专利名称：一种饲用高效复合益生菌剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种饲料添加剂，尤其涉及一种由复合微生物组成的高效复合益生菌剂。
背景技术：
在现代饲养业中，饲料中添加抗生素始于五十年代，对防治疾病，促进生长，节省饲料，提高养殖经济效益起到重要作用。但是，随着饲料中长期大量地添加抗生素及化学合成药物，在养殖生产中出现了动物体内病原微生物产生耐药性，应用效果降低，生产成本加大；动物体内产生药物依赖，自身的免疫机能抑制，免疫力和抗病力降低；动物体内有益菌被抑制，菌群失调，形成内源性感染；动物产品及排泄物药物残留，危及人体健康；动物体内耐药菌的扩散，引起公共安全等重大问题，亟待解决。因此，从八十年代始，有关益生菌在养殖业的应用研究快速发展。目前，国内外益生菌研究涉列有益菌80余个品种。我国颁布的《饲料添加剂品种目录(2006)》准予使用有益菌共16个。国内市场推广的芽孢杆菌制剂有促菌生、整肠生、抑菌生、乳康生等；乳酸菌制剂以乳酸菌属和双歧杆菌属为主。益生菌作为一种新型天然的生物活性添加剂，无毒，无抗药性，无残留，并具有增强免疫力，促进生长，提高饲料利用率的功效，替代抗生素应用养殖生产中。目前，益生菌制剂应用于养殖生产，但在制备技术方面尚存在诸多问题:(I)产品标准不统一，生产企业自行设立标准，缺乏科学依据，益生菌含量过高或过低，影响使用效果；(2)生产菌种来源不明，大多数企业生产用菌种相互转接，没有经过分离选育，菌种退化严重，生理活性降低；(3)菌种配伍缺乏科学依据，单一菌株，双菌株，甚至多菌株随意配t匕，不能说明菌株间配伍的合理性 ，达不到菌株优良性状，通过合理配伍而互补，协同性差；生产工艺混乱，不能按菌种的不同生理特性区别培养，不少生产企业采用多菌种混合培养，不用发酵罐，甚者采用堆集发酵，致使益生菌生长少，杂菌丛生。
发明内容
为了解决以上益生菌制剂存在的配伍不科学、协同效果差的问题，本发明提供了一种配伍科学合理、相互协同作用效果好的高效复合益生菌制剂。本发明的另一个目的是提供所述高效复合益生菌制剂的制备方法。本发明所述的复合益生菌剂是由地衣芽孢杆菌Qkicillus licheniformis')、蹲热乳酸链球菌 iStreptococcus酿酒酵母菌{Saccharomyces cerevisiae沿分别发酵培养后按比例混合而成。所述地衣芽孢杆菌剂制备方法如下:
(I)地衣芽孢杆菌制剂
地衣芽孢杆菌菌剂制备方法如下:
在灭菌液体培养基上，按2%接种量接入活化的地衣芽孢杆菌，37°C通气发酵24小时，可得地衣芽孢杆菌制剂；
所述的液体培养基营养成分的质量体积比为:2%淀粉，1%豆饼水解液，2%玉米浆，1%麸皮，磷酸氢二钾0.25%,磷酸二氢钾0.1%，121°C灭菌30分钟；
所述的地衣芽孢杆菌，好氧生长，培养适温3(T31°C ;能分泌杆菌肽，具有广谱抗菌活性，能杀灭动物肠道内大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌；能够分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，促进饲料中蛋白质等大分子物质的分解吸收；能够耐热、耐酸，在饲料加工过程中和在动物体内胃酸、胆汁酸盐的环境下，能保持较高的生理活性，容易培养。( 2 )嗜热乳酸链球菌制剂 嗜热乳酸链球菌剂制备方法如下:
在灭菌的液体培养基中，以质量百分比5%接种量接入嗜热乳酸链球菌，37°C静止培养24小时，可得嗜热乳酸链球菌制剂；
所述的液体培养基营养物质体积比为:40%麦芽水解液，10%大豆水解液，10%无机盐溶液II，121。。灭菌30分钟； 所述的无机盐溶液II是指IOOOml溶液中含有醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g ；
所述的嗜热乳酸链球菌，厌氧或兼性好氧，生长温度4(T42°C，pH值5.5飞.2 ;在动物体内利用肠道内营养生长繁殖，与病原菌竞争营养物质，抑制病原菌生长繁殖；能够分泌乳链菌素，抑制和杀灭病原菌；代谢产生乳酸，乙酸，促进饲料中维生素D，钙、铁离子的吸收，增加营养。(3)酿酒酵母菌制剂
酿酒酵母菌菌剂制备方法如下:
在灭菌的固态培养基上，以10%接种量接入活化的酿酒酵母菌，3(T32°C固体发酵36^48小时，中间翻料2 3次，可得酵母菌制剂；
所述的固态培养基营养成分百分比为::40%苹果渣，10%麸皮，40%麦芽根，10%无机盐溶液I，适量的水，混合均匀，121°C灭菌30分钟；
所述的无机盐溶液I为:1000ml溶液中含有硫酸铵40g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸二氢钾0.8g、氯化钙0.02g、硫酸镁0.08g ；
