专利名称：一种玉米WRKY类转录因子ZmWRKY58及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和作物遗传育种领域，具体涉及一个玉米WRKY转录因子ZmffRKY58的编码基因及其在培育耐逆性植物中的应用。
背景技术：
植物在生长的过程中常常遭遇到各种各样不利的自然环境，比如干旱、高盐、低温、高温淹水等，其中干旱、高盐是影响植物生长发育和产量及限制植物地理分布最为重要的两个因素。干旱可以导致植物细胞失水，造成细胞膨压完全丧失，甚至死亡；高盐则会破坏水势的平衡和离子分布的平衡，导致植物受到分子损伤，生长延迟。在漫长的进化过程中，植物已经形成一套复杂的机制来适应非生物胁迫。植物对各种逆境胁迫的响应往往是多途径、多基因协同作用，从不同层次、不同水平调控对逆境的响应。其中，转录水平上的调控越来越受到人们的关注，如今对转录因子的研究已成为植物基因功能研究的一个重点。转录因子又称为反式作用因子，是能够直接或间接与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性结合，从而调控靶蛋白转录效率的蛋白质因子，通过它们之间及其他相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。从蛋白质结构分析，转录因子一般含有4个功能区，即DNA结合域，转录调控域(包括激活和抑制域)，寡聚化位点以及核定位信号。随着研究的不断深入，越来越多的实验证明转录因子广泛参与植物生物与非生物胁迫应答反应、植物衰亡、种皮及毛状体发育及果实发育等一系列的生理活动。WRKY是近年来发现的一种主要存在于高等植物中的转录调节因子。WRKY转录因子家族含有高度保守的WRKY结构域，由60个高度保守的氨基酸残基组成，在其N端还包括锌指结构，而且WRKY这个名字的由来也是在这个家族的WRKY结构域中含有一段更为保守的氨基酸序列WRKYGQK。WRKY转录因子能够与启动子中的(T) (T)TGAC(C/T)序列即W-box (W-盒)特异结合，从而启动基因的转录。近年来，国内外致力于WRKY转录因子研究的研究非常多，并且取得了丰硕的成果。WRKY基因受各种环境因子如干旱、低温、创伤等以及信号分子、真菌诱导因子、病原体和植物本身不同发育阶段的诱导，直接或间接参与其中的调控网络，从而提高植物对逆境的耐性或抗性。目前有关WRKY家族转录因子的研究大部分来自水稻和拟南芥，而其它物种的研究报道不多。因此，本发明从玉米中分离克隆该家族基因并鉴定它在提高目的植物抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆新型作物品种具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供玉米转录因子ZmWRKY58基因的序列及功能，并进一步公开了该基因的应用。本发明所提供的玉米WRKY类转录因子，名为ZmWRKY58，来源于玉米属玉米(Zeamays L.),是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:
I)由序列表中的SEQ ID NO:1氨基酸残基序列组成的蛋白质；
2)将序列表中的SEQ ID NO:1氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有玉米WRKY转录因子功能的由I)衍生的蛋白质；3)将序列表中的SEQ ID NO:1氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与W盒(TTGACC / T)顺式元件相互作用提高植物抗逆功能的蛋白质。其中，序列表中的SEQ ID NO:1由369个氨基酸残基组成；上述玉米WRKY转录因子与W盒顺式元件相互作用能提高植物抗逆功能，且其与W盒结合的DNA核心序列是TGAC。上述玉米抗逆转录因子的编码基因(ZmWRKY58)为如下I)至4)中任一项所述的核苷酸序列:I)具有序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列；2)具有编码序列表中SEQ ID NO:1的蛋白质序列的多核苷酸；3)具有与序列表中SEQ ID NO:2的DNA序列90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)具有在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，所述高严谨条件可为用0.1XSSPE或0.1XSSC,0.1%SDS的溶液，在65°C下杂交并洗膜。