动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重PCR检测试剂盒。本发明提供了检测细菌对酰胺醇类药物耐药性的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3和引物对4组成；本发明的实验证明，本发明根据细菌中主要的4个酰胺醇类药物耐药基因（cfr、fexA、fexB、floR）的核苷酸序列设计合成4对相应的特异性PCR引物，利用四重PCR对待检测细菌中酰胺醇类药物耐药基因进行扩增，具有高效、快速、成本低、实用性强等特点。
【专利说明】动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重 PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 抗生素药物在控制人类和动物传染性疫病以及降低传染病发病率和死亡率方面 起到了关键性作用。但随着动物饲养的集约化程度的逐渐提高，用药量不断增大，使得细菌 耐药性产生和传播更加迅速，从而为细菌性疾病的治疗带来了极大的挑战。目前细菌耐药 性问题已成为全球范围内临床用药、新型药物研究开发等领域最为热点的问题之一。
[0003] 酰胺醇类药物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，此类药物因其抗菌谱广、吸收 快、体内分布广泛在兽医临床上发挥着举足轻重的作用。酰胺醇类药物作用机制主要是通 过与50S亚基结合，阻断肽酰转移酶的作用，干扰带有氨基酸的氨基酰-tRNA终端与50S亚 基结合，从而使新肽链形成受阻，抑制蛋白质合成。
[0004] 随着对氯霉素和甲砜霉素的潜在毒性、残留和耐药性的研究的深入，包括中国在 内的许多国家已陆续禁止其在兽医临床上的应用。20世纪90年代，美国先灵-葆雅公司 研制的新合成酰胺醇类广谱抗生素投入市场，结构的改造与修饰使得氟苯尼考在安全性和 有效性方面比氯霉素和甲砜霉素有着明显的优势，主要用于治疗牛、猪、禽及鱼类的细菌性 疾病（大肠埃希氏菌、克雷伯氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、金 黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌及伤寒沙门氏菌等)。1999年4月氟苯尼考在我国批准上 市，广泛应用于畜禽养殖业，逐渐成为应用最广泛的兽用抗生素之一。但随着用药的增多， 临床上对氟苯尼考耐药的菌株也不断出现，这势必给临床治疗带来严重威胁。
[0005] 细菌耐药性检测对于指导临床精确用药，及时诊断治疗具有重要的意义。传统的 耐药检测是用纸片扩散法（K-B法)、MIC稀释法和E试验来检测细菌耐药的表型，虽然该方 法能够直观的观察到细菌对某种药物的敏感和耐药，但首先需要对细菌进行分离培养和纯 化，并且操作繁琐、经验依赖性强、耗时较长，远远不能够满足临床快速诊断和治疗的需要。 同时，由于传统的方法是在体外人为条件下对基因型的表达型进行检测，因此对其产生影 响的不确定因素较多，且仅能检测细菌的表型耐药特性，不能检测其隐型耐药性。
[0006] 随着越来越多的分子生物学技术被应用于耐药性的检测，不仅为临床耐药性检测 提供了快速敏感且更加可靠的方法，同时也在解释耐药机制方面起着关键作用，为开展动 物源病原菌耐药性监测与流行病学研究以及新型抗生素的开发研制提供了重要的科学依 据。起初，常规的PCR技术结合探针鉴定或电泳分析对单个耐药基因的检测上发挥了重要 的作用。但在临床上，即使是同一类抗生素的耐药也可能是由于不同的机制，即使是同一种 机制也可能是由不同的耐药基因引起的，并且由于一些耐药基因的可转移性，临床菌株显 示出越来越多的多重耐药，而传统的单重PCR由于检测指标单一，远不能满足临床检测的 要求，因此，多重PCR应运而生，实现了多目标的检测。
[0007] 多重PCR技术是在反应体系中加入多对引物进行PCR反应，同时扩增一份样本中 的不同DNA序列区域，一次反应能够富集多个目的基因片段，并根据电泳结果中不同长度 片段是否存在来判定是否含有目的基因。多重PCR因其高特异性、高效率、低成本的优势， 已被应用于生命科学的各个领域。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测细菌中耐药基因的引物组。
[0009] 本发明提供的检测或辅助检测细菌中耐药基因的引物组，由引物对1、引物对2、 引物对3和引物对4组成；
[0010] 所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单 链DNA分子组成；
[0011] 所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单 链DNA分子组成；
[0012] 所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单 链DNA分子组成；
[0013] 所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单 链DNA分子组成。
[0014] 上述引物组中，所述引物组中各条引物均为等摩尔比；
[0015] 所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；
[0016] 所述耐药基因为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。
[0017] 本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测细菌中耐药基因的PCR试剂。
[0018] 本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、PCR扩增缓冲液和水组成；
[0019] 所述引物组中的4种引物对中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为 0.2 μ mol/L ；
[0020] 所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；
[0021] 所述耐药基因具体为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。
