专利名称：：一种控制哺乳动物细胞乳酸生成的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种控制哺乳动物细胞乳酸生成的方法。
背景技术：
：抗体类药物由于其良好的活性以及高的选择性等优点，已广泛被用于肿瘤、免疫、感染等疾病的治疗。近年来，随着一些“重磅炸弹”药物Enbrel、Avastin、Humira、HerceptiruRituxan等的相继上市,抗体类药物在整个生物制药领域掀起了“轰动效应”,其市场份额逐年攀升。哺乳动物细胞由于能使外源重组蛋白进行一系列的翻译后修饰，包括正确折叠、二硫键的形成、磷酸化，尤其糖基化修饰，这些修饰功能对于重组蛋白的生物学活性具有重要的意义，因此，逐渐成为重组蛋白，尤其是抗体类药物的重要宿主细胞。随着市场对抗体类药物需求的不断增加，流加培养成为了哺乳动物细胞高细胞密度培养的主流培养方式，但是，在流加培养过程中由于营养物质葡萄糖、氨基酸等的大量消耗，代谢副产物的大量累积，限制了流加培养过程的进一步优化，尤其是乳酸的累积，对于细胞的生长和产物的表达都有明显的抑制作用。因此，在流加培养过程中，对于乳酸的控制成为了培养过程优化是否成功的关键之一。KeqinChen等人(BiotechnolBioeng72:55-61，2001)报道了通过同源重组后筛选得到乳酸脱氢酶缺陷的CHO细胞系，结果减少了乳酸的生成，抗体表达水平是母本细胞系的5倍。但是在抗体类药物的临床前药学研究过程中，更换细胞系是一件费时费力的事情，而且也会浪费大量研发工作量及时间，此方法对于乳酸生成的控制实为是一种下策。
发明内容鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明提供一种简单可行的在流加培养过程中控制乳酸生成的方法，进而逐级进行放大生产，以及采用了一种新的种子扩增和细胞培养方法，用于解决现有技术中的问题。本发明第一方面提供一种控制哺乳动物细胞乳酸生成的方法，包括如下步骤:在基础培养基中添加CuSO4.5H20，将处于对数生长期的哺乳动物细胞接种于反应器后培养12-18天，其中前4-8天控制pH=6.6-7.0,培养过程中流加培养基和葡萄糖浓缩液，并控制葡萄糖浓度在l_3g/L。优选的，基础培养基中添加CuSO4.5H20的量为30-70μmol/L。优选的，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。优选的，控制pH的方式为通过CO2气体和碳酸氢钠控制。本发明第二方面提供一种生产抗TNF-α抗体的CHO细胞的流加培养方法，包括如下步骤:将CHO基础培养基加入反应器中，并在所述基础培养基中添加CuSO4.5Η20，将处于对数生长期的CHO-TNF-α细胞接种于反应器后培养12-18天，其中前4_8天控制pH=6.6-7.0，培养过程中流加培养基和葡萄糖浓缩液，并控制葡萄糖浓度在l-3g/L。所述CHO-TNF-α细胞的构建方法参考FloraForouzesh,SamiraShakeriTabarianjShaghayeghEmamijetal.ConstructionandStableExpressionofaTruncatedHumanReceptorTyrosineKinaseRorl(Rorl-ECD),AvicennaJMedBiotech2012;4(l):41_45。优选的，基础培养基中添加CuSO4.5H20的量为30-70μmol/L。优选的，细胞接种密度为0.58-0.64X106cells/ml。优选的，所述步骤I中，接种后培养液的总体积为2.5-3.5L，反应器的体积为6.5~8.5L0优选的，控制pH的方式为通过CO2气体和碳酸氢钠控制。优选的，反应器的控制条件如下:温度为36.3-37.3°C;搅拌速度为80_120rpm；DO为20-60%。更优选的，反应器的深层通气设置为Air/C02/02三气模式，流速为0.lL/min,CO2和O2比例根据pH和DO设置自动调节。优选的，流加培养基的加入量为细胞接种时培养液的总体积的30%。本发明所提供的控制CHO细胞乳酸生成的流加培养方法，不仅可以在小体积的反应器中具有良好的效果，达到了很高的最终抗体浓度，还可以进行逐级放大，进行大规模(250L以上反应器)的中试生产。更优选的，所述流加培养基为CDEfficientFeedCAGT(简称EFC，Gibco公司)。本发明第三方面提供所述的控制哺乳动物细胞乳酸生成的方法在提高细胞培养抗体表达领域的应用。