所述的酿酒酵母菌菌体蛋白质含量高，能够耐受动物肠道内胃酸和胆汁酸盐而存活；在动物肠道内能够分泌嗜杀因子，杀灭肠道内的病原菌。(4)复合益生菌剂制备
复合益生菌剂制备方法为:地衣芽孢杆菌制剂3(Γ50份，嗜热乳酸链球菌制剂3(Γ50份，酿酒酵母菌制剂1(Γ40份混合而成液体型菌剂；用麸皮或稻壳吸附，风干或4(T50°C干燥可得益生菌固体型菌剂。所述复合益生菌剂中有效微生物含量为8 120X IO9 CFU/mL或6 150 X IO9 CFU/g 所述复合益生菌剂可以0.Γ0.5%的剂量添加到畜禽饲料或饮用水中使用。本发明的优点在于:
(I)分离筛选的菌种生理活性高，菌株间配伍的科学合理，菌株优良性状通过合理配伍而互补,协同性好,使动物体内有益微生物菌群平衡,能抑制和杀灭动物体内病原菌,逐渐取代饲料中添加的抗生素；(2)在动物体内益生菌分泌的杆菌肽、乳酸链球菌素及嗜杀因子，均为基因编码的肽类，而非菌类培养的次生物，在动物体内通过代谢自行分解为氨基酸等被吸收，无毒、无残留;
(3)根据每个菌株的生理特点，改进培养方法，培养过程中特别是地衣芽孢杆菌不容易感染噬菌体，适用工业化生产；
(4)促进动物消化吸收，减轻粪便臭味，改善饲养环境和生态环境。
具体实施例方式为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。实施例1:高效复合益生菌剂一液体型
(I)地衣芽孢杆菌菌剂的制备:
液体培养基(W/ν ):2%淀粉，1%豆饼水解液，2%玉米浆，1%麸皮，磷酸氢二钾0.25%,磷酸二氢钾0.1%，121。。灭菌30分钟。在灭菌培养基上，2%接种量接入活化的地衣芽孢杆菌，37°C通气发酵24小时，可得地衣芽孢杆菌制剂。(2)嗜热乳酸链球菌剂的制备:
液体培养基( W/ν):40%麦芽水解液，10%大豆水解液，10%无机盐溶液II (IOOOml溶液中含有醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g)，121°C灭菌30分钟。在灭菌的培养基中，以5% (重量百分比)接种量接入嗜热乳酸链球菌，37°C静止培养24小时，可得嗜热乳酸链球菌制剂。(3)酿酒酵母菌菌剂的制备:
固体培养基(W/W):40%苹果渣，10%麸皮，40%麦芽根，10%无机盐溶液I (1000ml溶液中含有硫酸铵40g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸二氢钾0.8g、氯化钙0.02g、硫酸镁0.08g)，适量的水，混合均匀，121 °C灭菌30分钟。在灭菌的培养基上，以10%接种量接入活化的酿酒酵母菌，3(T32°C固体发酵36^48小时，中间翻料2 3次，可得酵母菌制剂。将上述培养好的活菌制剂，按照地衣芽孢杆菌40份、嗜热乳酸链球菌40份、酿酒酵母菌20份的比例混合，即得液体剂型益生菌剂，有效活菌数达到74X IO8 CFU/mL。实施例2:高效复合益生菌剂一固体型
按实施例1方法制得液体型复合益生菌菌剂，和麸皮1:3混合，45°C干燥后即得固体型益生菌制剂，有效活菌数达到67X 108 CFU/mL。实施例3:肉鸡饲喂试验
实验选用I日龄AA肉仔鸡23158只，随机分为试验组、对照组两组。鸡群基础日粮相同，按正常程序免疫接种。对照组11610只，饲喂基础日粮中按常规添加抗生素，试验组11548只，基础日粮中添加lwt%实施例1制得的高效益生菌制剂。整个试验于21日龄、42日龄分别秤重统计。试验结果为:试验组仔鸡成活率92.21%，对照组为90.99%，成活率提高
1.22% ;平均料重比，试验组2.027，对照组2.161，料重比下降0.134，试验组饲料转化率提闻。
实施例4:小猪饲喂试验
实验选用保育出栏的杜X长X大三元小猪120头，根据性别比例、体重相近的原则，分成A、B、C、D四个组。其中A组为对照组，试验猪30头，不设重复，B、C、D组为试验组，各设两个重复，每组15头，公母各半，分头编号。各组基础日粮营养水平一致，试验期30天。A组饲喂基础日粮并按常规添加抗生素，B组在基础日粮中添加0.2wt%实施例2发酵培养得到的酿酒酵母菌，C组在基础日粮中添加0.4wt%实施例2发酵培养得到的嗜热乳酸链球菌剂，D组在基础日粮中添加1%实施例2制备的高效益生菌制剂。试验结果表明，平均日增重分别为，A组581克，B组604克，C组617克，D组658克，试验组D、C、B组分别比对照组A组多77克、36克、23克，D组对A组差异显著(P〈0.05)。实施例5:奶牛饲喂试验 试验选用年龄、胎次、产奶日龄、产奶量相近的荷斯坦奶牛83头，随机分为两组，实验组42头，对照组41头，基础日粮一致，预试期7天，试验期42天，饲喂方式和管理方法一致。对照组饲喂基础日粮，试验组在所喂基础日粮中添加lwt%实施例1制备的高效益生菌制剂，称量记录每头牛的每天泌乳量。试验结果表明，对照组全期平均每头牛每天产奶量30.20公斤，试验组为31.27。
