专利名称：一种工业黄酒酵母单倍体的分离方法
技术领域：
本发明属于生物工程和发酵技术领域，具体涉及一种工业黄酒酵母单倍体的高效分离方法。
背景技术：
工业黄酒酵母菌株大多数是从自然界或发酵产品中分离而来，这些野生型菌株多为二倍体甚至多倍体，其复杂的倍性给酵母改良、代谢工程改造和遗传研究带来了诸多困难，很难直接通过诱变处理或基因改造得到二倍体突变株，这是因为上述改造处理只能得到显性突变，许多隐性突变则被漏掉，且由于多倍体菌株缺少营养缺陷型等筛选标记，增加了改造难度，而以单倍体形式存在的黄酒酵母(如经改造的实验室黄酒酵母菌株)基因信息简单明了，交配能力 强，因此，一般先将二倍体或多倍体菌株通过生孢拆分获得单倍体菌株，首先对单倍体进行基因工程改造获得性状优良的突变株后再通过有性交配恢复为二倍体菌株。综上可见，单倍体的筛选分离是极为关键的一步。现有技术一般直接通过工业菌株生孢、蜗牛酶酶解以及YPD平板分离来获得单倍体，往往单倍体的分离率和成活率较低；此外，已有研究表明，黄酒酵母的HO基因能表达一种内切酶，在酵母生孢过程中将导致单倍体配型(a型或α型)转换，从而与周围的异型孢子结合恢复为二倍体，因此，HO基因具有活性的菌株不易分离出单倍体，而工业黄酒酵母HO基因一般具有活性，这就进一步增大了其单倍体的分离难度。鉴于此，寻找一种快速、高效的工业黄酒酵母单倍体分离方法十分必要。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本申请人经过研究改进，提供一种工业黄酒酵母单倍体的分离方法。本发明可快速、高效地分离获得不含外来抗性基因的工业黄酒酵母单倍体，具有单倍体分离率和成活率高、工艺简单、生产成本低的优点。本发明的技术方案如下:一种工业黄酒酵母单倍体的分离方法，是通过同源重组将所述工业黄酒酵母的HO基因进行了敲除；该分离方法具体操作步骤如下:(I)HO基因敲除组件的构建:首先利用普通PCR扩增得到黄酒酵母HO基因的上、下游同源臂扩增片段以及带有G418抗性标记的kanMX基因扩增片段，再通过降落PCR扩增得到上述三个片段的融合片段，最后利用普通PCR对所述融合片段进行特异性扩增即得黄酒酵母HO基因敲除组件；所述上游同源臂扩增片段包括上游同源臂序列及与kanMX基因5’端互补的序列(简称序列A)，所述下游同源臂扩增片段包括下游同源臂序列及与kanMX基因3’端互补的序列(简称序列B);所述kanMX基因扩增片段包括kanMX基因序列及位于该片段两端分别与上游同源臂序列3’端、下游同源臂序列5’端互补的序列(分别简称序列C和序列D);所述kanMX基因序列与所述序列C、序列D之间均含有可被Cre重组酶识别的1xp位点；所述序列A、序列B、序列C和序列D均为20 30bp ；
(2)黄酒酵母HO基因的敲除:将步骤(I)所得HO基因敲除组件转化工业黄酒酵母菌株，通过G418抗性筛选获得阳性转化子并鉴定；(3)黄酒酵母单倍体的分离:取步骤(2)中鉴定正确的阳性转化子接种于YPD培养基进行活化；收集酵母泥并将其堆积于生孢培养基，于26 28°C培养3 5d ;挑取所述生孢培养基上的菌落，经蜗牛酶酶解破壁处理得酶解菌液，振荡打散孢子，再涂布于YPD培养基于28 30°C培养至菌落长出，挑取菌落经鉴定正确后得到含有抗性基因kanMX的单倍体菌株；(4)抗性基因的切除:将含有Cre重组酶基因的工程质粒转化步骤(3)所得单倍体菌株，取阳性克隆转化子接种于半乳糖培养基连续培养5 10代，诱导Cre重组酶表达以切除抗性基因kanMX，得到抗性基因丢失菌株；将该菌株连续培养10代以上，丢失上述工程质粒，即得不含外来抗性基因的工业黄酒酵母单倍体菌株。其进一步的技术方案为:步骤(I)所述降落PCR扩增反应无引物参与，其扩增条件如下:95°C预变性4 5min，98°C变性10 15s，70°C退火15 30s，每个循环退火温度降低I°C，共15个循环，于72°C延伸2.5 3min，然后于55°C退火温度下再循环一次，最后于72°C再延伸5 lOmin。优选的，所述降落PCR的扩增条件如下:95°C预变性4min，98°C变性10s，70°C退火15s，每个循环退火温度降低1°C，共15个循环，于72°C延伸3min，然后于55°C退火温度下再循环一次，最后于72°C再延伸lOmin。步骤(I)所述上游同源臂扩增片段的扩增引物序列如SEQ ID N0:UPSEQ ID NO:2所示，步骤(I)所述下游同源臂扩增片段的扩增引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
