食品过敏原小麦成分lamp现场快速检测方法

专利名称：食品过敏原小麦成分lamp现场快速检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及食品或饲料中小麦成分的LAMP检测方法和试剂盒。
背景技术：
食物过敏是人们对食品产生的一种不良反应，属机体对外源物质产生的一种变态反应，目前，国际公认的主要八大类过敏食品为:大豆、花生、小麦、蛋、奶、鱼、坚果、甲壳类。食物过敏的一般症状包括呕吐、腹痛、腹泻等，也包括皮肤反应及呼吸道症状，严重情况下甚至会出现系统性过敏性休克或死亡。对于食物过敏治疗尚无特效方法，严格避免食用含有过敏原成分的食品是最有效的疗法。完全的食物禁忌很难实现，因为食物过敏原可能隐藏在其他食物当中。为保护过敏人群，各国政府和国际组织相继修改和出台规范食品中过敏原标识的法律法案，对食品标签上过敏原成分的标注作出严格规定。小麦是最常用的食品原料，广泛应用于食品及食品工业，其过敏性对过敏人群的影响显而易见。美国、欧盟、加拿大等国要求强制性标识食品过敏原小麦成分。因此对食品中小麦成分的检测尤为重要。对于食品中食品过敏原成分的检测研究，主要有以蛋白质为基础的方法(如ELISA方法)和以基因为基础的方法(如PCR方法)，这两种方法都需要高端仪器设备、专业操作人员。本领域目前还没有检测效果良好且操作简单、设备要求低的特异性检测食品过敏原小麦成分的试剂和方法。

发明内容

本发明的目的在于提供食品过敏原小麦成分LAMP现场快速检测方法。在本发明的第一方面，提供一种鉴定食品过敏原小麦成分的方法，所述方法包括:以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增小麦GAG56D基因的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含食品过敏原小麦成分。在一个优选例中，所述的扩增是环介导等温扩增(LAMP)。在另一优选例中，所述的特异性扩增小麦GAG56D基因的引物包括:上游外引物SEQ ID NO: 1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQ ID NO:3，下游内引物SEQ ID NO:4,上游环引物SEQ ID N0:5，下游环引物SEQ ID N0:6。在另一优选例中，所述的环介导等温扩增包括:63土1°C (较佳地63±0.5V )恒温反应45 土 IOmin (较佳地45 土 5min)，然后在80 ± 2°C (较佳地80 ± I °C )灭活5 土 Imin (较佳地5±0.5min)，结束反应。在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中包括引物、Mg2+、甜菜碱、dNTPs ；其中，Mg2+浓度6± ImM;甜菜碱浓度 0.8±0.1M ;dNTPs 浓度 1.6±0.2mM。在另一优选例中，在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中加入SYBR GreenI荧光染料观察颜色变化，没有扩增产物的阴性管呈橙色，有扩增产物的阳性管为绿色在另一优选例中，所述的待测样品是食品。在本发明的另一方面，提供一种引物，所述引物是LAMP扩增引物，包括:上游外引物SEQ ID NO: 1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQ ID NO:3，下游内引物SEQ IDN0:4，上游环引物SEQ ID N0:5，下游环引物SEQ ID N0:6。在本发明的另一方面，提供所述的引物的用途，用于从待测样品中鉴定食品过敏原小麦成分。在本发明的另一方面，提供一种鉴定食品过敏原小麦成分的试剂盒，其中包括前面所述的引物。在一个优选例中，所述试剂盒中还包括:含有小麦成分的检测标准品；DNA提取试剂；pH 缓冲试剂(如 Tris-HCl (PH8.8))；钾离子溶液；镁离子溶液；铵离子溶液；Tween20 ； 甜菜碱；dNTP ；Bst大片段DNA聚合酶；荧光染料(如SYBR Green I荧光染料);和/或说明鉴定食品过敏原小麦成分的方法的使用说明书。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1、食品过敏原小麦LAMP检测引物反应时间的实时浊度扩增图谱。CH1-3:阴性对照，CH4-6:阳性对照。图2、食品过敏原小麦LAMP检测引物体系优化的实时浊度扩增图谱。