专利名称：一种检测甘蔗黑穗病菌的实时荧光定量pcr方法
技术领域：
本发明涉及一种甘蔗病原菌的检测方法，具体涉及一种检测甘蔗黑穗病菌的实时荧光定量PCR方法，属于生物技术领域。
背景技术：
甘蔗黑穗病，又名甘蔗鞭黑穗病、黑粉病，此病最明显的特征是病株梢头长出一条黑色鞭状物。甘鹿黑穗病是由甘鹿黑穗病菌iSporisorium scitamineum)引起的一种气传真菌病害，其病原菌是真菌中的担子菌纲黑粉菌属的甘蔗黑粉菌。感染黑穗病菌的种蔗萌芽早，叶细长，淡绿，茎细小，分蘖增多，此后分蘖上也长出黑穗鞭。宿根病蔗和带菌土壤是甘蔗黑穗病的初侵染源。厚垣孢子借助气流、雨水、灌溉水和昆虫传播后落在甘蔗蔗芽上藏在鳞片间，遇水萌发形成侵染菌丝侵入蔗芽，菌丝经暂时休眠后随蔗芽萌发而恢复活动并随生长点向上蔓延，生长点受病菌刺激初期有白色鞭状物形成至厚垣孢子形成时抽出黑色鞭状物，产生的厚垣孢子再经媒介传播落到蔗茎的侧芽上，刺激蔗芽萌发，使甘蔗抽出侧枝或分蘖并长成鞭状物，潜伏 在蔗芽里的黑穗病菌丝和落入土壤中的厚垣孢子成为下一季甘蔗的初侵染源。土壤潮湿时，孢子48小时内几乎全部萌发，萌发孢子没有及时遇上蔗芽时则很快死亡。厚垣孢子在干燥的土壤中可以存活数月至I年。冬春干旱有利于孢子存活，春季高温多雨利于黑穗病发生和流行。宿根的蔗田比新植蔗田发病重，宿根年限越长，病害发生越严重，梢头苗种地较整株种地发病轻。迄今，甘蔗黑穗病已成为各植蔗区的最主要病害之一，且有逐年加重的趋势，严重年份造成甘蔗产量20 % 50 %的损失。由于甘蔗生长周期长、植株高大、病原孢子量大，培育和利用抗黑穗病品种已成为控制甘蔗黑穗病最经济有效的措施。国家“八五”科技攻关项目开始关注甘蔗黑穗病抗性研究，并自“九五”起，已经把抗黑穗病性作为甘蔗品种审(鉴)定的重要指标之一。在培育抗黑穗病甘蔗品种的过程中，甘蔗黑穗病菌检测技术的灵敏度和效率直接影响了抗黑穗病育种的进程。目前，甘蔗是否受病原侵染常用的判定方法主要是根据发病症状，通过发病率和病情指数调查来实现，国外还通过捕捉病原孢子确定病原数量的变化来预测病害的流行。上述传统方法虽然较为直观，但由于病原存在潜伏侵染，基于表型症状的判定方法并不能完全确定甘蔗是否受黑穗病菌侵染，也难以判断其中的孢子量，同时田间种植与数据收集还有成本高、周期长(需要在整个作物季的病害发生和流行期进行调查、收集，连同种植耗时8-10个月)、受环境和人为因素影响较大的问题，而捕捉病原孢子的方法，也容易受天气如风向、风量操作以及甘蔗植株大小与整齐度等方面的影响，不良的气候如下雨等还会进一步影响病原孢子的捕捉。此外，通过病菌分离纯化培养与病原形态学鉴定的传统方法，通常耗时也需一周，不利于及时进行检测、判定和控制。实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、操作简便、快速高效，还可进行多重检测，有效解决了传统PCR扩增只能终点检测的局限。本发明旨在利用实时荧光定量PCR方法在甘蔗黑穗病症状未出现前快速、灵敏地检测黑穗病菌，为甘蔗黑穗病菌快速检测和早期预防提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测甘蔗黑穗病菌的实时荧光定量PCR方法，可应用于甘蔗黑穗病抗性鉴定和田间甘蔗感染黑穗病菌的早期检测与诊断。本发明的目的通过以下技术方案实现。本发明的一种检测甘蔗黑穗病菌的实时荧光定量PCR方法，包括甘蔗基因组DNA提取、实时荧光定量PCR检测体系建立、实验有效性判定和实时荧光定量PCR检测；其特征在于:
Cl)实时荧光定量PCR检测体系建立:实时荧光定量PCR反应总体系为25 yL，包括
