专利名称：一种肠道病毒ev核酸恒温扩增方法
技术领域：
本发明涉及病毒的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的肠道病毒(EV)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
背景技术：
手足口病是一种全球性传染病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，在少数患者中可引发心肌炎、肺水肿、脑膜脑炎等致命性并发症。在我国，1981年在上海首次发现手足口病；此后，全国各地都有发病报道。有些地区的流行率高达1000/10万。目前已确认的引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、
4、5、9、10型，B组的2、5型，埃可病毒11型以及肠道病毒均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒(EV71)最为常见。目前EV的主要检测方法有:病毒分离培养法、血清学检查和RT-PCR法。病毒分离培养和血清学方法，繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。RT-PCR法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。实时突光核酸恒温扩增检测技术(SimultaneousAmplification and Testing,简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42°C )，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对肠道病毒(EV)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，设备简单，成本低的EV RNA检测方法。本发明的第一方面，提供了一种肠道病毒EV的扩增方法，所述扩增方法包括步骤:在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增肠道病毒EV的特异性引物对，所述引物对包括:T7引物:序列如SEQ ID NO:3所示;和nT7引物:序列如SEQ ID NO:4所示。在另一优选例中，所述反应体系中还包括M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。在另一优选例中，所述反应体系还包括肠道病毒EV的捕获探针。在另一优选例中，所述反应体系还包括肠道病毒EV的检测探针。在另一优选例中， 所述的捕获探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团。
在另一优选例中，所述的检测探针的5’端标记FAM荧光基团，且检测探针的3’端标记DABCYL淬灭基团。在另一优选例中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。在另一优选例中，所述的捕获探针可与肠道病毒EV的靶标核酸(EV RNA)序列特
异结合。在另一优选例中，所述方法还包括:在另一阳性(对照)反应体系或阴性(对照)反应体系中进行扩增反应。在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、EV内标(EV ICRNA)、所述捕获探针和所述检测探针。在另一优选例中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。在另一优选例中，所述的检测探针用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述EV靶标核酸(EV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合。在另一优选例中，所述的反应体系中肠道病毒EV或的拷贝数小于100个，较佳地为1-50个拷贝，更佳地为1-10个拷贝。在另一优选例中，所述方法还包括步骤:在扩增反应过程之中或之后，检测肠道病毒EV的特异性探针发出的荧光信号。在另一优选例中，所述方法为实时荧光核酸恒温扩增法。在另一优选 例中，所述反应体系中还含有待测的肠道病毒或衍生自所述肠道病毒核酸。在另一优选例中，所述的待测核酸是来自环境样品或人类排泄物样品的核酸。本发明的第二方面，提供了一种肠道病毒EV的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括:用如本发明第一方面中所述的扩增方法扩增待测样品；和在扩增反应过程之中或之后，检测肠道病毒EV的特异性探针发出的荧光信号。在另一优选例中，所述方法还包括设置一个或多个对照组。在另一优选例中，所述对照组包括:EV阳性对照组、EV阴性对照组、EV内标对照组。本发明的第三方面，提供了一种肠道病毒EV的检测试剂盒，所述试剂盒包括:(a)第一容器，以及位于所述容器内的扩增肠道病毒的特异性引物对，所述引物对包括:T7引物:序列如SEQ ID NO:3所示;和nT7引物:序列如SEQ ID NO:4所示;以及使用说明书。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的一种或多种组分:(b)捕获探针；(c)检测探针；(d) EV内标序列；和/或(e)内标检测探针。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括一种或多种酶。
在另一优选例中，所述的酶是M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和EV检测探针存在于一检测液中。在另一优选例中，所述的内标检测探针存在于EV检测液中。在另一优选例中，所述EV内标为竞争性内标，并与EV靶标核苷酸(EV RNA)使用同一对引物(Τ7和ηΤ7)。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括EV阳性对照和/或EV阴性对照。在另一优选例中，所述捕获探针是与肠道病毒的靶标核酸(EV RNA)序列特异结合的捕获探针；和/或所述检测探针是与根据所述EV靶标核酸(EV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的EV检测探针。在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的检测探针还可与肠道病毒EV的靶标核酸(EV RNA)序列特异结合。