专利名称：检测猪萨佩罗病毒的引物、Taqman-MGB探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物病原微生物检测技术领域，具体涉及一种检测猪萨佩罗病毒的引物、Taqman-MGB探针及试剂盒。
背景技术：
猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus, PSV)是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，肠道病毒属。猪萨佩罗病毒以前被归类为猪肠道病毒A,并曾被命名为PEV-8,但是Krumbholz等2002年在《Journal of Virology》第11期上5813-5821页发表了题为((Sequencing of Porcine Enterovirus Groups II and III Reveals Unique Featuresof Both Virus Groups》的文章，该文章根据其L和2A基因能将其与其它的猪肠道病毒区分开，因此归类为一个新的属。《病毒分类-国际病毒分类委员会(ICTV)第八次报告》最终将PEV-8称为萨佩罗病毒属，该属包含猪萨佩罗病毒、禽萨佩罗病毒和猿萨佩罗病毒。猪萨佩罗病毒粒子为球形，无囊膜，直径25_30nm。首例猪肠病毒感染的报道出现在20世纪30年代，发生在捷克斯洛伐克的捷申病，是一种高死亡率的脑脊髓灰质炎。猪萨佩罗病毒能引起中度或严重的神经系统紊乱、繁殖障碍、肺炎和腹泻。感染猪只康复后依然会继续排毒，成为重要的病毒传播源。经对现有的技术文献检索分析发现，Knowles等在《Arch Virol)) 1979年第62期 201-208 页发表了题为〈〈Classification of porcine enteroviruses by antigenicanalysis and cytopathic effects in tissue culture: description of 3 newserotype》文章，文中介绍了鉴定该类病毒的方法主要依靠抗原分析和猪肾细胞类型方法。Roland Zell 等 在《Journal of Virological Methods》2000 年第 88 期 205 - 218 页发表了题为〈〈Detection of porcine enteroviruses by nRT - PCR: differentiation of CPEgroups 1-1II with specific primer sets))一文，文中介绍了 RT-PCR检测方法检测萨佩罗病毒。但这些方法费时费力，操作过程繁琐且不易鉴定。目前，鉴定猪萨佩罗病毒的常规方法有病毒分离、病毒中和试验、病变形态观察、抗原分析、RT-PCR等，由于这些技术周期长，操作繁琐或者只能进行定性检测而不能定量分析，并且有时灵敏性不够，尤其是低病毒含量的样品，因此在实际应用中受到限制。目前还没有使用Taqman-MGB实时荧光定量RT-PCR检测该病毒的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种检测猪萨佩罗病毒的引物；另外提供一种检测猪萨佩罗病毒的Taqman-MGB探针；以及提供一种检测猪萨佩罗病毒的试剂盒。本发明通过以下技术方案实现上述目的:
一种检测猪萨佩罗病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID Ν0:Γ2所示:
上游引物:5’ -GGCAGTAGCGTGGCGAGC-3’ (SEQ ID NO:1)；下游引物:5’ -CTACTCTCCTGTAACCAGT-3，(SEQ ID NO:2)。一种检测猪萨佩罗病毒的Taqman-MGB探针，核苷酸序列为SEQ ID NO: 3所示，该序列5’端标记有发光的报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化吲哚卟啉-三月太(dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3):
探针核苷酸序列:5’ -CGATAGCCATGTTAGTG-3’ (SEQ ID NO:3)。优选地，上述的检测猪萨佩罗病毒的Taqman-MGB探针，其所述报告荧光基团为FAM (Carboxyfluorescein,竣基突光素)，萍灭基团为 NFQ (Non-Fluorescent Quencher,非荧光淬灭基团)。一种检测猪萨佩罗病毒的试剂盒，包括上述SEQ ID NO:1 2的引物，以及SEQ IDNO:3序列结合荧光基团和淬灭基团的Taqman-MGB探针。一种检测猪萨佩罗病毒的试剂盒，包括以下组分:PCR反应缓冲液、Mg2+、SEQ IDNO: Γ2的引物序列、由SEQ ID NO: 3构成的Taqman-MGB探针、dNTP混合物以及Taq酶。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