CH1-2:阴性对照，CH3-4:阳性对照。图3、食品过敏原小麦成分LAMP特异性检测的实时浊度图谱。A:CH1_8依次为小麦、大豆、鹰嘴豆、扁豆、四季豆、豌豆、白云豆、绿豆；B:CH1_8依次为豇豆、蚕豆、大米、玉米、燕麦、黄花羽扇豆、荞麦、花生；C:CHl-8依次为杏仁、核桃、芹菜、胡萝卜、土豆、番茄、梨、桔子；D:CHl-8依次为西柚、牛奶、鸡蛋、羊奶、鸭蛋、鹅蛋、鸽子蛋、猪肉；D:CHl-6依次为小麦、草虾、螃蟹、三文鱼、黑麦、阴性对照。图4、食品过敏原小麦成分LAMP特异性检测的显色法检测结果。1-38依次为:阳性对照、阴性对照、小麦、大豆、鹰嘴豆、扁豆、四季豆、豌豆、白云豆、绿豆、豇豆、蚕豆、大米、玉米、燕麦、黄花羽扇豆、荞麦、花生、杏仁、核桃、芹菜、胡萝卜、土豆、番茄、梨、桔子、西柚、牛奶、羊奶、鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽子蛋、猪肉、草虾、螃蟹、三文鱼，黑麦。图5、食品过敏原小麦成分LAMP灵敏度检测的实时浊度图谱。CHl:1% 小麦；CH2:0.5% 小麦；CH3:0.1% 小麦；CH4:0.05% 小麦；CH5:0.01% 小麦；CH6:0.005% 小麦；CH7:0.001% 小麦；CH8:阴性对照。图6、食品过敏原小麦成分LAMP灵敏度检测的显色法检测结果。1-3:0% 小麦；4-6:0.005% 小麦，7-9:0.01% 小麦，10-12:0.05% 小麦；13:阳性对照；14:阴性对照。 图7、0.1%小麦LAMP检测的实时浊度稳定性检测图。A =CHl:阳性对照，CH2:阴性对照(超纯水)，CH3_6:0.1%小麦模拟样品；B:CH1_8为0.1%小麦模拟样品；C:CHl-6为0.1%小麦模拟样品。图8、0.1%小麦LAMP检测的显色法稳定性检测图。I:阳性对照，2:阴性对照，3-22:0.1%模拟样品。图9、0.01%小麦LAMP检测的实时浊度稳定性检测图。A =CHl:阳性对照，CH2:阴性对照，CH3-6:0.01% 小麦样品;B、C:CH1_8 为 0.01% 小
麦样品。图10、0.01%小麦LAMP检测的显色法稳定性检测图。

I:阳性对照，2:阴性对照，3-22:0.01%模拟样品。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种食品过敏原小麦成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。经过比较筛选，发现以小麦GAG56D基因作为鉴定的靶基因，特异性良好；并基于此设计了 LAMP扩增引物，所述引物针对含有阴性对照小麦成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有阴性对照小麦成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。本发明的方法可良好地应用于鉴定阴性对照小麦成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。目前市场上的食品大多是混合成分制成的，各种成分在细加工后很难辨认。并且禾本科植物中小麦以外的其它植物与小麦性状接近，更是增加了区分难度，即使采用一些基因或蛋白水平上的技术，也由于一些品种在亲缘关系上较近，难以找到符合标准的、检测准确性高、实用性强的小麦成分检测靶标。为此，本发明人经过深入的研究和大量的筛选，找到了合适的检测靶标，基于此开发了 LAMP检测小麦成分的方法。 如本文所用，所述的“小麦成分”是指特异性来自于小麦的成分，例如小麦粉等。如本文所用，所述的“食品”包含了饮料。本发明人通过对引物的筛选，获得一类可特异性鉴定食品过敏原小麦成分的引物，其对于小麦的DNA发生特异性扩增，而对没有小麦成分的DNA不发生特异性扩增。因此，本发明提供一种引物，所述的引物是LAMP扩增引物，包括:上游外引物SEQID NO: 1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQ ID NO:3，下游内引物SEQ ID N0:4，上游环引物SEQ ID N0:5，下游环引物SEQ ID N0:6。本发明的这些弓I物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。