2X TaqMan Universal Master Mix 12.5 μ L, 10 μ mol/L 定量 PCR 检测引物 bEQ_F 和bEQ-R 各 I μ L, 10 μ mol/L Taqman 探针 0.2 yL，甘蔗 DNA 模板 I yL，ddH20 补至 25 μ L ；扩增程序为:50 °C, 2 min,95 °C，10 min ；95 °C，15 s，60 °C，1 min，40个循环，在60。。进行单点荧光检测；所述引物和Taqman探针的DNA序列如下:bEQ-F:5’-TGAAAGTTCTCATGCAAGCC-3’，bEQ-R:5’-TGAGAGGTCGATTGAGGTTG-3’ ；
Taqman 探针:5’ -FAM-TGCTCGACGCCAATTCGGAG-TAMRA-3’ ；
(2)实验有效性判定
同时具备a、b、c三个条件的实验为有效实验，否则为无效实验；所述a、b、c三个条件如下:a、空白对照，无Ct值且无扩增曲线；b、阴性对照，无Ct值且无扩增曲线；c、阳性对照的Ct值< 35.0，并出现典型的扩增曲线:如图1所示，所述典型的扩增曲线为S型动力学曲线；阈值线指以阴性对照样品扩增曲线的最高点为基准，与横坐标平行的一条直线；阈值线和典型的扩增曲线的交点所对应`的的荧光定量PCR扩增循环数为Ct值；空白对照指用等体积的ddH20代替模板DNA ;阴性对照为已知不含甘蔗黑穗病菌的样品；阳性对照为已知含甘蔗黑穗病菌的样品；
(3)实时荧光定量PCR检测
实时荧光定量PCR检测中，样品检测结果如下:
A、无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含甘蔗黑穗病菌；
B、Ct值<35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含甘蔗黑穗病菌；
C、当Ct值>35.0,则该样品做重复实验；重复实验结果无Ct值，则该样品中不含甘蔗黑穗病菌；若重复实验结果有Ct值，则该样品中含甘蔗黑穗病菌。一种利用实时荧光定量PCR检测甘蔗黑穗病菌数的方法，其特征在于利用上述Ct值和甘蔗黑穗病菌M质粒的稀释倍数构建标准曲线方程，计算待检样品中所含甘蔗黑穗病菌数。所述构建标准曲线方程，指以Ct值为纵坐标、甘蔗黑穗病菌M质粒稀释倍数为横坐标的标准曲线方程，其中，M质粒稀释倍数，指用现有技术获得已知浓度的甘蔗黑穗病菌bE质粒DNA，进行倍比梯度稀释。
本发明的优点如下:
1、首次根据甘蔗黑穗病菌M基因设计特异性定量PCR检测引物与探针，并通过NCBI数据库比对检索，确认与其他生物基因没有100 %—致性；
2、首次利用实时荧光定量PCR方法，通过构建的标准曲线方程，计算样品中黑穗病菌的数量；
3、本发明提供了特异性强、灵敏度高、操作简便、快速高效的甘蔗黑穗病菌检测体系，可应用于田间甘蔗黑穗病的早期诊断和甘蔗抗黑穗病性鉴定。
图1为甘蔗黑穗病菌实时荧光定量PCR检测示意图。横坐标代表定量PCR扩增循环数，纵坐标代表荧光信号强度，I代表阈值线，2代表典型的扩增曲线，3代表阈值线I与扩增曲线2的交点(3所对应的定量PCR循环数，即为Ct值)，4代表阴性对照样品扩增曲线，5代表阴性对照样品扩增曲线的最高点。图2为8个10倍梯度稀释的甘蔗黑穗病菌bE质粒DNA标准品实时荧光定量PCR的扩增曲线示意图。横坐标代表定量PCR扩增循环数，纵坐标代表荧光信号强度。 图3为M质粒DNA标准品实时突光定量PCR扩增的标准曲线示意图。横坐标代表bE质粒DNA梯度稀释的倍数(10_3 10_1(1)，纵坐标代表定量PCR扩增循环数Ct值。图4为黑穗病菌普通PCR检测极限浓度的电泳结果示意图。