步骤(I)所述kanMX基因扩增片段的扩增引物序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示。步骤(I)所述融合片段的特异性引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示。步骤(3)所述活化温度为30°C，培养时间24 36h。步骤(4)所述含有Cre重组酶基因的工程质粒选自pSH47、pSH62、pSH63或pSH65。步骤(4)所述半乳糖培养基含有100 μ g/mL的博来霉素(Zeocin)本发明的有益技术效果在于:本发明首先利用降落PCR和普通PCR成功构建得到高特异性黄酒酵母HO基因敲除组件(HO基因上游同源臂一筛选标记抗性基因kanMX——HO基因下游同源臂)并转化工业黄酒酵母，通过同源重组敲除黄酒酵母HO基因，从而大大降低了酵母单倍体的分离难度，再分离获得单倍体菌株，同时，利用半乳糖培养基诱导Cre重组酶的表达将kanMX基因切除，最终成功获得不含外来抗性基因的工业黄酒酵母单倍体菌株。与现有工业黄酒酵母单倍体分离方法相比:在HO基因敲除组件的构建中，本发明采用降落PCR融合各基因片段，只需进行一次PCR反应即可达到片段一次性融合的目的，无需添加任何引物，较之传统的基于融合PCR的基因敲除组件构建方法，省去了两两片段融合时繁琐的退火温度摸索过程，省时省力，能有效富集目的条带从而获得高特异性高纯度的HO基因敲除组件，融合效率高；本发明可快速、高效地分离获得不含外来抗性基因的工业黄酒酵母单倍体，具有单倍体分离率和成活率高、工艺简单、生产成本低的优点，为后续黄酒酵母代谢工程改造和遗传学研究奠定了物质基础。
图1为本发明实施例1中HO基因上、下游同源臂，kanMX基因扩增片段及HO基因敲除组件的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M:DNA分子量marker，I:H0L (490bp)，2:H0R (546bp)，3:kanMX 基因扩增片段(1697bp)，4:H0L-kanMX-H0R (2632bp)。图2为本发明实施例2中HO基因缺失转化子的PCR鉴定电泳图，其中，DNA分子量marker ;A5、B6分别为两个阳性转化子；N为阴性对照(2253bp)。图3为本发明实施例3中单倍体菌株及其配型的菌落PCR鉴定电泳图，其中，M:DNA分子量marker, a:a型单倍体(544bp), α: α型单倍体(404bp)。图4为本发明实施例4中抗性基因kanMX丢失的PCR鉴定电泳图，其中，M =DNA分子量marker，1:kanMX被切除后的H01/H02扩增片段(1028bp)。
具体实施例方式以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。以下实施例所涉及实验材料如下:菌株和质粒:工业黄酒酵母由国家黄酒工程技术研究中心提供，pYX212-kan质粒和pSH65质粒均可从商业途径购买获得。试剂和试剂盒:Prime STAR DNA Polymerase (2.5U/ μ L)、Ex Taq (5U/ μ L)MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit 均购自宝生物工程(大连)有限公司。
其他试剂和原料均为国产或进口分析纯产品。实施例1 实施例4实验中所使用引物序列及其作用如表I所示。表I引物序列表
权利要求
1.一种工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于通过同源重组将所述工业黄酒酵母的HO基因进行了敲除；该分离方法具体操作步骤如下: (1)HO基因敲除组件的构建:首先利用普通PCR扩增得到黄酒酵母HO基因的上、下游同源臂扩增片段以及带有G418抗性标记的kanMX基因扩增片段，再通过降落PCR扩增得到上述三个片段的融合片段，最后利用普通PCR对所述融合片段进行特异性扩增即得黄酒酵母HO基因敲除组件；所述上游同源臂扩增片段包括上游同源臂序列及与kanMX基因5’端互补的序列(简称序列A)，所述下游同源臂扩增片段包括下游同源臂序列及与kanMX基因3’端互补的序列(简称序列B);所述kanMX基因扩增片段包括kanMX基因序列及位于该片段两端分别与上游同源臂序列3’端、下游同源臂序列5’端互补的序列(分别简称序列C和序列D);所述kanMX基因序列与所述序列C、序列D之间均含有可被Cre重组酶识别的1xp位点；所述序列A、序列B、序列C和序列D均为20 