由GJB2基因突变引起，且不 同种族、地区的人群存在不同的热点致病位点，对于我国，日本，韩国等亚洲人群，235delC 突变位点是GJB2基因的主要致病突变位点，我国的研究资料证实，20-30%的耳聋由GJB2 235delC突变引起，正常听力人群中GJB2 235delC突变的携带者频率为2-3%。因此，临床 上检测GJB2 235delC突变可以明确耳聋病因，进而指导临床；尤其是和新生儿期听力筛查 的同步检测，可以提高新生期耳聋的检出率，提高出生缺陷的三级预防；对孕期/孕前夫妇 进行GJB2 235delC突变检测可以筛查出携带者，进而指导产前诊断，降低耳聋发生率，提 高出生缺陷的二级预防。
[0003] 目前进行基因突变检测的方法有数十种。金标准法为PCR产物直接测序法。PCR 产物直接测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备 和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。基因芯片法具有快速高通量的 优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段长度多态性（RFLP) 检测基因突变的方法具有成本低廉的优点，但是过程烦琐，时间长也不适合普及。公开的 专利（专利号200810222745. 7)采用了等位基因特异PCR技术，在一个PCR反应体系中使 用了 4条引物，对于多位点检测有优势，但是该方法在PCR反应结束后需要后续的凝胶电 泳分析结果，具有开放式操作，凝胶电泳污染环境等缺点，不适合临床推广。相关的专利 201010536373. 2采用引物特异荧光定量PCR扩增法，针对GJB2基因235突变位点设计野 生型引物和突变型引物，对一个待测样本分别用含野生型引物的荧光PCR体系和突变型引 物的荧光PCR体系进行检测，通过比较两次反应的Ct值和两者的差值（ACt)大小，判断样 品是否存在GJB2 235delC突变。该方法具有时间短、高通量、闭管自动化操作、结果分析简 单的优点，适合临床实验室使用，但是存在检测单个位点突变需要2个PCR反应管实现的缺 点。
[0004] 本方法采用一种采用实时荧光聚合酶链反应技术（FQ-PCR)检测GJB2基因 233-235位点C缺失（235delC)突变方法，针对GJB2基因第235位点碱基缺失处设计特异 性野生型探针及突变型探针，野生型及突变型探针分别被标记上不同颜色的荧光，同时在 GJB2基因第235位点碱基两侧翼序列区设计特异性扩增引物，对于检测样本，依据野生型 与突变型探针在PCR扩增中产生的荧光颜色不同来判断样本是否存在突变。该方法具有时 间短、高通量、闭管自动化操作、结果分析简单，检测单个位点突变需要1个PCR反应管实现 的优点。适合临床实验室使用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种GJB2基因235delC突变的实时荧光定量PCR检测方 法和试剂盒，可用于临床样本的检测。
[0006] 本发明的具体技术路线为：
[0007] 1)GJB2基因（SEQ ID NO :5)第205-265nt区域设计野生型探针及突变型探针，优 选地，在GJB2基因第215-255nt区域进行探针设计，其长度均为10-30bp之间的核苷酸序 列。两种探针均覆盖GJB2基因233-235nt区域，其中野生型探针（SEQ ID NO :3)针对GJB2 基因235野生型位点，突变型探针（SEQ ID NO :4)针对GJB2基因235delC突变位点。
[0008] 2)探针5'端标记荧光发生基团FAM或HEX等类似发光基团，3'端标记荧光淬灭 基团TAMRA或BHQ1等类似淬灭基团。探针序列并不局限于本说明书中的具体核苷酸序列， 可以是覆盖GJB2基因235位点的任意一段符合探针要求的核苷酸序列。探针5'端标记的 荧光发生基团及其相应的3'端荧光淬灭基团可以是目前本领域中任何可用的荧光基团，如 FAM，HEX可以由其他荧光基团或染料代替，如VIC，JOE，CY5等。可以使用目前常用的Taqman 探针，也可以是在普通Taqman探针基础上经过修饰的LNA-Taqman探针，MGB-Taqman探针 或现有技术能够在Taqman探针基础上改良修饰的相关探针。
