专利名称：一种β-琼胶酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因筛选应用技术领域，具体涉及一种β -琼胶酶及其应用，即一种来源于嗜琼胶卵链菌(Catenivulum agarivorans gen.nov.sp.ηον.) YMOl 的 β -琼胶酶基因ΥΜ01-3及其应用。
背景技术：
在自然环境中，琼胶酶的分布较广，很多微生物和一些海洋软体动物都能产生琼胶酶。现阶段，绝大多数被分离研究的琼胶酶都是来自微生物，而海洋细菌又是产琼胶酶最多的类群。琼胶降解菌在海洋生态系统中分布广泛，在海洋植物、动物、海水及海洋沉积物中均有分布。根据氨基酸序列的相似性，琼胶酶被归属为糖苷水解酶家族(Glycosidehydrolase family)中的GH- 16,GH- 50和GH- 86。根据琼胶酶降解琼脂糖作用方式不同，可以把琼胶酶分为两类:α -琼胶酶和β -琼胶酶。α -琼胶酶裂解琼脂糖的α _1，3糖苷键，生成以D-半乳糖为非还原性末端和以3，6-内醚-a - L-半乳糖为还原性末端的的琼寡糖系列；β -琼胶酶裂解琼脂糖的1，4糖苷键，生成以β- D-半乳糖为还原性末端和以3，6-内醚-a - L-半乳糖为还原性末端的新琼寡糖系列。已有证据表明，这些琼胶寡糖尤其是新琼寡糖具有很多的生理和生物活性。例如新琼寡糖对黑色素瘤细胞具有保湿和美白效果，还具有抑制微生物生长，刺激巨噬细胞活性的作用；琼胶寡糖在体内体外都具有清除ROS (Reactive Oxygen Species,活性氧簇)造成的氧化损伤的作用，因此可以应用在化妆品和保健品领域。综上所述，可以看出琼寡糖在功能食品、药物、化妆品等领域都有非常广泛的应用前景。目前常用的琼寡糖生产方法主要有化学法和酶解法两种。传统的化学制备方法反应条件比较剧烈，专一性差，很难得到单一大小的寡糖，而且水解产物容易破坏，不利于产物的分析和回收，这些都限制了琼寡糖`的使用。而琼胶酶酶解法由于高度专一高效，反应条件温和，易于控制，产物不易被破坏，因此有利于特定寡糖的大量制备和回收，必将成为琼寡糖生产的主要方法。虽然琼胶酶制备寡糖具有很多优势，但目前在工业上并没有得到广泛应用。这主要是因为目前发现和研究较多的是中温琼胶酶。由于提取纯化的费用高、酶产量低，贮藏和处理过程中酶活容易损失，贮存期短、运输费用高等缺点，导致这些酶的应用受到限制；而耐高温琼胶酶由于具有良好的高温稳定性，寿命一般长于中温酶，而且制备和使用过程中不需要冷却设备，可以显著降低成本，因此，在工业上具有更广泛的应用前景。
发明内容
本发明目的是提供一种β -琼胶酶基因及其应用，所提供的β -琼胶酶具有耐高温的特性，从而弥补现有技术的不足。本发明的一个方面提供一种β -琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。用于编码本发明β_琼胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID Ν0:2。
本发明的另一个方面提供一种用于表达上述β -琼胶酶的重组表达载体。本发明的β -琼胶酶用于降解琼胶制备新琼寡糖。本发明的β -琼胶酶具有耐高温的特性，能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖，具有很好的工业应用前景。
图1:本发明的β-琼胶酶的耐高温效果检测(显示降解圈)，其中左边样品未煮过，右边样品沸水煮过5min ；图2:本发明的β -琼胶酶的应用效果。
具体实施例方式下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。实施例1: β -琼胶酶基因ΥΜ01-3的分离通过对嗜琼胶卵链菌YMOl进行全基因组测序得到15个琼胶酶基因及其基因序列，包括13个β -琼胶酶基因和2个α -琼胶酶基因，ΥΜ01-3是其中的一个β -琼胶酶基因。利用生物学软件 Primer5.0 设计上游引物(5' - CCGGAATTCATGTATGCAGCAGACTGGGAT-3')和下游引物(5' - CCGCTCGAGTTGGAACTTCCATTGCTGG-3')以基因组 DNA 为模板，进行PCR反应，PCR反应组成如下(25 μ I反应体系):ddH20 10.5 μ 1、上游和下游引物各0.5 μ 1，DNA模板 1μ 1,2XMasterMix 12.5 μ I。反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性 lmin，60°C退火lmin，72°C延伸1.5min，72°C终延伸lOmin，共30个循环。