30bp ； (2)黄酒酵母HO基因的敲除:将步骤(I)所得HO基因敲除组件转化工业黄酒酵母菌株，通过G418抗性筛选获得阳性转化子并鉴定； (3)黄酒酵母单倍体的分离:取步骤(2)中鉴定正确的阳性转化子接种于YH)培养基进行活化；收集酵母泥并将其堆积于生孢培养基，于26 28°C培养3 5d ;挑取所述生孢培养基上的菌落，经蜗牛酶酶解破壁处理得酶解菌液，振荡打散孢子，再涂布于YPD培养基于28 30°C培养至菌落长出，挑取菌落经鉴定正确后得到含有抗性基因kanMX的单倍体菌株; (4)抗性基因的切除:将含有Cre重组酶基因的工程质粒转化步骤(3)所得单倍体菌株，取阳性克隆转化子接种于半乳糖培养基连续培养5 10代，诱导Cre重组酶表达以切除抗性基因kanMX，得到抗性基因丢失菌株；将该菌株连续培养10代以上，丢失上述工程质粒，即得不含外来抗性基因的工业黄酒酵母单倍体菌株。
2.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于:步骤(I)所述降落PCR扩增反应无引物 参与，其扩增条件如下:95°C预变性4 5min，98°C变性10 15s，70°C退火15 30s，每个循环退火温度降低1°C，共15个循环，于72°C延伸2.5 3min，然后于55°C退火温度下再循环一次,最后于72°C再延伸5 lOmin。
3.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于:步骤(I)所述上游同源臂扩增片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示。
4.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于:步骤(I)所述下游同源臂扩增片段的扩增引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
5.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于:步骤(I)所述kanMX基因扩增片段的扩增引物序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
6.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于:步骤(I)所述融合片段的特异性引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:4所示。
7.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于:步骤(3)所述活化温度为30°C，培养时间24 36h。
8.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于:步骤(4)所述含有Cre重组酶基因的工程质粒选自pSH47、pSH62、pSH63或pSH65。
9.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于:步骤(4)所述半乳糖培养基含有100 μ g/mL的博来霉素。
全文摘要
本发明公开一种工业黄酒酵母单倍体的分离方法。该方法利用Cre/loxp组件和G418抗性标记kanMX基因构建了HO基因敲除组件并成功转化工业黄酒酵母，通过同源重组敲除黄酒酵母的HO基因，继而分离获得单倍体菌株，同时，利用半乳糖培养基诱导Cre重组酶的表达将kanMX基因切除，获得不含外来抗性基因的工业黄酒酵母单倍体。本发明可快速、高效地分离获得不含外来抗性基因的工业黄酒酵母单倍体，具有单倍体分离率和成活率高、工艺简单、生产成本低的优点，为后续黄酒酵母代谢工程改造和遗传学研究奠定了物质基础。
文档编号C12R1/865GK103194439SQ201310151599
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者陆健, 吴殿辉, 陈坚, 李晓敏, 谢广发, 申超 申请人:江南大学