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一个或多个特征:所述检测探针包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；和/或所述的捕获探针包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和/或所述的EV内标序列包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；和/或所述的内标检测探针包括如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分:裂解液、核酸提取液、洗涤液、EV反应液、EV检测液、SAT酶液、EV阳性对照、EV阴性对照和EV内标；其中，所述裂解液包括硫酸铵((NH4) 2S04)和HEPES ；所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；所述洗涤液包括NaCl和SDS ；所述EV反应液包括dNTP和NTP ；所述EV检测液包括T7引物、nT7引物、EV检测探针和内标检测探针；所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；所述EV阳性对照包括肠道病毒5’端的UTR基因的体外转录RNA稀释物；所述的EV阴性对照是不含有肠道病毒靶标核酸(EV RNA)序列或不含有肠道病毒的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水；EV内标:含EV内标RNA (EV IC RNA，序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)稀释物。在另一优选例中,所述试剂盒包括A盒和B盒,其中，A盒为标本处理单元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液；B盒为核酸扩增检测单元，包括所述EV反应液、EV检测液、SAT酶液、EV阳性对照、EV阴性对照及EV内标。本发明的第四方面 ，提供了一种扩增肠道病毒的特异性引物对，所述引物对包括:Τ7引物:序列如SEQ ID NO:3所示;和ηΤ7引物:序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的第五方面，提供了一种如本发明第三方面所述的试剂盒或如本发明第四方面所述的引物对的用途，其特征在于，用于检测在环境样品或人类排泄物样品中是否存在肠道病毒EV。在另一优选例中，所述的环境样品包括:水源、贝类等水产品、水果和蔬菜等即食性食品、色拉等；所述的人类排泄物样品包括发病病人的呕吐物、排泄物等。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图1比对组的引物对和探针序列的荧光检测结果；图2本发明组的引物对和探针序列的荧光检测结果；图3为临床咽拭子样本SAT检测的靶标荧光检测结果；图4为临床咽拭子样本SAT检测的内标荧光检测结果；图5为临床粪便 样本SAT检测的靶标荧光检测结果；图6为临床粪便样本SAT检测的内标荧光检测结果；图7为采用肠道病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对照检测临床样本粪便的结果。
具体实施例方式本发明人经过长期而深入的研究，经过大量筛选和验证，开发了高特异性，高灵敏的专用引物对。使用该特定的引物序列对肠道病毒EV的核酸进行扩增时，具有高特异性，高灵敏等优异优点，可以用于准确地检测肠道病毒EV。基于上述发现，发明人完成了本发明。引物和探针如本文所用，术语“扩增肠道病毒EV的特异性引物”指这样的引物(对)，它扩增出的扩增产物具有肠道病毒EV的互补链序列。在引物设计上，为了能够更好地满足目前对肠道病毒EV检测的需要，本发明人选择了 EV病毒5’端的UTR基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示)。优选的引物序列包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的引物对。在本发明的扩增方法中，除引物外，反应体系中还可以包括一个或多个探针，如检测探针，捕获探针等。如本文所用，术语“肠道病毒EV的捕获探针”指可与肠道病毒EV的靶标核酸(EVRNA)序列特异结合的核苷酸序列。本发明的一种优选的捕获探针具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。更佳地，所述的捕获探针特异结合于肠道病毒EV的靶标核酸(EV RNA)序列。在另一优选例中，当所述肠道病毒EV含有EV内标(EV IC RNA)时，所述捕获探针还可以与所述EV内标序列特异结合，用于设计阴性对照组。EV检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。本发明的一种优选的检测探针具有如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。本发明的引物序列和探针序列根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测肠道病毒(EV)的专用引物和探针序列。在引物、探针设计过程中，产生了诸多对引物和探针序列，比如T7引物序列:5， aatttaatacgactcactatagggagaATTGTCACCATAAGCAGCCA3，， nT7 引物序列:5’ CCCCTGAATGCGGCTAATCC3’，检测探针序列为 5’ aCGGAACCGACU ACUUUccgU3’(5’ 端用 FAM荧光标记，3’ 端用 DABCYL 荧光标 记)，以及 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5 等。将上述各序列用专利201110071284.X中所述的反应体系进行扩增，比对灵敏度检测并选取较优者。结果如图1，图2(图1为比对组，图2为本发明组)。比对组的灵敏度可检测出IO2Copies/反应，而本发明组的灵敏度可达IOcopies/反应，因此筛选得到引物对:SEQ IDNO:3, SEQ ID NO:4 ;探针序列:SEQ ID NO: 5。对照物由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，因此，在本发明的试剂盒中还可以设置对照物，以排除检测结果失真的情况。本发明中可以设置的参照物包括:EV阳性对照、EV阴性对照和EV内标中的一个或多个对照物。EV阳性对照可以是为体外转录的RNA，不具有生物学活性。通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。此外，通过阳性对照品可制备临界弱阳对照(以生理盐水和裂解液按1:1混合成为稀释液，稀释阳性对照1000倍作为临界弱阳对照)，可以提示处于临界值状态时的检验操作情况，通过临界弱阳对照定期检测SAT实验室，可进行室内质量控制，以防止检测过程出现漏检(假阴性)的情况。EV内标可以是体外转录的RNA，不具有生物学活性。EV内标作为EV RNA的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。在另一优选例中，所述体外转录的EV RNA通过以下述方法制备:(I)用化学合成法合成EV5’端的UTR基因片段(EV阳性片断，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示)；(2)将EV5’端的UTR基因片段插入到pGEM -T载体中，构建EV阳性对照质粒；(3)EV阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pGEM -T-EV菌株，贮存于-70。。；