利用本发明的引物，进行LAMP反应，并通过浊度仪检测或显色观察，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有小麦成分，而且所需的样品量很少。本发明还提供了一种鉴定食品过敏原小麦成分的方法，所述方法包括:以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增小麦GAG56D基因的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含小麦成分。更优选地，基于本发明所提供的适用于鉴定小麦成分的特异性引物，所述方法包括:以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6所示的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含小麦成分。LAMP是近年来发展的一种新颖和较成熟的等温核酸扩增技术。与PCR方法相比，LAMP不需要热循环仪(PCR仪)，且由于LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物通过肉眼观察或浊度计即可判定结果；因此LAMP适合于现场或条件较差的实验室进行快速检测。LAMP技术以其快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、病原微生物鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。本发明建立小麦过敏原成分的LAMP检测方法，用于食品安全突发事件现场的检测和食品生产企业生产过程控制中的样品检测，填补食品过敏原现场快速检测方法的空白。获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。本发明还涉及一种用于鉴定食品过敏原小麦成分的试剂盒，所述试剂盒中含有针对小麦GAG56D基因的LAMP扩增引物。此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定食品过敏原小麦成分的试剂，如(但不限于):含有小麦成分的检测标准品；DNA提取试剂；pH缓冲试剂(如Tris-HCl (PH8.8));钾离子溶液；镁离子溶液；铵离子溶液；Tween20 ;甜菜碱；dNTP ；Bst大片段DNA聚合酶；荧光染料(如SYBR Green I荧光 染料)。此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定食品过敏原小麦成分的使用说明书和/或标准操作程序。本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测食品过敏原小麦成分的目的。本发明的主要优点在于:(I)首次揭示一种可特异性鉴定食品过敏原小麦成分的引物，所述的引物特异性良好，对于小麦来源的成分能够实现特异性扩增，而对于小麦以外的其它成分不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测小麦成分，从待测样品中快速准确地区分小麦成分，并且所需样品量少，操作简单。(3)本发明的方法用于食品安全突发事件现场的检测和食品生产企业生产过程控制中的样品检测，填补食品过敏原现场快速检测方法的空白。本发明的方法的推广应用对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。为食品的市场监督部门和检验检疫部门提供了技术支持。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。1、材料与方法1.1 材料小麦、黑麦、大米、玉米、燕麦、荞麦、黄花羽扇豆、大豆、鹰嘴豆、扁豆、四季豆、豌豆、白云豆、绿豆、豇豆、蚕豆、花生、大杏仁、核桃、芹菜、胡萝卜、土豆、番爺、梨、桔子、西柚、牛奶、羊奶、鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽子蛋、猪肉、草虾、三文鱼、螃蟹等36种材料购自上海市农贸市场。用于过敏原小麦成分的特异性检测。小麦产品(面粉、面包、蛋糕、面条、饼干、饺子、馒头等)20份，其它未含小麦成分的食品(面粉、面条、馒头等面制品，肉、肉肠、罐头等肉制品，牛奶、奶粉等奶制品，蛋制品，蔬菜制品、坚果、饮料等)50份，购自上海超市，用于实际样品检测。1.2主要试剂和耗材 LAMP 反应试剂:Bst DNA Polymerase Large Fragment,购自 New EnglandBiolabs 公司。