[0022] 上述PCR扩增缓冲液为Premix Ex Taq溶液，购自Takara公司Code:D335A，其各 组分及浓度为1. 25U/25 μ 1的Taq聚合酶、浓度均为0. 4mmol/L的dNTP、浓度为4mmol/L的 Mg2.。
[0023] 本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测细菌中耐药基因的PCR试剂盒。
[0024] 本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述PCR试剂；所述耐药为耐酰胺醇 类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；
[0025] 所述耐药基因具体为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。
[0026] 上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测和/或辅助检测待测细菌是否 含有耐药基因中的应用；
[0027] 或上述的引物组或上述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐 药基因产品中的应用；
[0028] 或上述的引物组或上述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否耐酰胺 醇类药物产品中的应用；
[0029] 所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；上述 产品为试剂盒；
[0030] 所述耐药基因具体为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。
[0031] 本发明的第四个目的是提供一种检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐药基 因的方法。
[0032] 本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的引物组或上述PCR试剂对所述待测 样品进行四重PCR扩增，检测PCR产物；
[0033] 若得到的PCR产物具有200bp、348bp、534bp和683bp大小，则待测细菌含有或候 选含有4种耐药基因：floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因；若得到的PCR产物不具 有200bp、348bp、534bp和683bp任一种大小，则待测细菌不含有或候选不含有4种耐药基 因中任一种：floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因；
[0034] 若得到的PCR产物具有200bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR基因；若得 到的PCR产物不具有200bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有floR基因；
[0035] 若得到的PCR产物具有348bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB基因；若得 到的PCR产物不具有348bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有fexB基因；
[0036] 若得到的PCR产物具有534bp大小，则待测细菌含有或候选含有cfr基因；若得到 的PCR产物不具有534bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有cfr基因；
[0037] 若得到的PCR产物具有683bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexA基因；若得 到的PCR产物不具有683bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有fexA基因；
[0038] 若得到的PCR产物具有200bp和348bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR基 因和fexB基因；若得到的PCR产物不具有200bp和348bp大小，则待测细菌不含有或候选 不含有floR基因和fexB基因；
[0039] 若得到的PCR产物具有200bp和534bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR基 因和cfr基因；若得到的PCR产物不具有200bp和534bp大小，则待测细菌不含有或候选不 含有floR基因和cfr基因；
[0040] 若得到的PCR产物具有200bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR基 因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有200bp和683bp大小，则待测细菌不含有或候选 不含有floR基因和fexA基因；
[0041] 若得到的PCR产物具有348bp和534bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB基 因和cfr基因；若得到的PCR产物不具有348bp和534bp大小，则待测细菌不含有或候选不 含有fexB基因和cfr基因；
[0042] 若得到的PCR产物具有348bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB 基因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有348bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有 fexB基因和fexA基因；
[0043] 若得到的PCR产物具有534bp和683bp大小，则待测细菌含有或候选含有cfr基 因和fexA基因；若得到的PCR产物不具有534bp大小和683bp大小，则待测细菌不含有或 候选不含有cfr基因和fexA基因。
[0044] 上述方法中，所述四重PCR扩增的退火温度为55°C ;所述检测PCR产物的方法为 电泳检测或测序。
[0045] 本发明的第五个目的是提供一种引物对。
[0046] 本发明提供的引物对，为如下4种中的任一种：引物对1、引物对2、引物对3和引 物对4 ;