M为100 bp DNALadder marker，I 8 为拷贝数 1.987 X IO8 1.987 X IO1 copies/μ L 8 个 10 倍梯度稀释的bE质粒DNA标准品的普通PCR扩增产物。图5为田间甘蔗黑穗病发病植株R0C22 +1叶中黑穗病菌普通PCR检测极限浓度的电泳结果示意图。其中，I 5代表染病甘蔗+1叶基因组0嫩浓度从500、100、20、4和0.8ng/uL 5倍梯度稀释后的扩 增结果；6代表阳性对照，7代表阴性对照，8代表空白对照。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。本发明使用的各种生化试剂、PDA培养基和链霉素均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，荧光定量PCR试剂购自Roche公司；PMD18-T载体、TAKALA Ex 、荧光定量PCR引物与探针均购自TAKALA公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；Marker、大肠杆菌DH5ci购自天根生化科技(北京)有限公司；测序完成于生工生物工程(上海)股份有限公司。实施例一、一种检测甘蔗黑穗病菌的实时荧光定量PCR方法 1、甘蔗基因组DNA的提取
采用CTAB法提取基因组DNA，具体操作如下:
(1)将7个待测甘蔗样品分别用体积浓度为75%酒精擦拭后，放在研钵中，用液氮研磨成细粉，分装于2 mL离心管，每个离心管装样量0.2 g ;
(2)加入900μ L经65 °C预热的2XCTAB提取液振荡混匀，于65 °C水浴中温育60min,每隔5 10 min颠倒混勻一次；
(3)水浴后取出离心管12，000rpm/min,离心5 min。吸取上清液750 μ L于新的2 mL离心管，加入等体积苯酹/氯仿/异戍醇(体积比为25:24:1),振荡，12，000 rpm/min,室温离心10 min ；
(4)取上清液600μ L，转入新的1.5 mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(体积比为 24:1),振荡，12，000 rpm/min,室温离心 10 min ；
(5)吸取上清液500μ L，转入新的1.5 mL离心管中，加入等体积-20 °C预冷的异丙酉享，摇晃沉淀 DNA, 10，000 rpm/min, 4 °C离心 5 min ；(6)取出离心管，弃液相，加1，OOOUL 4 °C预冷的体积浓度为75 %乙醇洗涤沉淀两次，无水乙醇洗漆一次，弃液相，超净工作台干燥15 20 min ；
(7)加入100 μ L ddH20 (含 RNase A 100 μ g/mL) 37 °C水浴 30 min，电泳检测并测定OD值，-20 °C保存备用。2、实时荧光定量PCR检测体系建立
实时荧光定量PCR反应总体系为25 μ L，包括2XTaqMan Universal Master Mix 12.5μ L, 10 μ mol/L 定量 PCR 检测引物 bEQ-F 和 bEQ-R 各 I μ L, 10 μ mol/L Taqman 探针 0.2μ L，甘蔗 DNA 模板 I yL，ddH20补至 25 μ L ;扩增程序为:50 °C,2 min,95 °C,10 min ；95°C, 15 s，60 °C, I min，40个循环，在60 °C进行单点荧光检测；所述引物bEQ-F、bEQ-R与Taqman探针，是以甘蔗黑穗病菌bE基因序列为基础，设计的甘蔗黑穗病菌特异性定量检测序列，引物和探针的DNA序列如下:
bEQ-F:5’-TGAAAGTTCTCATGCAAGCC-3’，bEQ-R:5’-TGAGAGGTCGATTGAGGTTG-3’ ；