本发明第四方面提供所述的生产抗TNF-α抗体的CHO细胞的流加培养方法在提高抗TNF-α抗体表达领域的应用。本发明所涉及的控制CHO细胞大规模培养乳酸生成的流加培养方法及中试放大生产，适合于重组蛋白的哺乳动物细胞培养，更适合于生产抗TNF-α抗体的哺乳动物细胞培养。本发明公开了通过结合在培养基中添加硫酸铜和调节反应器PH的综合手段，来控制哺乳动物细胞大规模流加培养时乳酸生成的方法，依此形成了高抗体表达水平的流加培养工艺。并通过一次性WAVE反应器进行种子扩增和一次性搅拌反应器培养，进一步将此流加培养工艺进行反应器规模逐级放大生产，达到了中试的规模。图1:7.5L反应器中不控制乳酸生成的流加培养过程，横坐标表示培养时间，左边纵坐标表示活细胞浓度，右边纵坐标I表示抗体浓度，右边纵坐标2表示乳酸生成浓度。图2:7.5L反应器中控制乳酸生成的流加培养过程，横坐标表示培养时间，左边纵坐标表示活细胞浓度，右边纵坐标I表示抗体浓度，右边纵坐标2表示乳酸生成浓度。图3:30L反应器中控制乳酸生成的放大流加培养过程，横坐标表示培养时间，左边纵坐标表示活细胞浓度，右边纵坐标I表示抗体浓度，右边纵坐标2表示乳酸生成浓度。图4:250L反应器中中试生产过程，横坐标表示培养时间，左边纵坐标表示活细胞浓度，右边纵坐标I表示抗体浓度，右边纵坐标2表示乳酸生成浓度。具体实施例方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。请参阅图1-4。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。实施例17.5L反应器中不控制乳酸生成的流加培养过程基础培养基为⑶CHOMedium(简称⑶-CH0，Gibco公司)，流加培养基为⑶EfficientFeedCAGT(简称EFC，Gibco公司)，培养过程中使用的其它细胞培养试剂均购至Sigma公司。CHO-TNF-α细胞的构建方法参考FloraForouzesh,SamiraShakeriTabarianjShaghayeghEmamijetal.ConstructionandStableExpressionofaTruncatedHumanReceptorTyrosineKinaseRorl(Rorl-ECD),AvicennaJMedBiotech2012;4(l):41-45，利用电转化技术导入CH0-K1细胞，经筛选、亚克隆和稳定性考察，最终获得高效、稳定表达抗体分子的重组细胞株，并用该细胞株建立了均一的细胞库，在此细胞库基础上进行了培养方法的研究。将上述所得的种子细胞进行复苏后，在摇瓶中采用⑶-CHO培养基扩增至300ml，将处于对数生长期的细胞接种于7.5L反应器(NBSBioflo310)，接种后培养液总体积为3L，细胞接种密度为0.61X106cells/ml。在培养第3、6、9天各流加10%的EFC(体积比)，通过流加葡萄糖浓缩液将葡萄糖浓度控制在l_3g/L。7.5L反应器温度为36.8°C;搅拌速度为IOOrpm;D0为40%;pH为7.0，通过CO2气体和碳酸氢钠调节；深层通气设置为Air/C02/02三气模式，流速为0.lL/min,C02和O2比例根据PH和DO设置自动调节。实验结果见图1，整个培养过程进行11天，在培养第6天活细胞密度达到最大值，为10.9X106cells/ml。在培养过程中，乳酸浓度大量累积，在培养第3天乳酸浓度达到3.78g/L，之后一直维持在超过3g/L的水平。抗体浓度在第8天达到514mg/L，之后并未随着培养时间延长而持续累积，因此，较高的乳酸浓度可能限制了抗体的生成。实施例27.5L反应器中控制乳酸生成的流加培养过程相较于实施例一，在基础培养基⑶-CHO中添加了50μmol/L的CuSO4.5H20;反应器PH在培养前4天通过CO2气体和碳酸氢钠将其控制在6.8，之后不控。除此之外，其它培养条件，包括使用的培养基、流加形式、反应器控制条件等均与实施例一一样。实验结果见图2，培养过程共进行17天，在培养第7天活细胞密度达到最大，为9.2X106cells/mL.在培养第3天，乳酸浓度达到3.59g/L，之后与实施例一不同的是，乳酸不是维持在超过3g/L的水平，而是开始大量被消耗，在培养第7天即低于2g/L，在培养第13天低于lg/L。正是因为乳酸浓度得到了有效控制，抗体持续表达，最终抗体产量1.57g/L，较实施例一提高了2.08倍，说明对于乳酸的有效控制促进了抗体的表达。