其中，序列表中的SEQ ID NO:2由1110个碱基组成，编码一个完整的开放阅读框，编码具有序列表SEQ ID NO:1的氣基酸残基序列的蛋白质。上述编码基因均具有序列表中SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。同时本发明还包含上述玉米WRK·Y转录因子在培育抗逆性增强的植物中的应用。及含有本发明基因的表达载体，转基因细胞系、重组菌及宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增ZmWRKY58中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。利用植物表达载体，将本发明的ZmWRKY58编码的基因导入植物细胞，可获得对逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。所以本发明还提供一种培育抗逆性增强的植物的方法，将本发明的ZmWRKY58编码基因导入目的植物得到转基因植物，所得转基因植物的抗逆性高于目的植物。可以采用已经的克隆的ZmWRKY58基因作为探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。也可以利用PCR的方法，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何一段DNA或与其同源的一段DNA。使用ZmWRKY58构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。携带本发明ZmWRKY58基因的表达载体可以通过Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，电穿孔等生物技术方法导入植物细胞。被转化的目的植物可以是双子叶植物，也可以或单子叶植物。有益.效果本发明从玉米中分离、克隆得到ZmWRKY58基因。通过农杆菌介导的转化法将其导入水稻并获得转基因植株。然后验证了转基因水稻对ABA敏感性提高，对高盐、干旱的耐受性提高，为利用该基因在其他植物上的应用从而提高抗逆性提供了理论依据和利用价值。
图1 ZmWRKY58与其他物种WRKY家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对。其中，核心保守区域WRKYGQK用实线方框表示，锌指结构用虚线方框表示。图2 ZmffRKY58与其他WRKY转录因子氨基酸序列比对后的进化树。图3 ZmWRKY58蛋白亚细胞定位图。A ;转P1302-ZmWRKY58融合表达载体，无激发光照射；B:转P1302_ZmWRKY58融合表达载体，445-490nm激发光源照射；C:转P1302载体质粒，无激发光照射；D:转P1302载体质粒，445-490nm激发光源照射。图4 ZmffRKY58基因在干旱、高盐逆境处理时的表达。H组:干旱(其中H 1:12h，H2:24h, H3:48h) ;Y 组:高盐(其中 Yl: 12h，Y2:24h，Y3:48h)。图5 Tl 代转 ZmWRKY58 基因水稻植株的 PCR 检测。M:DL2000 Marker ;1:L1_2 ；2:Ll-3 ；3:L4-5 ； +:以pl301质粒为模板；以水为模板。图6转ZmWRKY58基因水稻提高了植物对干旱的耐受性。图7转ZmWRKY58基因水稻提高了植物对高盐的耐受性。图8转ZmWRKY58基因水稻对ABA敏感性的提高。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生工生物有限公司合成；测序由Invitrogen公司进行；实验中用到的各种限制性内切酶、连接酶、pMD18_T、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs等购自Takara公司；反转录试剂盒购于Promega公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均以及基因组提取试剂盒购于全式金生物技术有限公司，方法均参照说明书进行。实施例1玉米WRKY家族基因ZmWRKY58的获得1.胁迫处理:植物材料为玉米B73自交系，精选大小均匀、颗粒饱满的种子播于装有砂土的花盆中，适时喷洒蒸馏水，以保持土壤湿润。待幼苗长至二叶一心时，以正常灌水的植株作对照，分别进行16%PEG-6000和200mmol/L NaCl胁迫处理，处理时间分别为12、24、48h，在处理的不同时间段，用剪刀分别剪取试验组和对照组玉米幼苗相同部位叶片，每个处理阶段取样三份。