Taqman 探针:5’ -FAM-TGCTCGACGCCAATTCGGAG-TAMRA-3’。3、实验有效性判定
同时具备a、b、c三个条件的实验为有效实验，否则为无效实验；所述a、b、c三个条件如下:a、空白对照，无Ct值且无扩增曲线；b、阴性对照，无Ct值且无扩增曲线；c、阳性对照的Ct值彡35.0，并出现典型的扩增曲线。4、实时荧光定量PCR检测
实时荧光定量PCR检测中，样品检测结果如下:
A、无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含甘蔗黑穗病菌；
B、Ct值<35.0,且出现典型的扩增曲线，表示样品中含甘蔗黑穗病菌；
C、当Ct值>35.0,则该样品做重复实验；重复实验结果无Ct值，则该样品中不含甘蔗黑穗病菌；若重复实验结果有Ct值，则该样品中含甘蔗黑穗病菌。5、实时荧光定量PCR检测甘蔗黑穗病菌数
(I)甘蔗黑穗病菌M基因的克隆及标准曲线构建
以甘蔗黑穗病菌基因组DNA为模板，利用黑穗病菌基因组DNA检测引物bE4:5’ -CGCTCTGGTTCATCAACG-3’ 与 bE8:5’ -TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3’，PCR 扩增，体系为:模板DNA (100 ng/μ L)1 μ L, IQXEx Taq Buffer (Mg2+ Plus)2.5 μ L, dNTP (2.5 mmol/L)2.0μ L，位 7 酶(5 U/μ L)0.125 μ L, 10 μ mol/L 正反向引物 bE4 和 bE8 各 I yL，ddH20 补至25 μ L0 PCR扩增程序:94 °C预变性4 min ；94 °C变性30 S，55 °C退火30 S，72 °〇延伸30 S，循环35次；72 °C再延伸10 min。扩增产物在含溴化乙锭(EB)的1.5 %琼脂糖凝胶中进行电泳，并胶回收纯化M基因片段，连接至PMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5 α，然后挑选阳性克隆，提取质粒DNA，测序并在NCBI数据库上比对无误后，保存备用。所提取的质粒DNA即为甘蔗黑穗病菌bE基因，测定质粒DNA浓度，-20 1:保存备用。根据公式:
MW=喊基数 X 660 dalton/bp copies/mL=6.02X IO23X (浓度 g/mL)/(MW g/mol)
将已知浓度的bE质粒DNA转化为包含相应黑穗病菌DNA的拷贝数。如对于本实验中长度为459 bp，浓度为100 ng/ μ L的双链bE质粒DNA，采用以上计算公式得黑穗病菌DNA拷贝数相当于1.987 X IO11 copies/μ Lo以定量后的该M质粒DNA( 1.987 X IO11 copies/μ L)为标准品,进行10倍梯度稀释，即Iv标准品原液i+9v ddH20,得标准品ii ；lv标准品ii+9v ddH20，得标准品iii，以此类推，获得拷贝数10_3 10,的标准品。然后取终浓度为
1.987 X IO8 1.987 X IO1 copies/ μ L的8个M质粒DNA稀释液为模板，实验均采用3次重复，利用建立的实时荧光定量PCR检测体系制作标准曲线。