甜菜碱(Betaine)、MgCl2,购自Sigma 公司。dNTPs，购自宝生物工程(大连)有限公司。SYBR Green I 突光染料，购自 Invitrogen 公司。LAMP引物(正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB)，委托生工生物工程(上海)有限公司合成。1.3主要仪器设备冰箱；离心机；LAMP实时浊度仪，LA-320C,日本荣研化学株式会社；漩涡混合器；微量移液器；分析天平。1.4LAMP弓丨物的设计经过广泛的试验和比对，本发明人最终确定选取GAG56D基因序列为小麦特异序列，基于此设计特异性引物。外引物扩增片段长度:225bp。上游外引物(F3，SEQ ID NO:1)，下游外引物(B3，SEQ ID N0:2)，上游内引物(FIP，SEQ ID N0:3)，下游内引物(BIP, SEQ ID N0:4)、上游环引物(LF，SEQ ID NO:5)和下游环引物(LB, SEQ ID NO:6) F3:CAGCAACCACAACAACAATTB3: TAGTTGTTGGCAGCATTGT
FlcF2
- -
FlP(Flc+F2): T TCTTGCATGGGTTC ACCTGTT C A ACCGC AAC A AT CATTCC
BlcB2
- ^-
BIP(B!c+B2): AACCTGTGTCACTGGTGTCATC ATCACTTGGCAATCGCTTLF: TAGAGATGGCTGAATGAACGGLB:CCTCTGGTCAATGATCTGGC1.5样品制备
使用冷冻研磨机将小麦和玉米磨成粉末状，并60°C烘干6h。使用玉米粉混合小麦粉，使小麦粉含量为1%，0.5%，0.1%，0.05%, 0.01%, 0.005%和0.001% (w/w)，用于食品过敏原小麦成分的灵敏度测试。1.6DNA提取及制备使用天根动物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，目录号:DP323)提取动物样品的DNA，使用植物DNA小量提取试剂盒(OMEGA公司E.Z.N.A wHP Plant DNA Kit,货号为D2485)提取植物样品的DNA，提取方法详见试剂盒操作说明书。使用BioPhotometerplus核酸蛋白含量测定仪(德国Eppendorf公司)测定核酸浓度。1.7LAMP扩增和检测LAMP 反应体系:2 X Reaction Mix (RM) 12.5 μ L，FIP 和 BIP 各 1.6 μ M，F3 和 B3 各0.2μΜ,20πιΜ Tris-HCl (ΡΗ8.8), IOmM KCl,6mM MgSO4, IOmM(MM)2SO4，0.l%Tween20，0.8M甜菜碱，6mM MgS04,1.6mM dNTP，8U Bst大片段DNA聚合酶，2 μ I待测DNA，用蒸馏水补足体系至25μ1。63°C恒温反应45min，8(TC灭活5min结束反应。通过LAMP实时浊度仪，观察扩增曲线。显色法LAMP检测:产物加入SYBR Green I荧光染料观察颜色变化，没有扩增产物的阴性管呈橙色，有扩增产物的阳性管为绿色。1.8LAMP引物特 异性实验对供试的36种动植物材料DNA作为LAMP反应的模板，进行LAMP反应，63°C运行45min,验证LAMP反应的特异性。分别以实时浊度仪和显色法观察检测结果。1.9LAMP灵敏度实验将1%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001% 小麦进行 LAMP 实验，以 ddH20 代替DNA模板作为阴性对照，以小麦DNA(100ng/y L)作为阳性对照，进行LAMP扩增，63°C运行45min,实施浊度仪检测反应结果，以确定使用浊度仪检测的LAMP检测灵敏度。将0.1%、0.01%,0.005%,0%小麦进行显色法LAMP实验，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以小麦DNA(100ng/y L)作为阳性对照，进行LAMP扩增，63°C运行45min，以确定显色法LAMP检测灵敏度。1.10LAMP稳定性实验以0.1%,0.01%,0.005%,0%小麦DNA作为模板，各20个平行样品。以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以小麦DNA(100ng/y I)作为阳性对照进行LAMP扩增，63°C运行60min,观察LAMP反应的稳定性。分别以实时浊度仪和显色法观察检测结果。1.11实际样品检测对市场上购买的5份小麦产品(面包、蛋糕)，其他45份未含小麦成分的食品进行检测，验证LAMP检测方法对实际样品的检出情况。以显色法LAMP检测观察结果。2、实施例实施例1、食品过敏原小麦成分特异性检测引物初筛和体系优化初步确定25 μ L的LAMP反应体系，其成分包括:FIP和BIP各1.6 μ M，F3和B3各
