专利名称：一种单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人体骨髓、外周血或脐带血中单个核细胞和细胞因子体外分离试剂盒及其应用方法。
背景技术：
血液(包括脐带血和外周血)和骨髓中含有丰富的细胞因子、干细胞/祖细胞和成熟细胞，成熟的细胞包括红细胞、白细胞、血小板等。细胞因子主要存在于血浆及血小板中，通过富集可制备成富血小板血浆。干细胞/祖细胞为单个核细胞，因表面抗原的不同可分为一百多种。白细胞通常称为免疫细胞，是人体免疫系统的重要组成部分。白细胞可分为单个核白细胞和多个核白细胞，干细胞/祖细胞和白细胞中的单个核细胞的密度接近，通过一定的方法可将其分离出来。分离这些成分可诊断和治疗不同的疾病，因此具有重大意义。专利200610106875.5，一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法，采用目前国际国内从血液和骨髓中分离单个核细胞最普遍的方法——密度梯度离心法，该法操作简单、造价低廉、易于推广且纯度高。但缺点在于:第一、操作时间比较长，完成整个分离过程需2-3个小时；第二、需要人为界定单个核细胞层的位置，容易引起其他成熟细胞的残留；第三，分离液可能对人体产生影响。
发明内容
本发明目的是提供一种从血液(外周血或脐带血)和骨髓中分离单个核细胞或富含细胞因子的血浆体外分离试剂盒 ，该技术具有操作时间缩短、不需要人为界定单个核细胞层位置且对人体无影响、易于推广等特点。本发明采用的技术方案是:本发明提供一种单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒，所述试剂盒中包含有血液抗凝剂、泛影酸钠-聚蔗糖400#、隔离胶和细胞保养液，各试剂独立分开保存；所述隔离胶为聚丙烯酸丁酯与二氧化硅的混合物(不需要添加溶剂溶解)，所述混合物中聚丙烯酸丁酯质量终浓度为71.8 75.0% (优选71.8%)，即密度1.065 1.077g/ml的聚丙烯酸丁酯和二氧化硅的混合物。进一步，所述单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒中，每30ml待分离血液中，血液抗凝剂的用量为2.4 3.0ml (优选3.0ml)，泛影酸钠-聚蔗糖400#的用量为6.0
7.5ml (优选7.5ml)，隔离胶的用量为10 12g (优选IOgX进一步，每30ml待分离血液中，细胞保养液为8 25ml (优选10ml)。本发明所述的聚丙烯酸丁酯分子量优选为9X103 1X104’，更优选聚丙烯酸丁酯分子量9.59X 103。进一步,所述血液抗凝剂为质量浓度2.58%的枸橼酸钠水溶液,所述枸橼酸钠水溶液pH为6.5 8.5。
进一步，所述泛影酸钠-聚蔗糖400#泛影酸钠与聚蔗糖400#的混合水溶液，所述混合水溶液中泛影酸钠质量终浓度4.2 6.5%，聚蔗糖400#质量终浓度为9.0%，所述混合水溶液pH为8.8 9.0 (泛影酸钠与聚蔗糖400#混合水溶液的自然pH，无需调节)，溶剂为水。进一步，所述细胞保养液为pH为7.2 7.4的磷酸缓冲液。本发明还提供一种所述单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒的应用方法，所述方法为:无菌条件下采集骨髓、外周血或脐带血并加入血液抗凝剂形成抗凝血；将隔离胶与泛影酸钠_聚鹿糖400#混合后在1800g 2300g下离心3 5min(优选1800g,5min)以致形成泛影酸钠-聚蔗糖400#位于下层而隔离胶位于上层的分离体系，然后将抗凝血转移至分离体系内，在1200g 1800g下离心10 20min(优选1500g, 15min);吸取隔离胶以上部分液体，在300g 400g下离心3 6min,(优选350g, 5min),获得上清液a和沉淀a,取上清液a再在800g IOOOg下离心6 IOmin (优选860g, 8min),取上清液b即可获得富含细胞因子的血浆(即富血小板血浆)，取沉淀a用细胞保养液洗涤I次后，可获得单个核细胞；所述每30ml骨髓、外周血或脐带血中，血液抗凝剂的用量为抗凝剂的用量为2.4-3.0ml(优选3.0ml)，泛影酸钠-聚蔗糖400#的用量为6.0-7.5ml (优选7.5ml),隔离胶的用量为10-12g (优选10g)，细胞保养液的用量为8 25ml (优选10ml)。