采用Taqman-MGB实时荧光定量RT-PCR方法，克服了病毒分离操作过程繁琐且不易鉴定和传统PCR检测速度慢、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点，可以对样品中的病毒含量进行精确的定量检测。本发明的引物和Taqman-MGB探针特异性高，稳定性好，检测准确率高，Taqman-MGB诊断试剂盒具有检测快速、灵敏性高、稳定性好、易于定量、假阳性低等特点，有利于规 模化和自动化检测分析。TaqMan-MGB探针与传统的 TaqMan-TAMRA (TaqMan-四甲基罗丹明)探针比较具有以下优势:
(I)提高Tm值:平均15bases可提高18°C，这样可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的Tm值差异。(2)提高信噪比:由于在探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基因在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。(3)更简化实验:MGB探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提闻。
图1 =TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线；
图2:猪萨佩罗病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法敏感性实验；
图3:猪萨佩罗病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性实验检测结果曲线图，其中a为PSV YC2011株，b为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒。
具体实施例方式为便于理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例来进一步阐述本发明。以下实施例中，“ηΧ”(η表示数字)意为稀释η倍。实施例中使用的生物材料及试剂说明:
PSV YC2011毒株由广东温氏食品集团研究院分离保存，也可以使用其他市售或自分离的PSV病毒株，仅为便于本领域技术人员理解本发明技术方案使用，不对本发明的技术方案产生影响；TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0、pMD18_T载体和DH5 α感受态细胞均为宝生物工程(大连)有限公司产品；质粒抽提试剂盒购于Omega公司；Axyprep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒购于Axygen公司。实施例1
1)设计引物和TaqMan-MGB探针
从Genbank中检索获得的猪萨佩罗病毒的全基因组序列(参考毒株Genbank登录号为JX286666.1,NC_003987.1和HQ875059.1 )，通过DNAstar软件进行序列比对，找出猪萨佩罗病毒基因组特异性的保守序列共10段,登录http://www.ncb1.nlm.nih.gov/进行BLAST确定其保守性。运 用Oligo 6.0软件对这些保守序列做碱基组成成分及稳定性等方面分析，并从引物和探针设计等原则综合考虑，最终筛选出I段最合适的保守序列，该段保守序列位于PSV基因组的5’非翻译区的第153bp到第260bp(毒株Genbank登录号JX286666.1)。运用专业引物设计软件对该保守序列进行引物设计，得到多对特异性引物和探针序列，经过比对筛选，最终确定一组最佳引物对和一条MGB探针，引物和探针位于5’非翻译区，目的扩增片段为IOSbp。上游引物:5’-GGCAGTAGCGTGGCGAGC-3’ (SEQ ID NO:1)；
下游引物:5’ -CTACTCTCCTGTAACCAGT-3，(SEQ ID N0:2)；
探针:FAM-5’ -CGATAGCCATGTTAGTG-3’ -MGB (序列为 SEQ ID NO:3)
2)定量标准质粒的构建和制备
以提取 PSV YC2011 毒株的 RNA 为模板，按 TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 试剂盒说明书步骤进行反转录，合成cDNA,以cDNA为模板,用上述试剂盒内的SapU和SapD引物进行PCR扩增。SapU:ACGGCGAGTACATATGG (SEQ ID N0:4)；
SapD:GCCATTGCATTAGCTATC (SEQ ID NO:5)。扩增体系如下:
cDNA6 μ L
上游引物 SapU (10 μ Μ)4 μ L
下游引物 SapD (10 μ Μ)4 yL
Taq DNA polymerase50 μ L
ddH2046 μ L
总量110 μ L
配好体系混匀后，低速离心，将液体全部置于管底，用PCR自动扩增仪进行扩增，扩增程序如下:94°C预变性5min ;94°C变性15sec ;55°C退火15sec ;72°C延伸Imin ；30个循环后再延伸lOmin。扩增结束后在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，将748bp处的目的条带切割下来，通过胶回收试剂盒(Omega公司)进行纯化,纯化的目的片段与pMD18_T载体在16°C条件下连接过夜，连接产物转化DH5 α感受态细胞，挑选单克隆菌落进行扩大培养并做PCR鉴定，鉴定为阳性的单克隆菌落送上海英骏生物技术有限公司进行测序验证，测序验证正确的单克隆菌落扩大培养。上述鉴定阳性且测序验证正确的单克隆菌液用质粒抽提试剂盒(Omega公司)进行质粒抽提和纯化，紫外分光光度计测定质粒浓度，并根据以下公式换算为质粒拷贝数。质粒浓度(yg/yL)=0D260X稀释倍数X50/1000 ;质粒拷贝数=质粒浓度X6.02X 1023mol/1000M，M代表质粒分子量。该质粒便为以下步骤制作标准曲线的定量标准质粒。3)病毒RNA的提取:
取PSV YC2011株，按Axyprep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒使用说明书进行，步骤如下:
①取200μ 已知阳性病毒样品，加入1.5mL离心管中；
②加200μ Buffer V_L，漩涡振荡混合均匀，静置5min ；
③加75PLBuffer V-N，漩涡振荡混合均匀，12000 Xg离心5min ；④将上清转移到新的2mL离心管中，加300μ 异丙醇(1%冰乙酸)，上下倒置6_8次，混合均匀；
⑤将制备管置于2mL离心管(试剂盒内提供)中，取步骤④中的混合液移入制备管中，6000 X g 离心 Imin ；
⑥弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加500μ Buffer W1A，室温静置lmin，12000 X g 离心 Imin ；
⑦弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加800μ Buffer W2，12000 Xg离心lmin ；
⑧将制备管置回到2mL离心管中，12000Xg离心Imin ；
⑨将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加40μ Buffer TE,室温静置 Imin，12000 X g 离心 Imin 洗脱 DNA/RNA。4)病毒RNA的逆转录:
以步骤 3)提取的 PSV YC2011 株的 RNA 为模板，按 TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒说明书进行反转录合成cDNA,反转录体系如下:5XAMV buffer 4 μ L, dNTP( IOmM)
2μ L, Random Primer (6_9mer) 50pmol, AMV 反转录酶 10 U, RNA 样品 I μ g，RNaseInhibitor 20U，加DEPC H2O至20 μ L0将各试剂混合均匀，置PCR仪中按以下程序进行:300C 10 min，42°C温浴30 min,90°C 5 min反应结束后_20°C保存，用于荧光定量PCR检测。5) TaqMan-MGB荧光定量PCR反应条件的优化:
以步骤4)所得的cDNA为模板，通过对反应体系中不同的Mg2+、引物浓度、MGB探针浓度、dNTP浓度等实验结果比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型S型扩增荧光信号曲线、扩增效率接近I的反应体系。经优化后的20μ L最佳反应体系为:
组分用量/终浓度
IOXBuffer (PCR 缓冲液)IX
2Smmol/T, MgCl2Smmol/I,
dNTP 混合物Immol/I,
SEQ ID NO:1 2引物每种引物各0.4 μ mol/L
TaqMan-MGB 探针0.2 μ mol/L
cDNA 模板2 μ L
Taq 酶5UnitROX reference dye0.04 μ L