采样完毕，样品立即用液氮冷冻保存于_80°C冰箱。2.RNA提取:上述获得的玉米材料，加入液氮研磨后，迅速转移到1.5 ml的离心管(液氮预冷)中。研磨好的材料统一加到0.5ml刻度上,加入Iml Trizol,室温放置IOmin,使其充分裂解；4°C, 12000rpm,5min,弃沉淀；按200 I氯仿/ ml Trizol加入氯仿，盖紧离心管盖,用手剧烈振荡15s,待其充分乳化后，室温放置15min ;4°C, 12000rpm离心15min ;从离心机中小心取出离心管，吸取上层水相，至另一个离心管中；按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混勻，室温放置IOmin ;4°C, 12000rpm离心15min ;弃去上清,RNA沉于管底；小心弃去上清，按lml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管悬浮沉淀，4°C, 12000rpm离心5min,弃去乙醇,倒放在纸上,室温放干；加入适量的Rnase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪吹打沉淀，待RNA充分溶解后取适量检测其浓度和纯度，其余放入_80°C保存。3.反转录:按照promega反转录试剂盒提供的步骤操作，反转录体系如下:总 RNA lM-g, 25mM Mgc12 4M-1, Reverse Transcription 10 X Buffer 2M-1, IOmMdNTP Mixture 2M-1, RNase inhibitor (40u/M-1) 0.5M-1, Oligo (dT) 15Primer (500M-g/M-1)1M-1, AMV Reverse Transcriptase (25u/M-l) 0.6Ml,加 Nuclease-Free
Water至20耵。小心混匀，42°C温浴40min，然后95°C加热5min，4°C
放置15min终止反应，即获得相应的反转录产物cDNA。4.扩增:检索MAIZEGEN0ME和NCBI数据库，获得ZmWRKY58的推测编码序列，用Primer Premier 5.0软件设计特异引物,引物由生工生物公司合成。引物序列如下:WRKYlF:5，_ AGATGAGGAAGTGGAGGAGGCGAACAG-3，WRKYlR:5，- CACCTGTGCTGCTGCTGCTGCTGACT-3’以上述获得玉米总cDNA为模板，通过RT-PCR得到一个包含有完整开放阅读框的编码区，长度为lllObp，回收，连接到pMD18-T载体上，进行测序。测序结果表明ZmWRKY58与序列表中序列2中的核苷酸序列一致。编码具有序列表中序列I的氨基酸残基序列的蛋白质。实施例2玉米ZmWRKY58的序列同源与同源性分析根据序列测序结果，到NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列与WRKY家族转录因子同源关 系最近。将该转录因子与其它WRKY转录因子家族成员的蛋白序列进行比对，分析其锌指结构类型为C2H2型，依据该DNA结合域的结构特征，该ZmWRKY58蛋白属于第II类WRKY转录因子家族(如图1)。为了进一步分析ZmWRKY58和其它WRKY类转录因子的系统进化关系，将不同植物的WRKY蛋白与ZmWRKY58进行系统进化关系的分析(如图2)。实施例3 ZmffRKY58的亚细胞定位用Primer Premier 5.0软件设计特异引物,并在引物5 '端和3 '端分别添加限制性内切酶NcoI和SpeI的识别序列和相应的保护碱基，交由生工生物公司。以测序正确的重组质粒P_ZmWRKY58为模板扩增目的片段。引物序列如下:RH-F 5， _ ATATCCATGGTAGATGAGGAAGTGGAG _3，RH-R 5， - GGACTAGTCACCTGTGCTGCTGCTGC -3，将扩增得到的PCR产物回收后连PMD18-T载体，经热击转化导入大肠杆菌感受态，挑取单菌落，提质粒，用NcoI和SpeI酶切验证,验证正确的质粒送去测序。用NcoI和SpeI酶切上述重组质粒与pCAMBIA1302载体，回收目的片段与PCAMBIA1302载体大片段，再将两者进行连接反应，经转化及质粒提取鉴定，得到的阳性克隆命名为 pl302-ZmWRKY58。pl302-ZmWRKY58用于洋葱(Allium cepa)表皮的基因枪转化，以pl302作对照。具体步骤如下所述:1.质粒的准备:用试剂盒提取纯化pl302-ZmWRKY58和pl302 (对照)质粒，浓度为 lmg/ml,溶于 H2O。2.洋葱的准备:将新鲜的洋葱切成西瓜片状，取内层较为平整的茎片，用镊子剥取内表皮细胞层，使光面向下，平铺在MS (含100mg/L Amp)平板上，预培养4h待用。3.微弹载体的制备:称取60mg金粉置于1.5mL离心管中；加Iml无水乙醇,充分涡旋3分钟，IOOOOrpm离心10秒钟；弃上清，重复一次；用Iml无菌水悬浮，震荡I分钟，IOOOOrpm离心10秒钟,弃上清,重复一次；用Iml无菌水悬浮,储存于_20°C待用。