实验中8个经10倍梯度稀释的bE质粒DNA标准品按上述实时荧光定量PCR检测体系获得的扩增曲线如图2所示，Ct值在14 37之间，定量PCR可以检测到黑穗病菌，其稀释限点为10 ag/μ L，对应的Ct值为36.283，利用Excel软件将实验数据生成标准曲线如图3所示。正常的标准曲线需满足:R2 (标准曲线相关系数)>0.99,-3.5〈slope (标准曲线斜率)<-3.0,0.9〈eff iciency [反应扩增效率(E) =10H/IW)-1] <1.2。本实验在bE质粒DNA拷贝数为1.987 X IO8 1.987 X IO1 copies/μ L的范围有良好的线性关系，构建的标准曲线 R2 为 0.9969，slope 为-3.2556，efficiency 为 1.0284，得出 M 质粒 DNA 标准品拷贝数与Ct值的线性方程，即标准曲线方程为:y= -3.2556x+4.6029 (其中，x代表M质粒DNA梯度稀释的倍数，y代表Ct值)。(2)甘蔗黑穗病菌数检测
以甘蔗品种福农40号(FN40)为例。实验取经过组织培养四个月且壮苗生根后的FN40生长健壮、长势一致的蔗苗，清水复性培养10 d后，采用0.5 μ L的微量进样器以5X IO6个/mL黑穗病孢子悬浮液针刺注射接种0.5 μ L于蔗苗假茎基部往上0.5 2.0 cm茎尖生长点处，置于光照培养箱中，光照12 h，黑暗12 h，温度为28 °C，湿度65 %培养。从接种后的第 O h (样品 I)、12 h (样品 2)、24 h (样品 3)、48 h (样品 4)、120 h (样品 5)、168 h (样品6)和336 h (样品7)，分别采集3株蔗苗接种部位及以上的茎杆，按CTAB法提取基因组DNA。以样品I和健康的甘蔗组培苗FN39叶片基因组DNA (I μ g/μ L)为阴性对照，以黑穗病菌基因组DNA (100 ng/μ L)为阳性对照，ddH20为空白对照，FN40接种材料的DNA检测终浓度为I μ g，实验均采用3次重复进行定量PCR扩增。对照实验结果中，阴性对照无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含甘蔗黑穗病菌；阳性对照Ct值为15.774，小于35.0,且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有甘蔗黑穗病菌；空白对照无Ct值且无扩增曲线。因此，本次实验结果符合实验有效性的三个条件，实验是有效的。应用上述构建的实时荧光定量PCR检测体系和标准曲线方程，根据甘蔗待测样品Ct值(y)，从标准曲线中求得相应的黑穗病菌M质粒DNA的稀释倍数(X)，最终计算获得所含甘蔗黑穗病菌DNA拷贝数(copies)。由于100 ng/μ L的双链M质粒DNA，采用上述公式“MW=喊基数 Χ660 dalton/bp, copies/mL=6.02X IO23X (浓度 g/mL) /(MW g/mol) ”计算得出黑穗病菌DNA拷贝数相当于1.987X1011 copies/μ L，所以待测样品甘蔗黑穗病菌DNA 拷贝数 Copies=IOxX 1.987Χ IO110实时荧光定量PCR检测甘蔗黑穗病菌数结果显示，FN40接种黑穗病菌以后，甘蔗黑穗病菌DNA拷贝数随采集时间变化如表I所示。可以在接种后的样品2中检测到黑穗病菌DNA，此时Ct值为35.214，对应的黑穗病菌DNA拷贝数为8.300 X IO1 copies/ μ L。在样品2至样品6之间，随着接种时间的延长，黑穗病菌量呈上升趋势；样品3和样品4黑穗病菌含量分别为4.951 X IO2 copies/μ L和8.462 X IO2 copies/μ L ;样品6黑穗病菌DNA拷贝数达到最大值(1.293Χ104 copies/yL);之后开始下降，样品7黑穗病菌DNA拷贝数为3.407 X IO3 copies/μ L。实验结果表明，黑穗病菌于甘蔗接种后的48 h 168 h为甘蔗抗性水平发挥作用的关键时期，决定了黑穗病菌的扩展速度，因此，这个时间可能是甘蔗与黑穗病菌互作的关键时期。本结果检测了甘蔗黑穗病菌数量的动态变化，为人工接种条件下甘蔗黑穗病菌的快速定量提供了可靠的方法，同时也为田间甘蔗黑穗病菌的早期诊断及病害流行发生提供有效预测及防治依据。表I甘蔗黑穗病菌实时荧光定量PCR检测Ct值与对应的菌量