将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中进行扩增，反应程序如下:50°C，2分钟，热启动；95°C，10分钟预变性；95°C，10秒，60°C 40秒，45个循环。试验结果可以实时检测。猪萨佩罗病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR的检测结果判定:进行荧光定量PCR时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为定量标准质粒，阴性对照为灭菌水，检测结果若出现典型的S型扩增曲线，则判定为阳性结果，表明检测样品中含有猪萨佩罗病毒；若检测样品中不含有猪萨佩罗病毒则无扩增信号。6) TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线的建立
用无菌双蒸水将步骤2)获得的定量标准质粒稀释至2.475X 109，2.475X 108，
2.475 X IO7, 2.475 X IO6, 2.475 X IO5Copies^L,用步骤5)最优化的体系进行反应，反应条件按上述优化好的条件 进行。检测结束后荧光定量PCR会自动绘制标准曲线(图1)。本检测方法在2.475X 109 2.475X 105copies/reaction范围内具有良好的线性关系。7)检测灵敏度分析
步骤2)获得的定量标准质粒用无菌双蒸水稀释至2.475X 109，2.475X 108，2.475X107，2.475X106，2.475X105，2.475X104，2.475X103，2.475X102，
2.475 X lOkopies/^L，用步骤5)最优化的体系进行反应，反应条件按上述优化好的条件进行检测其灵敏度。通过分析检测结果可以看出，检测灵敏度可达到10(Γ1000个拷贝/μ (图2)。8)特异性分析
设定可能存在潜在交叉反应的病毒cDNA为模板(以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒为模板)，设定无菌蒸馏水作为阴性对照，PSV YC2011株cDNA作为阳性对照，按上述最优反应体系和条件进行荧光定量PCR反应，结果显示该检测体系特异性良好，非目标病毒核酸均没有扩增曲线，只有猪萨佩罗病毒才有良好的扩增曲线(图3)。9)稳定性分析
选取3个已知阳性的临床样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重复实验:将3个已知阳性样品在同一批中进行检测，每个样品设置两个重复，分析同一样品在批内检测的稳定性；批间重复实验:将3个已知阳性样品分批次检测，每次单独检测一个样品，样品设置两个重复，比较同一样品在不同批次中检测的稳定性。从下表中的检测结果分析，可以看出批内变异系数在0.63%-1.14%之间，批间变异系数在1.09%-1.46%之间，所以可以判断出本检测方法稳定性良好。表I样品检测稳定性分析
权利要求
1.一种检测猪萨佩罗病毒的引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID Ν0:Γ2所示。
2.一种检测猪萨佩罗病毒的Taqman-MGB探针，其特征在于，核苷酸序列为SEQ IDNO: 3所不,该序列5’端标记有发光的报告突光基团，3’端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化吲哚卟啉-三肽。
3.根据权利要求2所述的检测猪萨佩罗病毒的Taqman-MGB探针，其特征在于，所述报告荧光基团为FAM，淬灭基团为NFQ。
4.一种检测猪萨佩罗病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物，以及权利要求2或3所述的Taqman-MGB探针。
5.一种检测猪萨佩罗病毒的试剂盒，其特征在于，包括以下组分:PCR反应缓冲液、Mg2+、SEQ ID NO:1 2的引物序列、由SEQ ID NO: 3构成的Taqman-MGB探针、dNTP混合物以及Taq酶。
全文摘要
本发明公开了检测猪萨佩罗病毒的引物、Taqman-MGB探针及试剂盒，属于动物病原微生物检测技术领域。用于检测猪萨佩罗病毒的引物核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示，Taqman-MGB探针的DNA序列如SEQIDNO:3所示。本发明的引物和Taqman-MGB探针特异性高，稳定性好，检测准确率高，Taqman-MGB诊断试剂盒具有检测快速、灵敏性高、稳定性好、易于定量、假阳性低等特点，有利于规模化和自动化检测分析。采用Taqman-MGB实时荧光定量RT-PCR方法，克服了病毒分离操作过程繁琐且不易鉴定和传统PCR检测速度慢、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。
文档编号C12R1/93GK103205512SQ201310168628
公开日2013年7月17日 申请日期2013年5月9日 优先权日2013年5月9日
发明者陈俊伟 申请人:广东温氏食品集团股份有限公司