实施例330L规模放大的流加培养过程按照实施例二，将反应器培养规模从7.5L放大至30L反应器(SartoriusBiostatCplus)。种子细胞经过复苏后，在摇瓶中扩增至5个摇瓶各300ml，共1.5L种子液，将处于对数生长时期的种子细胞接种至30L反应器中，接种后培养液共15L，细胞接种密度为0.41X106cells/ml。由于30L反应器与7.5L反应器在结构上不完全一样，因此，在反应器参数控制方面与7.5L反应器会有差别，在30L反应器中设置表层通气以控制罐压，表层仅通气空气，通气流速为0.5L/min，罐压控制为0.05bar，其它培养条件与实施例二一致。实验结果见图3，整个培养过程共进行17天，在培养第7天活细胞密度达到最大，为11.2X106cells/ml。在培养过程中，乳酸在第4天达到最大2.6g/L，之后便开始大量被消耗，在培养第7天即减少至低于lg/L，之后一直维持在低于lg/L的水平，相较于实施例二而言，乳酸浓度低于实施例二，说明乳酸得到了更有效的控制，导致抗体表达水平得到了进一步提升，最终抗体产量达到1.76g/L，与实施例二相比提高了12%。实施例4250L规模中试放大生产的种子扩增过程在种子细胞扩增过程中，采用逐级扩大培养容器的方式，种子细胞经过了摇瓶30ml、100ml、400ml、WAVE2.4L、WAVE15.5L，摇瓶及WAVE反应器培养条件见表1，当种子最后在WAVE反应器中细胞密度达到3X106cells/ml时，接种至250L反应器中进行培养。实施例5250L规模中试放大生产过程250L反应器中中试生产种子扩增各容器培养条件如表I所示。表I1咅养容器培养条件摇瓶置于摇床培养箱内，温度为37;转速为120rpm;CO2比例__为5%_WAVE20/50EH采用IOL-.次性培养袋，含培养液2.4L,温度为36.8°C;摆动角度和速度分别为8°和15rpm；采用Air/C02泵供气，流速为0.15L/min；CO2在培养开始设置为5%,培养I天后__设置为0%。_WAVE20/50EH采用50L一次性培养袋，含培养液15.5L,温度为36.8°C；摆动角度和速度分别为8°和15rpm；采用Air/C02泵供气，流速为0.15L/min；CO2在培养开始设置为5%，培养I天后_设置为0%。_种子细胞复苏后，经过逐级扩增，取对数生长时期的细胞接种于250L反应器，接种后培养液总体积为150L，细胞接种密度为0.6X106cells/ml。基础培养基和流加培养基均使用商业无血清培养基，培养方案与控制乳酸生产的流加培养过程一致，在整个培养过程中通过流加葡萄糖浓缩液将葡萄糖浓度控制在l_3g/L。反应器温度为36.8°C;搅拌速度为IOOrpm；D0为40%；pH在培养前4天设置为6.8,通过CO2气体和碳酸氢钠调节,之后不控制pH;表层仅通入空气,流速为2L/min,深层通入CO2和O2以调节pH和DO0实验结果见图4，中试放大生产细胞培养过程共进行17天，在培养11天活细胞密度达到最大，为9.32X106cells/ml，最终抗体产量为2.24g/L。在中试放大生产过程中，乳酸浓度得到了有效控制，在培养第3天乳酸浓度达到最大值，仅为1.41g/L，之后便开始逐渐降低，从培养第7天开始便低于lg/L，较低的乳酸浓度有利于抗体的生成。从流加培养工艺放大过程来看，从7.5L、30L、至150L不同规模的反应器放大过程中，由于反应器自身的特征，导致虽然流加培养工艺一致，但是乳酸的浓度逐渐降低，进而抗体的表达水平相应得到不断提升，这进一步验证了控制乳酸生成的流加培养工艺的高效性。实施例6相较于实施例一，在基础培养基⑶-CHO中添加了30μmol/L的CuSO4.5H20;反应器PH在培养前8天通过CO2气体和碳酸氢钠将其控制在6.6，之后不控，培养过程总共18天。将上述所得的种子细胞进行复苏后，在摇瓶中采用⑶-CHO培养基扩增至300ml，将处于对数生长期的细胞接种于7.5L反应器(NBSBioflo310)，接种后培养液总体积为3L，细胞接种密度为0.58X106cells/mL.在培养第3、6、9天各流加10%的EFC(体积比)，通过流加葡萄糖浓缩液将葡萄糖浓度控制在l_3g/L。7.5L反应器温度为36.3°C;搅拌速度为80rpm;D0为20%;通过CO2气体和碳酸氢钠调节；深层通气设置为Air/C02/02S气模式，流速为0.lL/min，C0jPO2比例根据pH和DO设置自动调节。该实施例乳酸变化趋势与实施例2相似，且抗体持续高表达。