权利要求
1.一种检测甘蔗黑穗病菌的实时荧光定量PCR方法，包括甘蔗基因组DNA提取、实时荧光定量PCR检测体系建立、实验有效性判定和实时荧光定量PCR检测；其特征在于: Cl)实时荧光定量PCR检测体系建立:实时荧光定量PCR反应总体系为25 yL，包括2XTaqMan Universal Master Mix 12.5 μ L, 10 μ mol/L 定量 PCR 检测引物 bEQ_F 和bEQ-R 各 I μ L, 10 μ mol/L Taqman 探针 0.2 yL，甘蔗 DNA 模板 I yL，ddH20 补至 25 μ L ；扩增程序为:50 °C, 2 min，95 °C，10 min ；95 °C，15 s，60 °C，1 min，40个循环，在60。。进行单点荧光检测；所述引物和Taqman探针的DNA序列如下:bEQ-F:5’-TGAAAGTTCTCATGCAAGCC-3’，bEQ-R:5’-TGAGAGGTCGATTGAGGTTG-3’ ；Taqman 探针:5’ -FAM-TGCTCGACGCCAATTCGGAG-TAMRA-3’ ； (2)实验有效性判定:同时具备a、b、c三个条件的实验为有效实验，否则为无效实验；所述a、b、c三个条件如下:a、空白对照，无Ct值且无扩增曲线；b、阴性对照，无Ct值且无扩增曲线；c、阳性对照的Ct值< 35.0，并出现典型的扩增曲线；所述典型的扩增曲线为S型动力学曲线；阈值线指以阴性对照样品扩增曲线的最高点为基准，与横坐标平行的一条直线；阈值线和典型的扩增曲线的交点所对应的的荧光定量PCR扩增循环数为Ct值；空白对照指用等体积的ddH20代替模板DNA ;阴性对照为已知不含甘蔗黑穗病菌的样品；阳性对照为已知含甘蔗黑穗病菌的样品； (3)实时荧光定量PCR检测:实时荧光定量PCR检测中，样品检测结果如下: A、无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含甘蔗黑穗病菌； B、Ct值<35.0，且 出现典型的扩增曲线，表示样品中含甘蔗黑穗病菌； C、当Ct值>35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无Ct值则该样品中不含甘蔗黑穗病菌；若重复实验结果有Ct值，则该样品中含甘蔗黑穗病菌。
2.一种利用实时荧光定量PCR检测甘蔗黑穗病菌数的方法，其特征在于利用权利要求1的Ct值和甘蔗黑穗病菌M质粒的稀释倍数构建标准曲线方程，计算待检样品中所含甘蔗黑穗病菌数。
全文摘要
本发明涉及一种检测甘蔗黑穗病菌的实时荧光定量PCR方法，包括甘蔗基因组DNA提取、实时荧光定量PCR检测体系建立、实验有效性判定和实时荧光定量PCR检测。本发明根据甘蔗黑穗病菌bE基因设计特异性定量PCR检测引物与Taqman探针，利用实时荧光定量PCR方法，通过构建的标准曲线方程，计算待检样品中黑穗病菌的数量；本发明提供一种特异性强、灵敏度高、操作简便、快速高效的甘蔗黑穗病菌检测方法，可应用于甘蔗黑穗病抗性鉴定和田间甘蔗感染黑穗病菌的早期检测与诊断。
文档编号C12Q1/06GK103205504SQ20131015376
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者苏亚春, 许莉萍, 阙友雄, 薛扳佟, 郭晋隆, 林庆良 申请人:福建农林大学