4.金粉与DNA的包埋:取50ul制备好的均匀金粉悬浮液于1.5mL离心管中，加入IOuIDNA (lmg/ml)、50ul 2.5M CaCl2JOul 0.1M亚精胺，每加完一样可振荡几秒钟；将离心管置于震荡器上温和震荡几分钟后，室温静置10分钟，IOOOOrpm，离心10秒，弃上清；力口入200ul无水乙醇漂洗3次，lOOOOrpm，离心I分钟；再将颗粒悬浮于30_45ul乙醇中，用枪吸打混匀，置于冰上；取5ul悬浮均匀的金粉置于微载体上。5.基因枪转化受体材料:操作前将超净台提前开紫外消毒，用75%的乙醇擦拭基因枪内部件，微载体、钢丝网、可裂膜可提前用75%的酒精消毒，待乙醇挥发干净方可使用；待颗粒晾干后，放置于载体膜和载体膜支架，取质粒DNA与金粉的混合物，用移液器吸取一定量加于微载体中央，干燥几分钟；用灭过菌的镊子取出破裂盘并在70%异丙醇液体内轻蘸几下灭菌，将破裂盘放在固定帽内，最后将固定帽连接基因枪内的氦气加速器；调节破裂盘与载体膜间的位置，最后放置终止屏；将钢瓶上阀门打开，调整压力表前旋钮至合适压力；将轰击材料放在基因枪体内特定位置上，关门；打开基因枪面板左侧电源开关。将中间气流控制开关置于 “VAC”档位对基因枪腔体抽真空至所需真空度时，快速将开关切换到“HOLD”档位；压住发射键“FIRE”保持不动，直到轰击为止；将中间气流控制开关置于“VENT ”档位，直至压力表读数降为零时取出样品。把氦气瓶总开关拧紧，打一次空枪，待指针归零后，逆时针旋转氦压表调节阀至最小，关闭基因枪电源，结果如图3所示。实施例4转录因子基因ZmWRKY58在逆境胁迫下的表达分析按实施例1中的处理方法，获得不同逆境处理不同阶段的材料，提取RNA后反转录成cDNA，以玉米GAPDH基因作为内源参照，通过调整退火温度、循环次数、模板量等参数，建立适宜的半定量PCR反应体系。确定GAPDH基因最佳扩增循环数为28个循环，ZmffRKY58基因的最佳扩增循环数为34个循环。退火温度都为60°C。选择最适条件后，以经过上述处理后的玉米幼苗cDNA为模板，用设计的GAPDH基因和ZmWRKY58基因的引物分别进行半定量RT-PCR实验，重复三次。阴性对照模板为正常浇水的玉米三叶期叶片cDNA。ZmWRKY58基因的 RT-PCR 引物:P1:5’ -AGG AAG TGG AGG AGG CGA ACA_3’;P2:5’ -GGA TGG CTT GCGCTT GC-3’ ZmffRKY58 基因的 RT-PCR 扩增片段是 217bp。GAPDH 基因的 RT-PCR 引物:P3:5， -CAACGACCCCTTCATCACCAC-3，；P4:5，- ATACTCAGCGCCAGCCTCACC-3’GAPDH基因的RT-PCR扩增片段是190bp，结果如图4所示。实施例5 ZmWRKY58转基因水稻的检测构建植物表达载体pl301- ZmffRKY58,通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将其导入水稻品种中花11中，经过预培养、浸染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗、移栽，得到转基因植株。然后提取水稻基因组DANA，具体方法如下:1.取新鲜的水稻植株IOOmg幼叶放入研钵内，加液氮充分研磨。2.加入250 u IRBl溶液，快速颠倒混匀，3.加入 30 u 110%SDS, 15 U IRNaseA 到裂解液中，混匀。4.置于60 °C水浴锅内温浴15min。5.13000rpm，离心5min,将上清转移至干净的离心管中。6.加入 100 ii I 溶液 PBl,混勻，置于冰上 5min, 13000rpm,离心 5min。7.将上清转入一干净离心管，加入375 ill溶液BB1，混匀。
8.将全部的混合液倒入吸附柱上，13000rpm,离心lmin,弃滤液。9.加入 500 U I 溶液 CBl, 13000rpm,离心 lmin,弃滤液。10.加入500 ii I溶液WBl, 13000rpm,离心lmin,弃滤液,重复一次。11.13000rpm，离心 2min，彻底去除 WBl.