实施例7相较于实施例一，在基础培养基⑶-CHO中添加了70μmol/L的CuSO4.5H20;反应器PH在培养前4天通过CO2气体和碳酸氢钠将其控制在7.0,之后不控，培养过程总共12天。将上述所得的种子细胞进行复苏后，在摇瓶中采用⑶-CHO培养基扩增至300ml，将处于对数生长期的细胞接种于7.5L反应器(NBSBioflo310)，接种后培养液总体积为3L，细胞接种密度为0.64X106cells/ml。在培养第3、6、9天各流加10%的EFC(体积比)，通过流加葡萄糖浓缩液将葡萄糖浓度控制在l_3g/L。7.5L反应器温度为37.3°C;搅拌速度为120rpm；D0为60%;通过CO2气体和碳酸氢钠调节；深层通气设置为Air/C02/02S气模式，流速为0.lL/min，C0jPO2比例根据pH和DO设置自动调节。该实施例乳酸变化趋势与实施例2相似，且抗体持续高表达。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。权利要求1.一种控制哺乳动物细胞乳酸生成的方法，包括如下步骤在基础培养基中添加CuSO4·5H20，将处于对数生长期的哺乳动物细胞接种于反应器后培养12-18天，其中前4_8天控制pH=6.6-7.O,培养过程中流加培养基和葡萄糖浓缩液，并控制葡萄糖浓度在l_3g/L02.如权利要求I所述的一种控制哺乳动物细胞乳酸生成的方法，其特征在于，基础培养基中添加CuSO4·5H20的量为30-70μmol/L。3.如权利要求I所述的一种控制哺乳动物细胞乳酸生成的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。4.如权利要求I所述的一种控制哺乳动物细胞乳酸生成的方法，其特征在于，控制PH的方式为通过CO2气体和碳酸氢钠控制。5.一种生产抗TNF-α抗体的CHO细胞的流加培养方法，包括如下步骤将CHO基础培养基加入反应器中，并在所述基础培养基中添加CuSO4·5Η20，将处于对数生长期的CHO-TNF-α细胞接种于反应器后培养12-18天，其中前4_8天控制ρΗ=6.6-7.O,培养过程中流加培养基和葡萄糖浓缩液，并控制葡萄糖浓度在l_3g/L。6.如权利要求5所述的一种生产抗TNF-α抗体的CHO细胞的流加培养方法，其特征在于，基础培养基中添加CuSO4·5Η20的量为30-70μmol/L。7.如权利要求5所述的一种生产抗TNF-α抗体的CHO细胞的流加培养方法，其特征在于，细胞接种密度为O.58-0.64Χ106cells/ml。8.如权利要求5所述的一种生产抗TNF-α抗体的CHO细胞的流加培养方法，其特征在于，控制pH的方式为通过CO2气体和碳酸氢钠控制。9.如权利要求5所述的一种生产抗TNF-α抗体的CHO细胞的流加培养方法，其特征在于，反应器的控制条件如下温度为36.3-37.3°C;搅拌速度为80-120rpm；D0为20_60%。10.如权利要求9所述的一种生产抗TNF-α抗体的CHO细胞的流加培养方法，其特征在于，反应器的深层通气设置为Air/C02/02三气模式，流速为O.lL/min,CO2和O2比例根据pH和DO设置自动调节。11.如权利要求5所述的一种控制CHO细胞乳酸生成的流加培养方法，其特征在于，流加培养基的加入量为细胞接种时培养液的总体积的30%。12.如权利要求1-4任一权利要求所述的控制哺乳动物细胞乳酸生成的方法在提高细胞培养抗体表达领域的应用。13.如权利要求5-11任一权利要求所述的生产抗TNF-α抗体的CHO细胞的流加培养方法在提高抗TNF-α抗体表达领域的应用。全文摘要本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种控制哺乳动物细胞乳酸生成的流加培养方法。本发明提供一种控制哺乳动物细胞乳酸生成的方法，包括如下步骤在基础培养基中添加CuSO4·5H2O，将处于对数生长期的哺乳动物细胞接种于反应器后培养12-18天，其中前4-8天控制pH=6.6-7.0，培养过程中流加培养基和葡萄糖浓缩液，并控制葡萄糖浓度在1-3g/L。本发明所涉及的控制CHO细胞大规模培养乳酸生成的流加培养方法及中试放大生产，适合于重组蛋白的哺乳动物细胞培养，更适合于生产抗TNF-α抗体的哺乳动物细胞培养。文档编号C12P21/00GK103255238SQ20131018247公开日2013年8月21日申请日期2013年5月15日优先权日2013年5月15日发明者寇天赐,李涛,贾艳丽,郭箭,黄岩山,裘霁宛申请人:江苏泰康生物医药有限公司