[0009] 3)GJB2基因第235nt区域上游设计正向扩增引物，在下游设计反向扩增引物，其 长度均为l〇_3〇bp之间的核苷酸序列，能够扩增出含有GJB2基因233-235nt区域的长度为 50-700bp的核苷酸片段，优选地，正向引物（SEQ ID N0:1)及反向引物（SEQ ID N0:2)为 能扩增出含有GJB2基因233-235nt区域60-150bp片段的特异性核苷酸序列。
[0010] 4)配制适宜于PCR扩增的反应体系。核酸扩增反应体系包括：耐热DNA聚合酶、 dNTP、UNG酶、含有Mg离子的缓冲液，正向引物（SEQ ID N0:1)，反向引物（SEQ ID N0:2)， 野生型探针（SEQ ID NO :3)，突变型探针（SEQ ID NO :4)。
[0011] 5)从待测样本中提取DNA，加入反应体系，进行荧光定量PCR反应。
[0012] 6)依据野生型、突变型探针标记的不同颜色显示确定样本的基因型。只有野生型 探针的颜色显示时，样本为野生型，反之为突变型，如果两种颜色都存在，则样本为杂合型。
[0013] 本发明提供的GJB2基因235delC突变检测试剂盒主要包括以下组分：PCR反应 液，阴性质控品，阳性质控品，DNA裂解液，红细胞裂解液和分隔并集中包装这些试剂瓶或管 的包装盒。
[0014] 本发明依据下述原理来实现，为了检测GJB2基因（SEQ ID NO :5)235delC突变， 设计覆盖235位点的突变型探针与野生型探针，野生型探针只能与野生型样本模板完全匹 配，突变型探针只能与突变型样本模板完全匹配，由于突变型探针与野生型探针5'端标记 的荧光报告基团不同，即二者发射波长不同的荧光，在荧光PCR仪上被分别记录并在分析 软件中以不同颜色或不同的标记反映出来。
[0015] 根据本发明的一个优选的实施方案，试剂盒中PCR反应液含有1XPCR Buffer、 dNTPs、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向引物（SEQ ID N0:1)，反向引物（SEQ ID N0:2)，野生型 探针（SEQ ID NO :3)，突变型探针（SEQ ID NO :4)。
[0016] 正向引物（SEQ ID NO :1) :5' -CAAGAACGTGTGCTACGATC-3，
[0017] 反向引物（SEQ ID NO :2) :5' -TTCCTCTTCTTCTCATGTCT-3'
[0018] 野生型荧光探针（SEQ ID NO :3) :5' FAM-GCTATGGGCCCTGCAGCTGA-TAMRA3，
[0019] 突变型荧光探针（SEQ ID NO :4) :5' HEX-GCTATGGGCCTGCAGCTGA-TAMRA3，
[0020] 根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中也可以仅加入突变型探针，当模板是 突变型时，则最终可检测到突变型探针发射出的荧光，因而确定样本含有突变位点，当模板 是野生型时，则最终不能检测到突变型探针发射出的荧光，因而确定样本不含有突变位点。 理论上，一个体系中可以仅加入突变型探针，但是当同时加入野生型探针时，可以起到反向 校正的双保险作用，使结果更加准确可靠。仅加入突变型探针的试剂盒中PCR反应液含有 1XPCR Buffer、dNTPs、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向引物（SEQIDN0:l)，反向引物（SEQID NO :2)，突变型探针（SEQ ID NO :4)。
[0021] 正向引物（SEQ ID NO :1) :5' -CAAGAACGTGTGCTACGATC-3，
[0022] 反向引物（SEQ ID NO :2) :5' -TTCCTCTTCTTCTCATGTCT-3'
[0023] 突变型荧光探针（SEQ ID NO :4) :5' HEX-GCTATGGGCCTGCAGCTGA-TAMRA3，
[0024] 根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的阳性质控品为经过测序检验结果为 GJB2 235位点突变纯合型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或相应的PCR产物或质粒载 体；阴性质控品为蒸馏水、纯水、生理盐水或鲑鱼精子DNA，也可以为经过测序检验结果为 GJB2 235位点野生纯合型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或相应的PCR产物或相应的质 粒载体；
