编码gpc-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc-3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞的制作方法
【专利摘要】编码表达于人T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体scFv(GPC3)。
【专利说明】编码GPC-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达GPC-3嵌合抗 原受体蛋白的T淋巴细胞
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤细胞治疗领域，更具体地，涉及对特异性表达GPC3的上皮来源的 肿瘤的转基因 T淋巴细胞治疗领域。
【背景技术】
[0002] 磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3, GPC3,又称 DGSX，GTR2-2, MXR7, 0CI-5， SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基 因编码产生70-kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶（furin)剪切产生 40-kDa左右的可溶性的能够进入血液的氨基端（N末端）肽和30-kDa左右含有2个硫酸 乙酰肝素（HS)糖链的膜结合的羧基端（C末端）肽。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇（GPI) 锚依附在细胞膜上。
[0003] GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中 恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且 随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而GPC3的表达在肝腺癌，胆管细胞癌，肝转移癌和 12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢 透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。考虑到GPC3在肝细胞肝癌，黑色素瘤 等肿瘤中特异性的高表达，其被认为是肿瘤免疫治疗的一个候选靶标。
[0004] 利用抗GPC3抗体进行肝癌检测和利用抗GPC3抗体的抗体依赖的（ADCC)或补体 依赖的（CDC)细胞毒性研究方案已有报道。一般用于治疗的抗体识别的是GPC3蛋白的C 末端。然而，抗体治疗存在着抗体在体内血液循环中半哀期的限制，一般来说，半哀期大多 在23天以内。因此，持续给药和/或增大给药剂量是肿瘤抗体治疗所要求的，这导致患者 治疗成本的增加，以及某些情况下，甚至不得已终结治疗。另外，治疗性抗体作为异源蛋白， 还有可能在体内产生过敏反应及针对该治疗性抗体的中和性抗抗体的风险。
[0005] T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于T淋巴细胞的过继性 免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的 上述缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意[Grupp SA，et al. Adoptive cellular therapy.Curr Top Microbiol Immunol.，.2011;344:149-72·]。近年来，根据 CTL 对革巴 细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体（T Cell Rec印tor，TCR)的发现，将针对肿瘤细 胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3 ζ或Fc ε RI γ等胞内信号激活基序融 合成嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor, CAR),并将其通过如慢病毒感染等方式 基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CAR T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物（Major Histocompatibility Complex, MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细 胞并特异性地杀伤肿瘤。CAR T淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略 [Schmitz M,et al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer. J Biomed Biotechnol,2010, doi ：10. 1155/2010/956304.]〇
[0006] 嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别 肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪 氨酸活化基序（ITAM)⑶3 ζ或Fc ε RI γ及共刺激信号分子⑶28、⑶137、⑶134等的胞内信 号区。
[0007] 胞内信号区仅包含ΙΤΑΜ的为第一代CAR Τ淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分 按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CAR T可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细 胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[Zhang T.et al. Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Can Res2007,67 (22)： 11029-11036.]。
[0008] 随后发展的第二代CAR T淋巴细胞加入了⑶28或⑶137(又名4-1BB)的胞内 信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-⑶28-ITAM或scFv-TM-/ ⑶137-ITAM。胞内信号区发生的B7/⑶28或4-1BBL/⑶137共刺激作用引起T淋巴细胞的持 续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN- γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T在 体内的存活周期和抗肿瘤效果[Dotti G.et al.CD28costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest,2011,121 (5) ： 1822-1826. ]〇