本发明中的试剂和胶均为无菌产品，在局部百级生物安全柜中进行无菌操作获得的富血小板血浆或单个核细胞可安全使用。本发明所述试剂盒内抗凝剂、泛影酸钠-聚蔗糖400#、隔离胶和细胞保养液的内毒素含量均< 0.5EU/ml。本发明所述聚蔗糖400#是一种合成水溶性高聚物，分子量为400000，聚丙烯酸丁酯为一种高分子化合物，分子量为9 X IO3-1 X IO4 (优选9.59X 103)。本发明所述上清液a和上清液b均为上清液，为便于区分不同步骤获得的上清液不同而命名，所述沉淀a为沉淀，为便于区分不同步骤获得的沉淀不同而命名，字母本身没有含义。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:本发明中的隔离胶可将血液中红细胞和泛影酸钠-聚蔗糖400#与单个核细胞层物理性隔开，不需要人为界定其分界面；本发明只需两次离心即可获得单个核细胞和富含细胞因子的血浆，且单个核细胞回收率
85%)，细胞存活率> 95%，细胞因子浓缩倍数> 6倍，简化了操作步骤，缩短了操作时间，整个过程只需I小时，国内市场上的产品(如宁夏中联达公司骨髓、脐带血有核细胞体外分离液)普遍在2.5-3小时；本发明的试剂盒可工业化生产，易于推广，能成为医生易施行的治疗方法的有效工具。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:本发明所述聚丙烯 酸丁酯的分子量9.59X IO3,聚鹿糖400#的分子量4000,购自武汉赛沃尔化工有限公司。实施例1:试剂盒组成:
1、血液抗凝剂:2.58wt%的枸橼酸钠水溶液，溶液pH为6.5 ;2、泛影酸钠-聚蔗糖400#:质量终浓度4.2%泛影酸钠和质量终浓度9%的聚蔗糖400# (分子量4000，购自武汉赛沃尔化工有限公司)组成的混合水溶液，混合水溶液pH为
8.8 ；3、细胞保养液:磷酸缓冲液(PBS)，pH为7.2 ;上述三种液体配置后经过滤除菌，灌装于医用西林瓶中，经过121°C，20分钟灭菌后分别存放在试剂盒中，且三种液体内毒素含量均< 0.5EU/ml。4、隔离胶:71.8wt%的聚丙烯酸丁酯(分子量9.59 X IO3)和28.2wt%的二氧化硅混合物，其密度为1.065g/ml ；上述隔离胶灌装于医用一次性注射器中，经辐照灭菌(25kGray钴-60 y射线照射)后存放于试剂盒中，内毒素含量均彡0.5EU/ml。使用所述的单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒制备富含细胞因子血浆(即富血小板血浆)及单个核细胞的方法，包括以下步骤:I)无菌条件下采集骨髓、外周血或脐带血30ml (含血液抗凝剂3ml)，形成抗凝血30ml ；2)将12g隔离胶推入50ml无菌离心管，加入泛影酸钠-聚蔗糖400#7.5ml，离心(2000g,4min),以致形成泛影酸钠-聚蔗糖400#位于下层而隔离胶位于上层的分离体系；3)然后将30ml抗凝后的骨髓、外周`血或脐带血转移至步骤2 )50ml无菌离心管内，离心(1200g, 20min)；4)吸取隔离胶以上部分液体至新的15ml无菌离心管，离心(300g，6min)，获得上清液a和沉淀a ；5)将上清液a转移至血清管，离心(800g，10min)，取上清液b即可获得富含细胞因子的血浆，即富血小板血浆，浓缩倍数为6-8倍。浓缩倍数检测:(1)取浓缩前的血样，用血细胞分析仪检测血小板的浓度(A)；
(2)取浓缩后的血样，用血细胞分析仪检测血小板的浓度(B) ;(3)浓缩倍数=B/A (参考文献:Elizaveta, Platelet-rich plasma:1ntra-articular knee injections producedfavorable results on degenerative cartilage lesions,knee surg sports traumatolarthrosc, 2010, 18，472-479 ;赵强，自制富血小板血浆治疗难治性创口，华西医学，2010，25(8)1457-1458)。6)取沉淀a用细胞保养液IOml洗涤I次后，可获得单个核细胞，回收率> 85%，细胞存活率> 95%。细胞回收率检测:(I)取分离细胞前的血样，用血细胞分析仪或显微镜手工计算单个核细胞的浓度，根据分离前的细胞总体积计算出单个核细胞的总数(A) ；(2)取细胞分离后的血样，用血细胞分析仪或显微镜手工计算单个核细胞的浓度，根据分离前的细胞悬液的总体积计算出单个核细胞的总数(B); (3)回收率=B/AX100%。