[0025] 根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中待检测靶核酸样品来自从各种途径获 取的被检测者的血液、唾液、羊水细胞或其它人体组织等等。
[0026] 根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的DNA提取液主要包含Chelex-100。 也可以使用其它试剂盒或方法提取的DNA作为进行荧光PCR的模板。
[0027] 根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中用于判定检测方法有效性的标准是： 每次检测都使用PCR反应液分别检测阳性质控品和阴性质控品，对于阳性质控品，依据突 变型探针产生的颜色荧光曲线作为阳性质量控制标准，阳性质控品的Ct值应小于30。对于 以经过测序检验结果为GJB2 235位点野生纯合型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或相 应的PCR产物或相应的质粒载体阴性质控品，依据野生型探针产生的颜色荧光曲线作为阴 性质量控制标准，阴性质控品的Ct值应小于30 ;对于以蒸馏水、纯水、生理盐水或鲑鱼精子 DNA的阴性质控品，野生型和突变型探针产生的颜色荧光曲线的Ct值均应大于35。
[0028] 根据本发明的一个优选实施方案，可以根据所扩增序列的特殊情况，在试剂盒的 PCR缓冲液中加入甲酰胺或二甲基亚砜等PCR反应添加剂减少高GC含量或二级结构对PCR 反应的影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数（Ct值），纵轴表示荧光 强度，'S'型曲线是突变型探针颜色荧光曲线，野生型探针颜色荧光曲线无扩增。
[0030] 图2显示阴性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数（Ct值），纵轴表示荧光强度， 'S'型曲线是野生型探针颜色荧光曲线，突变型探针颜色荧光曲线无扩增。该阴性质控品为 经过测序检验结果为GJB2 235位点突变纯合型的质粒载体。
[0031] 图3显示阴性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数（Ct值），纵轴表示荧光强度， 野生型与突变型探针颜色荧光曲线Ct值均无扩增。该阴性质控品为鲑鱼精子DNA。
[0032] 图4显示试剂盒检测GJB2 235delC纯合突变型人外周血组织标本的扩增曲线。结 果冋图1。
[0033] 图5显示试剂盒检测GJB2 235delC野生型人外周血组织标本的扩增曲线。结果 同图2。
[0034] 图6显示试剂盒检测GJB2 235delC杂合型人外周血组织标本的扩增曲线。横轴 表示循环数（Ct值），纵轴表示荧光强度，两条'S'型曲线分别表示野生型与突变型探针颜 色荧光曲线，可见2条曲线的Ct值接近。
[0035] 图7显示DNA提取失败的人外周血组织的扩增曲线，结果同图3。野生型及突变型 探针颜色荧光曲线均无扩增，说明DNA提取失败。
【具体实施方式】
[0036] 下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
[0037] 实施例1 :GJB2基因235delC突变检测试剂盒及其使用
[0038] 试剂盒的组成
[0039] PCR反应液1管（500ul)、阳性质控品1管（20ul)，阴性质控品1管（20ul)，DNA提 取液1管（3ml)，红细胞裂解液1瓶（15ml)。
[0040] PCR反应液包括：1XPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq酶25U/ml、0. 2uM正向引物（SEQ ID N0:1)、0. 2uM 反向引物（SEQ ID N0:2)、0. 2uM 野生型荧光探针（SEQ ID N0:3)，0. 2uM 突变型荧光探针（SEQ ID NO :4)。
[0041] 操作步骤：
[0042] 1)基因提取：取lOOul EDTA抗凝外周血，加入600ul红细胞裂解液，室温放置 5-10分钟，期间混匀数次，5000rpm离心5分钟，弃上清，然后加入DNA裂解液100ul，混匀， 99度10分钟，离心，取上清作为DNA摸板进行后续工作。也可以使用商业化的DNA提取试 剂盒进行基因提取，提取过程按照相应的试剂盒说明进行。