0.2μΜ, LF 和 LB 各 0.8μΜ，20πιΜ Tris-HCl (ΡΗ8.8), IOmM KCl, 8mM MgSO4, IOmM(NH4)2SO4,
0.l%Tween20，IM甜菜碱，6mM MgSO4,1.6mM dNTP，8U Bst 大片段 DNA 聚合酶，2 μ I 待测 DNA。将除模板外其他试剂配备成混合液混匀后，每管分装23 μ L，加入20 μ L密封液后再分别加入2 μ L模板DNA或阴阳性对照模板，混匀离心后将I μ L的显色液点在管盖中间，小心盖紧管盖，避免显色液掉入反应液中。将混合物置于反应孔中，于63°C恒温反应60min,最后80°C下保温5min以结束反应，实时浊度仪记录结果。根据出峰时间及阴阳性符合率初步筛选引物。用100%的小麦标准品作为模板进行引物的初步筛选，同时以阴性DNA作为阴性对照。实验结果显示该引物于ISmin开始出现扩增(图1)。LAMP反应条件的优化:选取Mg2+浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度和反应温度4个变量参数，进行单因素变化实验。Mg2+浓度优化:设置4个1%2+浓度梯度依次为4禮、61111、81111、IOmM ;甜菜碱浓度优化:设置4个甜菜碱浓度梯度依次为0.6M、0.8M、1.0M、1.2M ；dNTPs浓度优化:设置4个dNTPs浓度梯度依次为1.2mM、l.4mM、l.6mM、l.8mM ;反应温度优化:设置4个反应温度梯度依次为61 °C、63 °C、65 °C、67 °C。在反应进行时，采用浊度仪中该反应曲线的出峰时间和出峰高度作为评价的指标，对上述参数进行比较。得出最佳参数为:Mg2+浓度:6mM ;甜菜碱浓度:0.8M ；dNTPs浓度:1.6mM ;反应温度:63°C。根据上述数据,建立最佳反应体系，63°C恒温反应45min,然后在80°C灭活5min结束反应，如图2。实施例2、食品过敏原小麦成分LAMP特异性检测实验使用过敏原弓I物对供试36种植物和动物材料进行LAMP扩增，经过LAMP实时浊度仪检测，其中小麦出现明显的扩增曲线，而在其余的35种动植物样品中均未出现扩增曲线，如图3。根据食品过敏原小麦成分LAMP特异性检测的实时浊度检测结果，对上述供试材料进行显色法LAMP检测，结果显示:小麦反应液为绿色，其他动植物材料DNA反应液为橙色,如图4。实时浊度仪LAMP检测和显色法LAMP检测结果表明该LAMP引物和反应体系具有物种特异性。实施例3、过敏原小麦成分的LAMP检测灵敏度将纯小麦粉和玉米粉按重量比混合成小麦含量为:1%，0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%,
0.005%和0.001%的混合样品，提取DNA后用于LAMP检测，每个浓度重复3次，以实时浊度仪记录结果。实时浊度LAMP检测结果显示，1%,0.5%,0.1%,0.05%,0.01%小麦均出现扩增曲线，0.005%小麦和0.001%小麦未出现扩增曲线，该检测方法的检测限为0.01%，如图5。根据食品过敏原小麦成分LAMP灵敏度检测的实时浊度检测结果，利用LAMP显色法对0.05%小麦，0.01%小麦，0.005%小麦和0%小麦样品进行检测。LAMP显色法检测结果显示，0.05%小麦，0.01%小麦出现颜色反应，0.005%小麦未出现颜色反应，该检测方法的检测限是0.01%，如图6。实施例4、过敏原小麦成分的LAMP检测方法的稳定性实验用0.1%的小麦、0.01%的小麦品进行实时浊度LAMP检测，每个样品重复20次。实时浊度LAMP检测实验结果显示，该检测方法对于0.1%的小麦、0.01%的小麦样品均出现稳定扩增，该检测方法稳定性良好，如图7、图9。对0.1%的小麦、0.01%的小麦样品进行显色法LAMP检测，每个样品重复20次。检测结果表明，分别20个0.1%的小麦、0.01%的小麦样品均出现颜色反应，该检测方法稳定性良好，如图8、图10。