(参考文献:王宁，安贵林，魏侃等，骨髓经羟乙基淀粉(!!ES)处理后分离和培养MSCs的初步探讨，实用手外科杂志，2006，20 (4)218-219)。细胞存活率检测:取一滴分离后的细胞悬液，用终浓度4%的台盼蓝染液染色3 5分钟，普通光学显微镜下，计数未被染成蓝色的细胞占总细胞数的百分比即为存活细胞的百分比。(参考文献:王宁，安贵林，魏侃等，骨髓经羟乙基淀粉(HES)处理后分离和培养MSCs的初步探讨，实用手外科杂志，2006，20 (4) 218-219)。用该试剂盒制备的富血小板血浆可用于治疗难愈合或不愈合的皮肤伤口、骨折，和软组织损伤、疼痛等机体组织的修复治疗，以及有关研究。制备的单个核细胞可用于干细胞扩增培养和免疫细胞诱导、诊断造血系统疾病、全基因组检测、抗肿瘤治疗和相关研究
坐寸o实施例2:试剂盒组成: 1、血液抗凝剂:2.58wt%的枸橼酸钠水溶液，溶液pH为8.5 ;2、泛影酸钠-聚蔗糖400#:质量终浓度6.2%泛影酸钠和质量终浓度9%的聚蔗糖400#组成的水溶液，水溶液pH为9.0 ;3、细胞保养液:磷酸缓冲液(PBS)，pH为7.4 ;上述三种液体配置后经过滤除菌，灌装于医用西林瓶中，经过121°C，20分钟灭菌后分别存放在试剂盒中，且三种液体内毒素含量均< 0.5EU/ml。4、隔离胶:75wt%的聚丙烯酸丁酯和25wt%的二氧化硅混合物，其密度为1.Qllg/ml ；上述隔离胶灌装于医用一次性注射器中，经辐照灭菌(25kGray钴-60 y射线照射)后存放于试剂盒中，内毒 素含量均彡0.5EU/ml。使用所述的单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒制备富含细胞因子(即富血小板血浆)及单个核细胞的方法，包括以下步骤:I)无菌条件下采集骨髓、外周血或脐带血30ml (含血液抗凝剂3ml)形成抗凝血；2)将IOg隔离胶推入50ml无菌离心管，加入泛影酸钠-聚蔗糖400#6.0ml，离心(1800g，5min)以致形成泛影酸钠-聚蔗糖400#位于下层而隔离胶位于上层的分离体系；3)然后将30ml抗凝后的骨髓、外周血或脐带血转移至步骤2)所述50ml无菌离心管内，离心(1500g, 15min)；4)吸取隔离胶以上部分液体至新的15ml无菌离心管，离心(350g，5min)，获得上清液a和沉淀a ；5)将上清液a转移至血清管，离心(860g，8min)，取上清液b即可获得富含细胞因子的血浆，即富血小板血浆，浓缩倍数为6-8倍(方法同实施例1)。6)将沉淀a用IOml细胞保养液清洗I次，即可获得单个核细胞沉淀备用，回收率彡85% (方法同实施例1)，细胞存活率彡95% (方法同实施例1)。用该试剂盒制备的富血小板血浆可用于治疗难愈合或不愈合的皮肤伤口、骨折，和软组织损伤、疼痛等机体组织的修复治疗，以及有关研究。制备的单个核细胞可用于干细胞扩增培养和免疫细胞诱导、诊断造血系统疾病、全基因组检测、抗肿瘤治疗和相关研究
坐寸o实施例3:试剂盒组成:1、血液抗凝剂:2.58wt%的枸橼酸钠水溶液，溶液pH为7.2 ;2、泛影酸钠-聚蔗糖400#:质量终浓度5.7%泛影酸钠和质量终浓度9%的聚蔗糖400#组成的混合水溶液，水溶液pH为8.9 ;3、细胞保养液:磷酸缓冲液(PBS)，pH为7.3 ;上述三种液体配置后经过滤除菌，灌装于医用西林瓶中，经过121°C，20分钟灭菌后分别存放在试剂盒中，且三种液体内毒素含量均< 0.5EU/ml。4、隔离胶:73.2wt%的聚丙烯酸丁酯和26.8wt%的二氧化硅混合物，其密度为1.070g/ml ；上述隔离胶灌装于医用一次性注射器中，经辐照灭菌(25kGray钴-60 y射线照射)后存放于试剂盒中，内毒 素含量均彡0.5EU/ml。使用所述的单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒制备富细胞因子血浆及单个核细胞的方法，包括以下步骤:I)无菌条件下采集骨髓、外周血或脐带血30ml (含血液抗凝剂2.8ml)形成抗凝血；2)将Ilg隔离胶推入50ml无菌离心管，加入泛影酸钠-聚蔗糖400#6.0ml，离心(2300g,3min)以致形成泛影酸钠-聚蔗糖400#位于下层而隔离胶位于上层的分离体系；3)然后将30ml抗凝后的骨髓、外周血或脐带血转移至步骤2)所述50ml无菌离心管内，离心(1800g, IOmin)；4)吸取隔离胶以上部分液体至新的15ml无菌离心管，离心(400g，3min)，获得上清液a和沉淀a ；5)将上清液a转移至血 清管，离心(1000g，6min)，取上清液b即可获得富含细胞因子的血浆，即富血小板血浆，浓缩倍数为6-8倍(方法同实施例1)。6)将沉淀a用IOml细胞保养液清洗I次，即可获得单个核细胞沉淀备用，回收率≥85% (方法同实施例1)，细胞存活率≥95% (方法同实施例1)。用该试剂盒制备的单个核细胞可用于干细胞扩增培养和免疫细胞诱导、诊断造血系统疾病、全基因组检测、抗肿瘤治疗和相关研究等。