[0043] 2)PCR检测：取PCR反应液23ul置入PCR管中，加入2ul样品DNA，混匀后置于荧 光定量PCR仪中。
[0044] 阳性质控：分别取阳性质控品2ul加入PCR反应液中，余同样品操作。
[0045] 阴性质控：分别取阴性质控品2ul加入PCR反应液中，余同样品操作。
[0046] PCR扩增参数：50 °C 2min，95 °C 2min，然后进行40个循环： 95°C 30sec - 61°C 20sec，反应结束后将结果保存待进一步分析。
[0047] 3)结果分析：依据阳性质控品、阴性质控品荧光颜色曲线对样本进行分析。如果 存在2条不同颜色的荧光曲线，则样本为杂合型。
[0048] 实施例2 :GJB2基因235delC突变检测试剂盒及其使用
[0049] 试剂盒的组成
[0050] PCR反应液1管（500ul)、阳性质控品1管（20ul)，阴性质控品1管（20ul)，DNA提 取液1管（3ml)，红细胞裂解液1瓶（15ml)。
[0051] PCR反应液包括：1XPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq酶25U/ml、0. 2uM正向引物（SEQ ID NO :1)、0. 2uM 反向引物（SEQ ID NO :2)、0. 2uM 突变型荧光探针（SEQ ID NO :4)。
[0052] 操作步骤同实施例1。
[0053] 结果分析：依据阳性质控品荧光颜色曲线对样本进行分析。如果存在与阳性质控 品荧光颜色相同的曲线，则样本存在GJB2基因235delC突变，不能区分杂合还是纯合突变。 如果不存在荧光曲线，则样本判定为野生型。
[0001] 序列表 <110>王宝恒史桂芝 <120>单管荧光PCR技术检测GJB2基因235delC突变的方法及其试剂盒 <130> 0 <160〉 5 <210> SEQIDNO： 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221 > primer-bind <222> (1)..(20) <223>根据特定核苷酸序列设计，用以作PCR扩增的引物 <400〉SEQIDNO: 1 caagaacgtg tgctacgatc 20 <210> SEQIDNO： 2 <211> 20 <212〉DNA <213>人工序列 <220〉 <221 > primer-bind <222> (1)..(20) <223>根据特定核苷酸序列设计,用以作PCR扩增的引物 <400> SEQIDNO： 2 ttcctcttct tctcatgtct 20 <210> SEQIDNO： 3 <211〉20
[0002] <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <221> probe-bind <222> (1)..(20) <223>根据特定核苷酸序列设计，用以作PCR扩增的探针 <400> SEQIDNO： 3 gctatgggcc ctgcagctga 2〇 <210> SEQIDNO： 4 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <221> probe-bind <222〉（1)..(19) <223>根据特定核苷酸序列设计，用以作PCR扩增的探针 <400> SEQIDNO： 4 gctatgggcc tgcagctga 19 <210> SEQIDNO： 5 <211> 681 <212〉DNA <213> 智人(Homo Sapiens) <220> <221> gene <222〉（1)..(681) <223>人〇182基因编码区序列
[0003] <400> SEQIDNO： 5 atggattggg gcacgctgca ga^gatcctg gggggtgtga acaaacactc caccagcatt 60 ggaaagatct ggctcaccgt cctcttcatt tttcgcatta tgatcctcgt tgtggctgca 120 aaggaggtgt ggggagatga gcaggccgac tttgtctgca acaccctgca gccaggctgc 180 aagaacgtgt gctacgatca ctacttcccc atctcccaca tccggctatg ggccctgcag 240 ctgatcttcg tgtccacgcc agcgctccta gtggccatgc