权利要求
1.一种饲用高效复合益生菌剂及制备方法，其特征在于复合益生菌剂是由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)分别发酵培养后按比例混合而成。
2.如权利要求1所述的复合益生菌剂，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌制剂制备方法如下: 在灭菌液体培养基上，按2%接种量接入活化的地衣芽孢杆菌，37°C通气发酵24小时，可得地衣芽孢杆菌制剂； 所述的液体培养基营养成分的质量体积比为:2%淀粉，1%豆饼水解液，2%玉米浆，1%麸皮，磷酸氢二钾0.25%,磷酸二 氢钾0.1%，121 °C灭菌30分钟； 所述的地衣芽孢杆菌，好氧生长，培养适温3(T31°C ;能分泌杆菌肽，具有广谱抗菌活性，能杀灭动物肠道内大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌；能够分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，促进饲料中蛋白质等大分子物质的分解吸收；能够耐热、耐酸，在饲料加工过程中和在动物体内胃酸、胆汁酸盐的环境下，能保持较高的生理活性，容易培养。
3.如权利要求1所述的复合益生菌剂，其特征在于，所述嗜热乳酸链球菌制剂制备方法如下: 在灭菌的液体培养基中，以质量百分比5%接种量接入嗜热乳酸链球菌，37°C静止培养24小时，可得嗜热乳酸链球菌制剂； 所述的液体培养基营养物质体积比为:40%麦芽水解液，10%大豆水解液，10%无机盐溶液II，121℃灭菌30分钟； 所述的无机盐溶液II是指IOOOml溶液中含有醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g ； 所述的嗜热乳酸链球菌，厌氧或兼性好氧，生长温度4(T42°C，pH值5.5飞.2 ;在动物体内利用肠道内营养生长繁殖，与病原菌竞争营养物质，抑制病原菌生长繁殖；能够分泌乳链菌素，抑制和杀灭病原菌；代谢产生乳酸，乙酸，促进饲料中维生素D、钙、铁离子的吸收，增加营养。
4.如权利要求1所述的复合益生菌剂，其特征在于，所述酿酒酵母菌菌制剂备方法如下: 在灭菌的固态培养基上，以10%接种量接入活化的酿酒酵母菌，3(T32°C固体发酵36^48小时，中间翻料2 3次，可得酵母菌制剂； 所述的固态培养基营养成分百分比为::40%苹果渣，10%麸皮，40%麦芽根，10%无机盐溶液I，适量的水，混合均匀，121°C灭菌30分钟； 所述的无机盐溶液I为:1000ml溶液中含有硫酸铵40g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸二氢钾0.8g、氯化钙0.02g、硫酸镁0.08g ； 所述的酿酒酵母菌菌体蛋白质含量高，能够耐受动物肠道内胃酸和胆汁酸盐而存活；在动物肠道内能够分泌嗜杀因子，杀灭肠道内的病原菌。
5.如权利要求1所述的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂中益生菌比例为:地衣芽孢杆菌制剂3(Γ50份，嗜热乳酸链球菌制剂3(Γ50份，酿酒酵母菌制剂1(Γ40份混合而成液体型菌剂；用麸皮或稻壳吸附，风干或4(T50°C干燥可得益生菌固体型菌剂。
6.如权利要求书I所述的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂中有效微生物含量为 8 120 X IO8 CFU/mL*6 150X 108 CFU/g。
7.如权利要求书I所述的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂可以0.Γ0.5%的剂量添加 到畜禽饲料或饮用水中使用。
全文摘要
本发明公开了一种饲用高效复合益生菌剂及制备方法，属于生物技术领域。所述的复合益生菌剂由地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热乳酸链球菌(Streptococcusthermophilus)、酿酒酵母菌(SaccharomycescerevisiaeHansen)分别发酵培养后按比例混合而成，有效微生物数目达到8～120×108CFU/mL；所述复合益生菌剂菌株间配伍科学合理，能杀死或抑制动物体内的病原菌，促进饲料的消化吸收，能大大减少饲料中抗生素的使用。
文档编号C12N1/20GK103211085SQ201310141668
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者冠冰, 施安辉, 胥九兵, 孔健, 李克文, 刘海玉, 李方华 申请人:保龄宝生物股份有限公司