反应结束后，将PCR产物回收得到琼胶酶基因YM01-3，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 2，其翻译的酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。多个测序结果也获得了相同的结果。实施例2:大肠杆菌克隆载体I3UCm-T — YMO1-3的构建将β -琼胶酶基因ΥΜ01-3与载体PUCm-T的连接，采用DNA Ligation Kit连接，连接体系(10 μ I)如下:Solution I 5 μ 1，DNA 片段 4 μ l，PUCm_T 载体 I μ I。16°C连接 16h所得到的连接液即可获得大肠杆菌克隆载体PUCm-T — YMO1-3，用于转化大肠杆菌JM109。实施例3:大肠杆菌重组株JM109—PUCm-T — YMO1-3的构建加入200 μ I解冻的感受态Ε.coli JM109和10 μ I实施例2得到的连接液至2mlEppendorf管中，冰浴30min，42°C 90s，冰浴2min，加入LB培养基800 μ 1，37°C振荡培养I小时。菌液与4μ I IPTG及40μ1 X-gal混合后涂布于含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养12-14h。挑取白色菌落做PCR及双酶切检测，酶切体系(20 μ I)如下:ddH208μ l，PUCm-T—YM01-3 质粒 DNA 8 μ 1，EcoR I I μ 1，Xhol I I μ I, IOXH Buffer 2μ1，琼脂糖凝胶电泳中出现1260bp特异带者为阳性转化克隆，即含有I3UCm-T — YMO1-3的大肠杆菌JM109—PUCm-T—YM01-3。将Iml阳性克隆菌液送测，以M13测序通用引物测定外源插入序列YMO1-3核苷酸序列。实施例4:大肠杆菌表达载体pET24a(+) — YM01-3的构建克隆载体PUCm-T — YM01-3和表达载体pET24a(+)分别用EcoR I和Xhol I双酶切，酶切体系(20 μ I)如下:反应体系1:ddH20 8 μ 1，PUCm-T-YMO1-3 质粒 DNA 8 μ 1，EcoR I I μ I,Xhol I I μ I, IOXH Buffer 2 μ I反应体系2:ddH20 8 μ 1，pET24a(+)质粒 DNA 8 μ 1，EcoR I I μ 1，Xhol I I μ I,IOXH Buffer 2 μ 137°C酶切2小时，电泳后分别回收两个目的片段1260bp和5.3Kb，二者分别与琼胶酶YMOl基因全长片段与表达载体PET24a⑴片段大小相同，用DNALigation Kit 连接,连接体系(10 μ I)如下:Solution I 5μl,DNA片段l.5μl,pET24a(+)载体1.1μ 1，ddH20 2.4μ1。16°C连接16小时即可获得大肠杆菌表达载体pET24a(+) —YMO1-3，用于转化大肠杆菌BL21 (DE3)。实施例5:大肠杆菌重组株BL21 (DE3) —pET24a (+) -YMO1-3的构建加入200 μ I解冻的感受态Ε.coli JM109和10 μ I实施例4得到的连接液至2mlEppendorf管中，冰浴30min，42°C 90s，冰浴2min，加入LB培养基800 μ 1，37°C振荡培养I小时。菌液涂布于含有100 μ g/ml卡那霉素的LB平板上，37°C培养12-14h。挑取白色菌落做双酶切检测，酶切体系(10 μ I)如下:ddH20 4μl，pET24a(+)—YM01-3质粒DNA 4 μ 1，EcoR I 0.5 μ I, Xhol I 0.5 μ I, IOXH Buffer I μ I。琼脂糖凝胶电泳中出现 1260bp特异带者为阳性转化克隆，即含有pET24a (+) — YMO1-3的大肠杆菌重组株BL21 (DE3) —pET24a (+)—YM01-3。实施例6:重组β -琼胶酶的制备挑取大肠杆菌重组株BL21 (DE3) 一 pET24a⑴一 YMO 1_3单克隆于含有浓度为100 μ g/ml卡那霉素的LB的液体培养基中，37°C振荡培养过夜，按1%接种量接种至200ml含有100 μ g/ml卡那霉素的LB的液体培养基中，37°C 150rpm振荡培养至OD6c 为0.4-0.5，加入终浓度为0.1mMIPTG, 16°C诱导表达10_12h。诱导菌液4°C 12000rpm离心lOmin，收集菌体，菌体用IOmllXNi 柱结合缓冲液(20mM Tris-HCl , PH=8.0 ；10 mM咪唑；0.5 mMNaCl)重悬并进行超声波破碎，破碎后4°C 12000rpm离心lOmin，收集上清液，破碎沉淀用2ml结合缓冲液冲洗，离心收集上清，将两次上清液混合。