(4)从pGEM -T-EV菌株中提取PGEM -T-EV质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。在另一优选例中，所述EV内标中的体外转录的EV IC RNA以下述方法制备:(I)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同EV靶标序列区域(EV内标片断，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:9所示)；(2)将片段克隆到pGEM -T载体中，构建EV内标质粒；(3)EV内标质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pGEM_ -T- EV IC菌株，贮存于-70。。；(4)从pGEM -T- EVIC菌株中提取pGEM -T- EV IC质粒，将质粒进行转录
RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。检测方法本发明还提供了肠道病毒EV的检测方法，包括用本发明所述的特异性引物对待测样品进行扩增；和在扩增反应过程中或之后，检测肠道病毒EV的扩增产物，例如通过检测特异性探针发出的荧光信号。所述方法还可以任选地包括设置一个或多个对照组，如EV阳性对照组、EV阴性对照组、EV内标组等。在本发明中，检测方法可以用常规的PCR方法，也可用实时荧光检测法等不同的方法。一种特别优选的 方法是实时荧光核酸恒温扩增法。实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)核酸恒温扩增实时荧光检测技术，其原理是将RNA恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型核酸检测技术。首先通过M-MLV反转录酶、T7RNA多聚酶和优化探针(optimalprobe, patent pending)技术来同时实现。反转录酶用于产生祀标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照、阴性对照和内标信号对检验结果进行判定。在本发明中，肠道病毒(EV)通用型检测技术通过使用高特异性和高灵敏度的专用引物对，并配合使用专用的捕获探针，可高效、特异性捕获EV的RNA。核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。试剂盒本发明提供了一种肠道病毒EV的检测试剂盒，包括:(a)扩增肠道病毒的特异性引物对，所述引物扩增出的扩增产物具有肠道病毒EV的互补链序列；(b)捕获探针；和(b)检测探针。所述的引物对是一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生EV靶标核酸(EV RNA)的DNA拷贝的EV扩增引物，在本发明的一个优选例中，所述的EV扩增引物包括:T7引物:SEQID N0:3 ;和 nT7 引物:SEQ ID N0:4。所述的捕获探针是与肠道病毒的靶标核酸(EV RNA)序列特异结合的捕获探针；所述的检测探针是与根据所述EV靶标核酸(EV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的EV检测探针。在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的检测探针还可与肠道病毒EV的靶标核酸(EV RNA)序列特异结合。所述的肠道病毒EV还可以被设计为含有EV内标(EV IC RNA)，较佳地，当肠道病毒含有EV内标时，所述捕获探针和检测探针被设计为还可以与所述EV内标序列特异结合，形成EV内标对照组。在另一优选例中，所述EV内标为竞争性内标，并与EV靶标核苷酸(EVRNA)使用同一对引物(T7和nT7)。所述试剂盒中还可以包括一种或多种酶。如M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和EV检测探针存在于一检测液中。在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分:裂解液、核酸提取液、洗涤液、EV反应液、EV检测液、SAT酶液、EV阳性对照、EV阴性对照和EV内标；其中，所述裂解液包括硫酸铵((NH4)2SO4)和 HEPES ；所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；所述洗涤液包括NaCl和SDS ；所述EV反应液包括dNTP和NTP ；
所述EV检测液包括T7引物、nT7引物、EV检测探针和内标检测探针； 所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；所述EV阳性对照包括肠道病毒5’端的UTR基因的体外转录RNA稀释物；所述的EV阴性对照是不含有肠道病毒靶标核酸(EV RNA)序列或不含有肠道病毒的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水；EV内标:含EV内标RNA(EV IC RNA,序列如序列表中SEQ ID Ν0:7所示)稀释物。