实施例5、食品中小麦原成分LAMP检测的应用在市场上收集含有小麦成分的制品(面粉、面包、蛋糕、面条、饼干、饺子、馒头等)20份，其他未含小麦成分的食品(面粉、面条、馒头等面制品，肉、肉肠、罐头等肉制品，牛奶、奶粉等奶制品，蛋制品，蔬菜制品、坚果、饮料等)50份。用新建立的检测方法对这70个样品进行浊度法和显色法LAMP检测。结果，20个标识含有小麦成分样品的检测结果与样品标签标识相符，在50个未标识含有小麦成分的样品中未检出小麦成分。结论本发明人经过深入研究，选择到合适的检测基因，并基于该基因选择合适的检测试剂，从而建立了食品过敏原小麦成分LAMP快速检测方法，方法的灵敏度高，检测限可达到0.01%小麦；方法特异性强，与对照组35种样品无交叉反应，操作步骤简单，检测时限短，结果判断准确，该检测方法的建立，对于加强食品过敏原标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。 在本发明提 及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种鉴定食品过敏原小麦成分的方法，其特征在于，所述方法包括: 以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增小麦GAG56D基因的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含食品过敏原小麦成分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增是环介导等温扩增。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的特异性扩增小麦GAG56D基因的引物包括:上游外引物SEQ ID NO: 1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQ ID N0:3，下游内引物SEQ ID N0:4，上游环引物SEQ ID NO: 5，下游环引物SEQ ID N0:6。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增包括:63土1°C恒温反应45 土 lOmin，然后在80 ± 2°C灭活5 土 lmin，结束反应。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增的体系中包括引物、Mg2+、甜菜碱、dNTPs ； 其中，Mg2+ 浓度 6±lmM ;甜菜碱浓度 0.8±0.IM ；dNTPs 浓度 1.6±0.2mM。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是食品。
7.一种引物，其特征在于，所述引物是LAMP扩增引物，包括:上游外引物SEQ ID NO:1,下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQ ID NO:3，下游内引物SEQ ID N0:4，上游环引物SEQ ID N0:5，下游环引物 SEQ ID N0:6。
8.权利要求7所述的引物的用途，用于从待测样品中鉴定食品过敏原小麦成分。
9.一种鉴定食品过敏原小麦成分的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求7所述的引物。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括: 含有小麦成分的检测标准品； DNA提取试剂； PH缓冲试剂； 钾离子溶液； 镁离子溶液； 铵离子溶液；Tween20 ； 甜菜碱； dNTP ； Bst大片段DNA聚合酶； 荧光染料；和/或 说明鉴定食品过敏原小麦成分的方法的使用说明书。
全文摘要
本发明涉及一种食品过敏原小麦成分LAMP现场快速检测方法。首次揭示一种食品过敏原小麦成分的LAMP检测方法。以小麦GAG56D基因作为鉴定的靶基因，并设计了特异性良好的LAMP扩增引物。本发明的方法可良好地应用于鉴定食品过敏原小麦成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK103160609SQ20131012447
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者张舒亚, 欧阳可栋, 宋青, 李富威 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局