12.将吸附柱转入一干净离心管，在柱中央加入70iU预热的去离子水，室温静置2min, 13000rpm,离心 2min,洗脱 DNA。13.取5ul样品在I %的琼脂糖凝胶上点样，检测所提DNA的质量。以此为模板，以潮霉素基因引物HygF:5，-ACTCACCGCGACGTCTGT-3 ；HygR:5’-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3’扩增目的片段。PCR反应条件为:预变性:94°C，5 min ;变性:94°C，30s,，退火:55°C，30s，延伸:72°C，lmin 30s，30 个循环；72°C，10 min。反应结束后，对PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。实施例6 ZmffRKY58转基因T2代植株耐旱性鉴定将三个纯合T2代转ZmWRKY58基因水稻株系Ll_2、Ll_3、L4_5及对照株系的水稻种子置于培养皿中，用去离子水浸泡使其吸胀萌发，待苗长到IOcm左右时，每个株系选取长势一致的幼苗转移至营养土:蛭石=1:1的塑料桶中，每个塑料桶内含有相同重量的土壤混合物和播种15颗水稻幼苗，每个株系设置三个重复。在日光温室中培养四周后进行干旱处理。将培养四周后的转基因水稻和中花11水稻苗，浇入饱和水，以此时为处理0天，干早胁迫15天后，恢复培养7天，观察表型并统计其存活率(如图6 )。实施例7 ZmffRKY58转基因T2代植株耐盐性鉴定筛选前步骤 同上。将培养四周后的L1-2、L1-3、L4_5转基因水稻和中花11水稻苗，浇入含200mM NaCl的盐溶液持续处理14天后，恢复培养7天，观察表型并统计其存活率(如图7)。 实施例8 ZmffRKY58转基因T3代植株对ABA的敏感性分析将T2代转ZmWRKY58基因L1-2、L1_3、L4_5水稻株系种子播种于含有不同浓度ABA(0 u M, I U M, 5 uM)的1/2MS培养基上，以非转基因的中花11水稻为对照，在28°C条件下，16h光照/8h黑暗使其萌发生长，培养2周后测量其根长，实验重复3次(如图8)。图6、7和8分别观察三个转基因株系和对照株系的植株在不同浓度的ABA处理下，根长的变化。从图中可明显看出，随着ABA浓度的提高(5 PM时)，三个转基因株系的根长较对照有明显缩短。
权利要求
1.一种玉米WRKY转录因子，为如下I)或2)所述的蛋白质: 1)由序列表中的SEQID NO:I氣基酸残基序列组成的蛋白质； 2)将序列表中的SEQID NO:1氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有玉米WRKY转录因子功能的由I)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的玉米WRKY转录因子，其特征在于:所述玉米WRKY转录因子与W盒顺式元件相互作用能提高植物抗逆功能，且其与W盒结合的DNA核心序列是TGAC。
3.权利要求1所述玉米WRKY转录因子的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因为如下I)至4)中任一项所述的核苷酸序列: 1)具有序列表中SEQID NO:2的核苷酸序列； 2)具有编码序列表中SEQID NO:1的蛋白质序列的多核苷酸； 3)具有与序列表中SEQID NO:2的DNA序列90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列； 4)具有在高严谨条件下可与序列表中SEQID NO:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，所述高严谨条件 可为用0.1XSSPE或0.1XSSC,0.1%SDS的溶液，在65°C下杂交并洗膜。
5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于:它具有序列表中SEQID N0:2的核苷酸序列。
6.如权利要求3飞中任一项所述编码基因在培育抗逆性植物中的应用；权利要求1所述的玉米WRKY转录因子在培育抗逆性增强的植物中的应用。
7.含有权利要求:T5中任一项所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
8.扩增权利要求3飞中任一项所述编码基因全长或任一片段的引物对。
9.一种培育抗逆性增强的植物的方法:将权利要求:T5中任一项所述的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
全文摘要
本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域，具体为根据转录因子ZmWRKY58基因序列设计引物，利用PCR技术从玉米自交系B73总cDNA中扩增得到ZmWRKY58基因。该基因编码具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID No1；2)将序列表中的SEQ ID No1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与W盒(TTGACC/T)顺式元件相互作用提高植物抗逆功能的蛋白质。洋葱表皮亚细胞定位实验表明，ZmWRKY58蛋白具有转录因子的核定位特征。本发明的玉米ZmWRKY58基因用于水稻转化，获得的转基因水稻对ABA的敏感性提高且在耐盐、耐旱方面的能力明显增强。本发明为植物抗逆基因工程提供了重要的基因资源，对提高农作物产量具有重要意义。
文档编号C12N1/15GK103224550SQ20131016959
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者朱苏文, 蔡荣号, 程备久, 江海洋, 林勇翔, 曹建刚, 姜翠萍 申请人:安徽农业大学