[0009] 近些年发展的第三代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连 接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM 或 scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了 CAR T 在体 内的存活周期和其抗肿瘤效果[Carpenito C·，et al. Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137domains. PNAS，2009,106(9) :3360-3365.]。
[0010] 尽管CAR T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但一些潜在的风险亦需 要考虑。比如，由于某些/种正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CAR T 淋巴细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。如，针对肾细胞癌患者肿瘤细胞上表达的抗 原碳酸酐酶IX (CAIX)是第一个用于临床的CAR T淋巴细胞过继治疗的案例，也是第一个 报道含CAR细胞的脱靶效应的案例。病人在多次输入CAR T淋巴细胞后出现2-4级肝毒 性。分析原因为肝胆管上皮细胞低表达CAIX，原临床试验被迫中断同时排除了病人治疗效 果的任何评价[Stoter G. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX ：first clinical experience. J clin oncol，2006,24 (13) ：e20-e22. ；Ngo MC.，et al. Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics，2011，Rl-R7]。另外，CAR中过多的共刺激信号会降低效应细胞激 活所需的阈值，使得基因修饰的T淋巴细胞在低水平抗原或没有抗原触发的条件下也可 能会被活化，导致大量细胞因子的释放以致可能引发所谓的"细胞因子风暴"。这种信号 外漏（singnal leakage)会导致脱祀细胞毒性，从而产生非特异性的组织损伤。例如，在 采用针对Her2的第三代CAR临床治疗一个具有肝和肺转移的晚期结肠癌患者的过程中 由于正常肺组织中低表达Her2而引发所谓的"细胞因子风暴"致病人猝死[Morgan RA.， et al. Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2. Molecular Therapy，2010,18(4) :843-851.]。
[0011] 因此，本领域存在着对克服上述缺陷的编码GPC3嵌合抗原受体蛋白的淋巴细胞 肿瘤治疗方案的强烈需求。
【发明内容】
[0012] 本发明的第一方面涉及编码一种表达于T淋巴细胞表面的GPC3嵌合抗原受体蛋 白的核酸，其表达的嵌合抗原受体蛋白使得表达该受体的T淋巴细胞针对高表达GPC3的肿 瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。所述GPC3嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞 外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位 的单链抗体scFv (GPC3)。上述嵌合抗原受体蛋白的胞外结合区通过⑶8铰链区与⑶8或者 CD28的跨膜区相连接，跨膜区后紧接胞内信号区。
[0013] 本发明的核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明 的编码嵌合抗原受体蛋白氨基酸序列的核酸密码子可以是简并的，即编码同一氨基酸序 列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对应氨基酸的简并核酸密码子是 本领域公知的。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序 列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变 异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异 体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸 的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0014] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少 70%，更佳地至少80%，最佳地至少90 %或至少95 %相同性的多核苷酸。本发明特别涉及 在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指： (1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如〇. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C ;或（2)杂 交时加有变性剂，如50% (v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或⑶仅 在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交 的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO :22-25之一所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活 性。
[0015] 特异性识别人GPC3的C末端表位的单克隆抗体已被公开在例如，中国专利文献 CN101186650A 中外制药株式会社），此外据文献 Advances in Liver Cancer Antibody Therapies ：A Focus on Glypican_3and Mesothelin, BioDrugs. 2011 Octoberl ；25 (5)： 275-284其他已知特异性识别C末端表位的单克隆抗体包括GC33和hGC33也分别被报道， 其针对GPC3的抗原决定簇位于C端524-563位氨基酸残基，同时被报道的还包括GPC3-C02 和1G12等单克隆抗体。这些被公开的单克隆抗体可以用于制备本发明的核酸所编码的嵌 合抗原受体蛋白中的单链抗体部分。其他识别GPC3的C末端表位的单克隆抗体也可以合 适的方式运用于本发明。