acgtggccta ccggagacat 300 gagaagaaga ggaagttcat caagggggag ataaagagtg aatttaagga catcgaggag 360 atcaaaaccc agaaggtccg catcgaaggc tccctgtggt ggacctacac aagcagcatc 420 ttcttccggg tcatcttcga agccgccttc atgtacgtct tctatgtcat gtacgacggc 480 ttctccatgc agcggctggt gaagtgcaac gcctggcctt gtcccaacac tgtggactgc 540 tttgtgtccc ggcccacgga gaagactgtc ttcacagtgt tcatgattgc agtgtctgga 600 atttgcatcc tgctgaatgt cactgaattg tgttatttgc taattagata ttgttctggg 660 aagtcaaaaa agccagttta a ggl
【权利要求】
1. 一种采用实时荧光聚合酶链反应技术（FQ-PCR)检测GJB2基因233-235位点C缺失 (235delC)突变的方法，其特征在于以GJB2基因第235位点碱基缺失处设计特异性野生型 探针及突变型探针，野生型及突变型探针分别被标记上不同颜色的荧光，同时在GJB2基因 第235位点碱基两侧设计特异性扩增引物，对于检测样本，依据野生型与突变型探针在PCR 扩增中产生的荧光颜色不同来判断样本是否存在突变。
2. -种用实时荧光PCR方法检测GJB2基因235delC突变的试剂盒，其特征在于试剂盒 主要包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品。
3. 根据权利要求1、2所述的方法及其试剂盒，其特征在于，GJB2基因第235nt区域上 游设计正向扩增引物，在下游设计反向扩增引物，其长度均为10_30bp之间的核苷酸序列， 能够扩增出含有GJB2基因233-235nt区域的长度为50-700bp的核苷酸片段，优选地，正向 引物（SEQ ID NO :1)及反向引物（SEQ ID NO :2)为能扩增出含有GJB2基因233-235nt区 域60-150bp片段的特异性核苷酸序列。
4. 根据权利要求1、2所述的方法及其试剂盒，其特征在于，GJB2基因第205-265nt区 域设计野生型探针及突变型探针，优选地，在GJB2基因第215-255nt区域进行探针设计，其 长度均为l〇_3〇bp之间的核苷酸序列。两种探针均覆盖GJB2基因233-235nt区域，其中野 生型探针（SEQ ID NO :3)针对GJB2基因235野生型位点，突变型探针（SEQ ID NO :4)针对 GJB2基因235delC突变位点。
5. 根据权利要求1、2、3、4所述的方法及其试剂盒，其特征在于，PCR反应液中包含荧光 检测物质。荧光检测物质为荧光探针，其中探针5'端标记荧光发生基团，3'端标记荧光淬 灭基团。
6. 根据权利要求1、2、3、4、5所述的方法和试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括下列内 容：PCR反应液含有1XPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向型引物、反向型引物、 野生型荧光探针、突变型荧光探针。
7. 根据权利要求1、2所述的方法及权利6所述的试剂盒，其特征在于待检测靶核酸样 品来自被检测者的血液、唾液、羊水细胞或其它人体组织；阳性质控品为经过测序检验结果 为GJB2 235位点纯合突变型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或含有相应序列的PCR产 物或质粒载体；阴性质控品为蒸馏水、纯水、生理盐水、鲑鱼精子DNA ;阴性质控品也可以为 经过测序检验结果为GJB2 235位点野生型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或含有相应 序列的PCR产物或质粒载体。
【文档编号】C12Q1/68GK104099402SQ201310116474
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月7日 优先权日:2013年4月7日
【发明者】王宝恒, 史桂芝 申请人:王宝恒