在另一优选例中，所述试剂盒的一个反应单位中各种试剂组成如下:(I)裂解液:HEPES25-250mM，(NH4) 2S045_50mM ；(2)核酸提取液:HEPES50-400mM，EDTA40-200mM, LiC1400-2000mM,捕获探针1-50 μ M (优选为 5-25 μ Μ),磁珠 50_500mg/L (优选为 50-250mg/L)；(3)洗涤液:HEPES5-50mM，NaC150_500mM，1%SDS, EDTAl-1OmM ；(4)EV 反应液:Trisl0-50mM, MgC1210_40mM，dNTP0.1-1OmM(优选为 0.5_5mM)，NTPl-20mM(优选为 1-1OmM)，PVP401-10%, KC15_40mM ；(5)EV检测液:将EV扩增引物和EV检测探针溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImMEDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-lOpmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，EV检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；(6) SAT 酶液=M-MLV 反转录酶 400-4000U/ 反应(优选为 500-1500U/ 反应)、T7RNA 聚合酶 200-2000U/ 反应(优选为 500-1000U/ 反应)、2_10mM HEPES ρΗ7.5、IO-1OOmM N-acetyl-L-cysteine>0.04-0.4mM zinc acetate、IO-1OOmM trehalose、40-200mM Tris-HCl ρΗ8.0、40_200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1%(v/v)Triton X-100和20-50%(v/v)glycerol ；(7)EV阳性对照；含IO5-1O8拷贝/mL肠道病毒5’端的UTR基因的体外转录RNA稀释物；(S)EV阴性对照:不含有肠道病毒靶标核酸(EV RNA)序列或不含有肠道病毒的溶液；(9)EV内标:含105拷贝/mL EV IC RNA(序列如序列表中SEQ ID NO:7所示)稀释物。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一个或多个容器，且上述的各个组分可分别位于一个或多个容器中，在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，A盒为标本处理单元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液；B盒为核酸扩增检测单元，包括所述EV反应液、EV检测液、SAT酶液、EV阳性对照、EV阴性对照及EV内标。在另一优选例中，所述的检测探针包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列,和/或所述的捕获探针包括如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。利用以上试剂盒对肠道病毒进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤:I)用裂解液裂解待测样品中的肠道病毒，得到含有肠道病毒核酸的裂解液；2)向步骤I)的裂解液中加入核酸提取液和和EV IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到肠道病毒的核酸(RNA)和 EV IC RNA ；3)将步骤2)提取的肠道病毒的核酸(RNA)和EV IC RNA加入由EV反应液和EV检测液组成的第一阶段反应物中，在60°C下温育10分钟后，再在42°C下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42°C下继续温育60分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3:1 ；4)根据荧光信号产生的时间和强度参照EV阳性对照、EV阴性对照和EV内标检测结果对待测样品进行定性检测。在上述检测操作中，所述步骤I)中的待测样品为咽拭子或粪便。与现有的EV检测相比，本发明具有以下优点:(1)高特异性、高纯度、低污染:针对EV靶核酸设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获EV的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个反应过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。(2)快速检测:将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要60分钟。(3)污染易控:与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。(4)设备简单，成本低:与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。综上所述，本发明试剂盒能够检测拭子或者粪便中的EV RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达10拷贝/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(60分钟完成扩增检测)的特点，将在肠道病毒早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RDBiosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs, dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。实施例1用于实时荧光核酸恒温扩增检测肠道病毒(EV)的专用引物和探针的设计本发明选择EV病毒5’端的UTR基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示)，根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测肠道病毒(EV)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列:(I) 一条可与肠道病毒(EV)的靶标核酸(EV RNA)序列特异结合的捕获探针(TC0，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列为:5’TGCACACCGGATGGCCAATCCAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAA3，(SEQ ID N0.:2)；(2) 一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生EV靶标核酸(EV RNA)的DNA拷贝的EV扩增引物，所述EV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，Τ7引物序列为5’ AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTGTCACCATAAGCAG CCA3’ (SEQ ID N0.:3)，ηΤ7 引物序列为5’ CCCCTGAATGCGGCTAATCC3’(序列表中 SEQ ID NO:4)；(3) 一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述EV靶标核酸(EV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的EV检测探针，所述EV检测探针的核苷酸序列为5’CCGGAACCGACUACUCCGG3’ (序列表中 SEQ ID NO: 5)，5’端用 FAM 荧光标记，3’端用 DABCYL突光标记。