[0016] 单链抗体scFv (GPC3)可以根据上述公开的GPC3单克隆抗体的序列通过基因工程 方法或化学合成方法制备。本发明中使用的术语"单链抗体（scFv)片段"指的是通过如下 定义的抗体片段，其是包含通过接头（linker)连接的重链可变区（VH)和轻链可变区（VL) 的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。scFv的大小一般是 一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。本发明 使用的单链抗体可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、 增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其 DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook， 分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核 酸水平上进行。上述单链抗体还可以包括其衍生物。本发明中"抗体的衍生物"包括例如 当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如BIAcore系统中使用的表面等 离子共振技术来增加与GPC3抗原表位结合的噬菌体抗体的效率（Schier，人抗体杂交瘤 7 (1996)，97-105 ;Malmborg，免疫学方法杂志 183 (1995)，7-13)。还包括，例如 W089/09622 中描述的嵌合抗体的产生的方法，EP-A10239400和W090/07861中描述的人源化抗体产生 的方法，W091/10741，W094/02602和W096/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人 抗体的方法所产生的抗体的衍生物。
[0017] 本发明的术语"特异性识别"的意思是本发明的双特异性抗体不与或基本上不与 目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但 不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式 细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的 本领域常识来判断。
[0018] 嵌合抗原受体的跨膜区可以选自⑶8或⑶28等蛋白的跨膜区。⑶8或⑶28是T 淋巴细胞表面的天然标记物。人⑶8蛋白是个异二聚体，由α β或者Υ δ两条链组成。 在本发明的一个实施方案中，跨膜区选自CD8a或者CD28的跨膜区。此外，CD8a铰链区 (hinge)是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区被用于将嵌合抗原受体 CAR的靶点识别结构域scFv和胞内信号区连接起来。
[0019] 胞内信号区可以选自⑶3 ζ，Fc ε RIY，⑶28,⑶137,⑶134蛋白的胞内信号区，及 其组合。⑶3分子由五个亚单位组成，其中⑶3 ζ亚单位（又称⑶3zeta，简称Z)含有3个 ITAM基序，该基序是TCR-⑶3复合体中重要的信号转导区。⑶3 δ Z是截短的不具有ITAM 基序的CD3(序列，在本发明实践中一般作为阴性对照的构建。Fee RIY主要分布在肥大 细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3(类似。此 外如前所述，CD28, CD137, CD134是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段 产生的共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN- γ 等细胞因子的水平，同时提高CAR T淋巴细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。
[0020] 本发明的核酸所编码的GPC3嵌合抗原受体蛋白可以选自按如下方式顺序连接的 嵌合抗原受体蛋白：
[0021] scFv(GPC3)-CD8-CD3 ζ，
[0022] scFv (GPC3)-CD8-CD137-CD3 ζ，
[0023] scFv(GPC3)-CD28a-CD28b_CD3 ζ，
[0024] scFv (GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3 ζ，
[0025] 及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中⑶28a代表⑶28分子的跨膜区，⑶28b代 表CD28分子的胞内信号区。上述各种抗GPC3嵌合抗原受体统称为scFv (GPC3) -CAR。
[0026] 在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸具有如SEQ ID NO :18?21所述的序 列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的核酸是编码具有如SEQ ID NO :22-25之一的 嵌合抗原受体蛋白的核酸。
[0027] 本发明的第二方面包括包含上述编码表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体 蛋白的核酸的载体。在一个具体实施方案中，本发明使用的载体是一种慢病毒质粒载体 pPWT-eGFP。该质粒属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋 白Gag/Po 1、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2 ;编码VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2. G ;及 空载体pPWT-eGFP，其可以用于重组引入目的核酸序列，即编码CAR的核酸序列。空载体 pPWT-eGFP(其本身为后续试验中的mock)中由延长因子-la (elongation factor-la, EF-1 a)启动子调控增强型绿色突光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP) 的表达。而包含编码CAR的目的核酸序列的重组表达载体pWPT-eGFP-F2A-CAR是通过由 来自口蹄疫病毒（food-and-mouth disease virus，FMDV)的核糖体跳跃序列（ribosomal skipping sequence2A)(简称F2A)实现eGFP与CAR的共表达的。在一个具体实施方案中， 本发明的载体具有如SEQ ID NO :27-30之一的核酸序列。
[0028] 本发明的第三方面包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感 染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内 已知的其他转导T淋巴细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。
[0029] 在本发明的一个实施方案中，所述病毒是包含上述pWPT-eGFP-F2A-CAR重组载体 (即含有scFv(GPC3)-CAR)的慢病毒。