[0047] 所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单 链DNA分子组成；
[0048] 所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单 链DNA分子组成；
[0049] 所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单 链DNA分子组成；
[0050] 所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单 链DNA分子组成。
[0051] 本发明的实验证明，本发明根据细菌中主要的4个酰胺醇类药物耐药基因（cfr、 fexA、fexB、floR)的核苷酸序列设计合成4对相应的特异性PCR引物，利用四重PCR对待 检测细菌中酰胺醇类药物耐药基因进行扩增，可以一次性筛选出待测细菌是否含4个酰胺 醇类药物耐药基因中任一种或者多种，也可以用来鉴定待测细菌是否耐酰胺醇类药物；本 发明的引物及方法具有高效、快速、成本低、实用性强等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0052] 图1为四重PCR的扩增结果
[0053] 图2为菌株W9-2的扩增结果
[0054] 图3为菌株EF-01的扩增结果
【具体实施方式】
[0055] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0056] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0057] 下述实施例中所用的部分菌株及记载该菌株的文献来源及含有的耐药基因如表1 所示：
[0058] 表1为6株耐酰胺醇类药物菌株文献来源及含有的耐药基因
[0059]
【权利要求】
1. 检测或辅助检测细菌中耐药基因的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3和引物对 4组成； 所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链 DNA分子组成。
2. 根据权利要求1所述的引物组，其特征在于： 所述引物组中各条引物均为等摩尔比； 所述耐药为耐酰胺醇类药物； 所述耐药基因为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。
3. 检测或辅助检测细菌中耐药基因的PCR试剂，由权利要求1或2所述的引物组、PCR 扩增缓冲液和水组成； 所述引物组中的4种引物对中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0. 2 μ mol/ L ； 所述耐药为耐酰胺醇类药物； 所述耐药基因具体为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。
4. 检测或辅助检测细菌中耐药基因的PCR试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组 或权利要求3所述PCR试剂；所述耐药为耐酰胺醇类药物； 所述耐药基因具体为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。
5. 权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂或权利要求4所述的试剂 盒在检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐药基因中的应用； 或权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂在制备检测和/或辅助检 测待测细菌是否含有耐药基因产品中的应用； 或权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂在制备检测和/或辅助检 测待测细菌是否耐酰胺醇类药物产品中的应用； 所述耐药为耐酰胺醇类药物； 所述耐药基因具体为floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一种。
6. -种检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐药基因的方法，包括如下步骤：用权 利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂对所述待测样品进行四重PCR扩增， 检测PCR产物； 若得到的PCR产物具有200bp大小，则待测细菌含有或候选含有floR基因；若得到的 PCR产物不具有200bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有floR基因； 若得到的PCR产物具有348bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexB基因；若得到的 PCR产物不具有348bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有fexB基因； 若得到的PCR产物具有534bp大小，则待测细菌含有或候选含有cfr基因；若得到的 PCR产物不具有534bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有cfr基因； 若得到的PCR产物具有683bp大小，则待测细菌含有或候选含有fexA基因；若得到的 PCR产物不具有683bp大小，则待测细菌不含有或候选不含有fexA基因。
7. 根据权利要求6所述方法，其特征在于： 所述四重PCR扩增的退火温度为55°C ; 所述检测PCR产物的方法为电泳检测或测序。
8. -种引物对,为如下4种中的任一种：引物对1、引物对2、引物对3和引物对4 ; 所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链 DNA分子组成。
【文档编号】C12N15/11GK104099407SQ201310127290
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月12日 优先权日:2013年4月12日
【发明者】沈建忠, 吴聪明, 汪洋, 李君
申请人:中国农业大学