在引物、探针设计过程中，产生了诸多对引物和探针序列，比如:T7引物序列:5， aatttaatacgactcactatagggagaATTGTCACCATAAGCAGCCA3，， ηΤ7 引物序列:5’ CCCCTGAATGCGGCTAATCC3’，检测探针序列为 5’ aCGGAA CCGACUACUUUccgU3’，5’ 端用 FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。与本发明序列3，4，5比对灵敏度检测，选取较优者。反应体系参考中国专利201110071284.X 中所述。结果:测试结果如图1和图2(图1为比对组，图2为本发明组)所示。从结果可看出，比对组的灵敏度仅可在100拷贝/反应时得出检测结果，而采用引物特别优化的本发明组，其灵敏度出乎意外地至少提高了一个数量级，可达10拷贝/反应或更低。从曲线形状也可明显看出，本发明组优于比对组。 上述结果表明，SEQ ID N0.:3和SEQ ID N0.:4所示的引物对是检测灵敏度极高的最佳引物。为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的EV内标(SEQ ID N0:7)，设计了内标检测探针，EV内标与EV靶标核苷酸(EV RNA)拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述EV内标可通过EV靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与EV检测探针序列、突光标记不同的探针,所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’ CCGACAGUGAUACGAGAGTCGG3’ (序列表中 SEQ ID N0:6)，5’ 端标记 HEX 荧光基团，3’ 端标记DABCYL淬灭基团。实施例2制备肠道病毒(EV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明肠道病毒(EV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，Target Capture 01igo)、T7引物、nT7引物、EV检测探针、内标检测探针、内标、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶等组分。
权利要求
1.一种肠道病毒EV的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括步骤:在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增肠道病毒EV的特异性引物对，所述引物对包括: T7引物:序列如SEQ ID NO:3所示;和 nT7引物:序列如SEQ ID NO:4所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括肠道病毒EV的捕获探针。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括肠道病毒EV的检测探针。
4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤:在扩增反应过程之中或之后，检测肠道病毒EV的特异性探针发出的荧光信号。
5.一种肠 道病毒EV的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括: 用如权利要求1中所述的扩增方法扩增待测样品；和 在扩增反应过程之中或之后，检测肠道病毒EV的特异性探针发出的荧光信号。
6.一种肠道病毒EV的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (a)第一容器，以及位于所述容器内的扩增肠道病毒的特异性引物对，所述引物对包括: T7引物:序列如SEQ ID NO:3所示;和 nT7引物:序列如SEQ ID Ν0:4所示; 以及使用说明书。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有选自下组的一种或多种组分: (b)捕获探针； (C)检测探针； (d)EV内标序列；和/或 (e)内标检测探针。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征: 所述检测探针包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕获探针包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和/或 所述的EV内标序列包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；和/或 所述的内标检测探针包括如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
9.一种扩增肠道病毒的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括: T7引物:序列如SEQ ID NO:3所示;和 nT7引物:序列如SEQ ID NO:4所示。
10.如权利要求6所述的试剂盒或权利要求9所述的引物对的用途，其特征在于，用于检测在环境样品或人类排泄物样品中是否存在肠道病毒EV。
全文摘要
本发明公开了一种肠道病毒EV核酸恒温扩增方法，具体地，本发明方法包括步骤在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增肠道病毒EV的特异性引物对，所述引物可以从极低EV拷贝数的检测样品中扩增出对应于肠道病毒EV特征性序列的扩增产物。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有EV RNA的待测样品进行扩增，具有检测效率高，准确度高的特点，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/11GK103215386SQ20131016739
公开日2013年7月24日 申请日期2013年5月8日 优先权日2013年5月8日
发明者于明朗, 马道亮, 汤嘉维, 居金良 申请人:上海仁度生物科技有限公司