[0030] 本发明的第四方面包括一种转基因 T淋巴细胞，其被转导有本发明的核酸或被转 导有本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规 的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导 方法包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的nucleofector核转染仪能够直 接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子（Slewing Beauty system)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提 高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[Davies JK.，et al.Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010,70(10) :0F1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。 在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的转导方法是基 于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表 达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因 T淋巴细 胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行 体外细胞毒实验证明，本发明的表面表达嵌合抗原受体的转基因 T淋巴细胞具有高度特异 性的肿瘤细胞杀伤效果（亦称细胞毒性）。因此本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包 含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因 T淋巴细胞 可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。
[0031] 在一个实施方案中，本发明的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌 合抗原受体由SEQ ID NO :18-21之一的核酸编码表达。在另一个实施方案中，本发明的转 基因 T淋巴细胞表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQ ID NO :22-25 之一。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1显示的是作为示例的本发明的包含编码CAR序列的慢病毒载体 pWPT-eGFP-F2A-CAR的结构示意图。
[0033] 图2显示的是作为示例的包含在慢病毒载体中的本发明的CAR的不同区之间连接 关系的示意图，其中由核糖体跳跃序列F2A连接的eGFP和svFv(GPC3)特异性嵌合抗原受 体。
[0034] 图3显示的是Mlul和Sail双酶切鉴定实施例1的慢病毒质粒的核酸电泳图。其 中Ml是DS2000分子量标记物（广州东盛生物科技有限公司）；M2是Hind III标记物（广 州东盛生物科技有限公司）。泳道1-5分别是
[0035] 1 ：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-δ Ζ ；
[0036] 2 ：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-Z ；
[0037] 3 ：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ ；
[0038] 4：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z ；
[0039] 5 :pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ。
[0040] 图4显示的是本发明实施例2的病毒感染CTL(细胞毒性T淋巴细胞）后细胞表 达的eGFP的流式细胞技术检测结果。
[0041] 图5显示的是本发明实施例2的表达不同嵌合抗原受体（CAR+)的CTL细胞的体 外生长情况。图中显示在病毒感染后第9天，表达不同嵌合抗原受体的CTL细胞体外扩增 20?40倍。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不能理解为用于限制本发明的范围。下面实施例中如未注明具体条件的实验方法， 则按照常规条件如Sambrook等，"分子克隆：实验手册（New York :Cold Spring Harbor laboratory Press，1989) "中所述的条件，而在实施例中明确说明有试剂公司说明书时，贝lj 按照说明书所建议的条件进行。
[0043] 实施例1.表达本发明核酸编码的嵌合抗原受体蛋白的慢病毒质粒的构建及病毒 包装
[0044] 下表1解释了本发明示例的嵌合抗原受体各部分的连接顺序，该连接还可参见图 2中所示。表1
[0045]
【权利要求】
1. 编码表达于人T淋巴细胞表面的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述抗GPC3嵌 合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区 包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体scFv(GPC3)。
2. 权利要求1所述的核酸，其中跨膜区选自包含CD8或CD28的跨膜区和铰链区的序 列。
3. 权利要求1或2的核酸，其中胞内信号区选自⑶3 ζ，Fc ε RI Y，⑶28,⑶137,⑶134 的胞内信号区序列，及其组合。
4. 权利要求3的核酸，其中所述嵌合抗原受体蛋白是选自包含顺序连接的胞外结合 区，跨膜区和胞内信号区的如下顺序连接的嵌合抗原受体蛋白： scFv(GPC3)-CD8-CD3 ζ， scFv(GPC3)-CD8-CD137-CD3 ζ， scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD3 ζ， scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3 ζ， 及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜区，CD28b代表 CD28分子的胞内信号区。
5. 权利要求1的核酸，选自编码具有SEQ ID NO :22?25之一序列的嵌合抗原受体蛋 白的核酸。
6. 权利要求1的核酸，具有SEQ ID NO :18-21之一的序列。
7. 包含权利要求1-6之一所述的核酸的载体。
8. 权利要求7所述的载体，该载体来自慢病毒质粒pWPT-eGFP，并具有如SEQ ID NO : 27-30之一的核酸序列。
9. 包含权利要求7或8所述载体的病毒。
10. -种基因修饰的T淋巴细胞，其被转导有权利要求1-6之一的核酸或权利要求7或 8所述的载体或权利要求9所述的病毒。
11. 一种转基因 T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由SEQ ID NO :18-21之一的核酸编码表达。
12. -种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的 氨基酸序列选自SEQ ID NO :22-25之一。
【文档编号】C12N15/867GK104140974SQ201310164725
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月8日 优先权日:2013年5月8日
【发明者】李宗海, 高慧萍, 蒋华, 石必枝, 王华茂, 李克桑, 王红阳, 杨胜利, 顾健人 申请人:上海益杰生物技术有限公司