上清液上至用平衡好的Ni柱，用10 倍体积 IXNi 柱洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl , PH=8.0 ；20 mM 咪唑；0.5 mM NaCl)洗脱，然后依次用不同浓度(50 mM,100 mM,150 mM, 200 mM，250mM)咪唑的洗涤缓冲液洗涤亲和柱，最后用浓度为500mM咪唑的洗脱液洗涤亲和柱，收集洗脱液。洗脱液于透析液(20mMTris-HCl，PH=8.0 ；0.85 (g/v)NaCl, 10% 甘油(v/v))中透析 24h 后 SDS-PAGE 检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的条带的洗脱液即可得到重组β_琼胶酶，其氨基酸序列见。用Bradford法测定目的蛋白的浓度，分装后将蛋白冻于_20°C保存以备用。实施例7:重组β -琼胶酶活性检测及其酶学性质将同样大小的圆滤纸片放在2%的琼脂糖平板上，分别取10微升未处理的纯化的重组酶和沸水中煮5min的纯化的重组酶滴在滤纸片上，37°C放置3h，然后用卢戈氏碘液染色，结果可在棕色背景上看到两个明显的透明圈(见附图1)，说明纯化的重组酶有活性且煮5min后仍有活性。用DNS试剂法测得此琼胶酶的酶学性质如下:1、最适温度为60°C2、温度稳定性:0°C -100°C下放置lh，其中0°C _50°C能保持90%的活性，60°C下还能保持30%的活性。3、最适 PH 为 6.04、PH稳定性:PH=4 PH=Il缓冲液中放置12h，其中PH=4_9能保持87%的活性。5、不同离子对酶活的影响:重金属离子如Fe3+、Mn2+、Cu2+、Ni2+对酶活有明显的抑制作用，其他金属离子如Na+、K+、Mg2+、Ca2+以及β _巯基乙醇，尿素对酶活影响不大6、酶比活:在底物浓度为0.25%琼脂糖，PH=6，60°C下测得酶比活为174.4U/mg7、酶促动力学参数:Km=3.5mg/ml ；Vmax=llll.lU/mg实施例8:表达产物用于制备新琼寡糖制备新琼寡糖时，将琼脂糖溶于20mM Tris-HCl缓冲液(PH=8.0)中配成浓度为
0.25%的溶液，按重组酶体积:反应体系体积=1-2:1000加入实施例6中所得的重组β -琼胶酶，混合均勻后，50。。温浴24h,反应不同时间(5min、lOmin、15min、30min、lh、3h、6h、12h、24h),于_20°C终止反应，12000rpm离心lOmin,上清即作为薄层层析的样品。薄层层析板使用前置于110°C烘箱中干燥lh。在层析板上距离底部Icm处用铅笔划出底线，将样品ΙΟμΙ点于底线上，用风筒吹干，置于自制层析缸中展层。展开剂配方为正丁醇:冰乙酸:水=2:1:1 (体积比)。待前沿线到达离层析板顶端Icm处时停止展层，烘箱中干燥。最后往层析板喷洒显色剂(2% 二苯胺丙酮溶液5ml, 2%苯胺丙酮溶液5ml,三氯乙酸5g)，105°C烘箱中显色。显色结果显示了降解产物随时间的变化(见图2)。根据以上结果，进行降解产物一新琼寡糖聚合度的分析，具体方法如下:同一块薄层层析板上点一个样品，展层结束后，遮住层析板的四分之三面积，只往剩下的四分之一上喷洒上述显色剂进行显色。显色后对照显色部分的条带，将未显色部位的对应条带刮下，加入一定体积的去离子水浸泡，12000 rpm离心lOmin，取上清冻干后即作为做质谱的样品。质谱分析表明降解过程能产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖。
权利要求
1. 一种β-琼胶酶，所述的β-琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.用于编码权利要求1所述的琼胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQID Ν0:2。
3.—种重组表达载体，所述的重组表达载体用于表达利要求I所述的琼胶酶。
4.权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，插入有权利要求2所述的基因。
5.权利要求1所述的β-琼胶酶在降解琼胶制备新琼寡糖中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明的β-琼胶酶具有耐高温的特性，能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖，具有很好的工业应用前景。
文档编号C12N15/56GK103194435SQ20131012238
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者史晓翀, 张晓华, 董素洁, 崔方元 申请人:中国海洋大学