权利要求
1.一种单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包含有血液抗凝剂、泛影酸钠-聚蔗糖400#、隔离胶和细胞保养液，各试剂独立分开保存；所述隔离胶为聚丙烯酸丁酯与二氧化硅的混合物，所述混合物中聚丙烯酸丁酯质量终浓度为71.8 75.0%。
2.如权利要求1所述单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒，其特征在于每30ml待分离血液中，血液抗凝剂的用量为2.4 3.0ml，泛影酸钠-聚蔗糖400#的用量为6.0 7.5ml，隔离胶的用量为10 12g。
3.如权利要求1所述单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒，其特征在于每30ml待分离血液中，细胞保养液的用量为8 25ml。
4.如权利要求1所述单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒，其特征在于所述的聚丙烯酸丁酯分子量为9 X IO3 1X104。
5.如权利要求1所述单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒，其特征在于所述血液抗凝剂为质量浓度2.58%的枸橼酸钠水溶液，所述枸橼酸钠水溶液pH为6.5 8.5。
6.如权利要求1所述单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒，其特征在于所述泛影酸钠-聚蔗糖400#为泛影酸钠与聚蔗糖400#的混合水溶液，所述混合水溶液中泛影酸钠质量终浓度为4.2 6.5%，聚蔗糖400#质量终浓度为9.0%，溶剂为水。
7.如权利要求1所述单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒，其特征在于所述细胞保养液为pH为7.2 7.4的磷酸缓冲液。
8.—种权利要求1所述单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒的应用方法，其特征在于所述方法为:无菌条件下采集骨髓、外周血或脐带血并加入血液抗凝剂形成抗凝血；将隔离胶与泛影酸钠-聚蔗糖400#混合后在ISOOg 2300g下离心3 5min以致形成泛影酸钠-聚蔗糖400#位于下层 而隔离胶位于上层的分离体系，然后将抗凝血转移至分离体系内，在1200g 1800g下离心10 20min ;吸取隔离胶以上部分液体，在300g 400g下离心3 6min,获得上清液a和沉淀a,取上清液a再在800g IOOOg下离心6 IOmin,取上清液b即可获得富含细胞因子的血浆，取沉淀a用细胞保养液洗涤I次后，可获得单个核细胞；所述每30ml骨髓、外周血或脐带血中，血液抗凝剂的用量为2.4 3.0ml，泛影酸钠-聚蔗糖400#的用量为6.0 7.5ml，隔离胶的用量为10 12g，细胞保养液的用量为8 25ml o
全文摘要
本发明公开了一种单个核细胞和细胞因子体外浓集试剂盒，所述试剂盒中包含有抗凝剂、泛影酸钠-聚蔗糖400#、隔离胶和细胞保养液，各试剂独立分开保存；所述隔离胶为聚丙烯酸丁酯与二氧化硅的混合物，所述混合物中聚丙烯酸酯质量终浓度为71.8～75.0%；本发明只需两次离心即可获得单个核细胞或富细胞因子的血浆，且回收率高，简化了操作步骤，缩短了操作时间；本发明的试剂盒可工业化生产，易于推广，能成为医生易施行的治疗方法的有效工具。
文档编号C12N5/078GK103194427SQ20131014298
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者鲍柳君, 吴诤 申请人:浙江星月生物科技股份有限公司