神经胶质瘤分子分型基因群及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了神经胶质瘤分子分型基因群及其应用。本发明提供了一组用于预测或辅助预测神经胶质瘤患者预后生存期的基因群，由PM基因群和EM基因群组成，该用于预测或辅助预测神经胶质瘤患者预后生存期的基因群有68个基因，这些基因与神经干细胞、祖细胞的增殖和分化以及肿瘤的产生和恶化密切相关。本发明的实验证明，本发明所获得的与PDGFRA和EGFR共表达的两大基因群共68个基因所组成的分型标志基因群可将不同数据库来源的神经胶质瘤样本稳定地区分为三个特异亚型，极大地克服了现有形态学诊断的局限性，可应用于神经胶质瘤临床诊断而指导临床治疗，并可判断神经胶质瘤患者的预后生存期。
【专利说明】神经胶质瘤分子分型基因群及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及神经胶质瘤分子分型基因群及其应用，主要涉及功能基因组学的肿瘤相关基因表达谱的研究和标志基因群的筛选及验证，即在人功能基因组范围内筛选神经胶质瘤的分型标志基因群，根据这些基因的mRNA表达水平对神经胶质瘤样本进行分型诊断，可预测患者预后。
技术背景
[0002]神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，是人类健康的重大威胁。大多数高度恶性胶质瘤患者，生存期仅为1-2年。低度恶性胶质瘤最终将发展为高度恶性胶质瘤，但其进展快慢存在巨大的个体差异。目前仍不清楚低度恶性胶质瘤进展快慢的本质原因，并且，至今未能发现有效的神经胶质瘤治疗靶点。
[0003]疾病的诊断是治疗方案研究和制定的重要依据。目前对于神经胶质瘤的诊断仍主要建立在形态学基础之上。但胶质瘤在形态学上的异质性，以及医生诊断过程中的主观性差异，诊断的不一致性可达30%-40%，对相当一部分神经胶质瘤无法进行明确的形态学诊断。并且，基于形态学的诊断不能准确反映疾病的本质特征。因此，现有的形态学诊断标准较大地制约了胶质瘤的临床治疗研究。近年来，基于基因表达的分型方法为胶质瘤的诊断开辟了新的思路。分子分型方法为揭示胶质瘤发生和发展的细胞学和遗传学本质提供了可能，可极大地促进胶质瘤的靶向治疗研究。但目前，全世界范围内尚缺乏有效的基于基因表达的神经胶质瘤临床诊断方案。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供一种预测或辅助预测神经胶质瘤患者预后生存期的试剂盒。
[0005]本发明提供的试剂盒，包括用于检测待测神经胶质瘤患者离体样本中PM基因群和EM基因群中的各个基因的表达量的试剂和比对卡；
[0006]所述PM基因群由如下39个基因组成:
[0007]C10orfl8、ClQLU Clorfl06、C9orfl40、CACNG4、CHD7、CSNK1E、EIF4EBP2、ETVUFAM5C、KLRC3、LIX1L、L0C283174、LPHN3、LPPRUMARCKS, MEX3A、MMP16、MYTl、NAV1、NLGNl、NOVAl、NXPHl、OLIGl、0LIG2、PATZ1、PCGF2、PDGFRA,P0LR2F、RFX7、S0X4、S0X6、S0X8、TACC2、TMCCl、TSHZl、ZEBl、ZNF22、ZNF462 ；
[0008]所述EM基因群由如下29个基因组成:
[0009]ACSS3、CDKN2C、DENND2A、DMRTA2、EGFR、EL0VL2、HS3ST3B1、ITGB8、LFNG, NC0A3、NES、NFIA、PDGFA、PMS2P11、P0U3F2、PRPF31、RNF180、SALLl、SEC6IG、SEMA6D、SH0X2、SNX5、S0CS2、S0X9、TNFRSF19、TR1BP, UHRFl、VAV3、ZNF558 ；
[0010]所述比对卡记载如下内容:
[0011]若所述待测神经胶质瘤患者离体样本中所述PM基因群平均表达量大于或等于所述EM基因群平均表达量，则所述待测神经胶质瘤患者的预后生存期超过或候选超过1.9年；
[0012]若所述待测神经胶质瘤患者离体样本中所述PM基因群平均表达量小于所述EM基因群平均表达量，则所述待测神经胶质瘤患者的预后生存期不超过或候选不超过1.9年。
[0013]上述试剂盒中，所述比对卡记载如下内容:
[0014]若所述待测神经胶质瘤患者离体样本中所述PM基因群平均表达量大于所述EM基因群平均表达量，则所述待测神经胶质瘤患者的预后生存期为或候选为3.7-4.9年(欧美人，具体为美国REMBRANT神经胶质瘤大型数据库)或2.3-2.7年(亚洲人，具体为2006-2009年北京天坛医院所收治的神经胶质瘤病例，中国脑胶质瘤基因组图谱计划http://jzl.dajiankang.com/portal, php)；
[0015]若所述PM基因群平均表达量等于所述EM基因群平均表达量，则所述待测神经胶质瘤患者的预后生存期为或候选为1.9-3.0年(欧美人，具体为美国REMBRANT神经胶质瘤大型数据库)或1.9-2.5年(亚洲人，具体为2006-2009年北京天坛医院所收治的神经胶质瘤病例，中国脑胶质瘤基因组图谱计划http://jzl.dajiankang.com/portal, php)；
[0016]若所述待测神经胶质瘤患者离体样本中所述PM基因群平均表达量小于所述EM基因群平均表达量，则所述待测神经胶质瘤患者的预后生存期为或候选为1.3-1.7年(欧美人，具体为美国REMBRANT神经胶质瘤大型数据库)或1.1_1.6年(亚洲人，具体为2006-2009年北京天坛医院所收治的神经胶质瘤病例，中国脑胶质瘤基因组图谱计划http://jzl.dajiankang.com/portal.php)D
[0017]上述试剂盒中，所述PM基因群平均表达量大于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为1.2-5 ；
[0018]所述PM基因群平均表达量等于所述EM基因群平均表达量无显著差异指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为0.9-1.1 ；
[0019]所述PM基因群平均表达量小于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为0-0.8，且不为O。
[0020]上述试剂盒中的比对卡记载如下内容A或B:
[0021]A (针对美国REMBRANT神经胶质瘤大型数据库):
[0022]所述PM基因群平均表达量大于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为1.714±0.032 ；
[0023]所述PM基因群平均表达量等于所述EM基因群平均表达量无显著差异指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为1.074±0.022 ；
[0024]所述PM基因群平均表达量小于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为0.592±0.012 ；
[0025]B (2006-2009年北京天坛医院所收治的神经胶质瘤病例，中国脑胶质瘤基因组图谱计划 http://jzl.dajiankang.com/portal, php):
[0026]所述PM基因群平均表达量大于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为1.427± 0.034 ；
[0027]所述PM基因群平均表达量等于所述EM基因群平均表达量无显著差异指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为0.939 ±0.033 ；
[0028]所述PM基因群平均表达量小于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为0.460±0.031。
[0029]上述试剂盒中，所述试剂包括能与所述离体样本中的所述68个基因或各个基因的mRNA或各个基因的cRNA杂交的芯片；
[0030]所述芯片具体为人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片。
[0031]上述各个基因的cRNA按照如下方法制备:将离体样本提取总RNAj^Agilent RNA线性扩增试剂盒(Agilent Low RNA Input Linear Amplificat1n Kit PLUS),将 mRNA 扩增为cRNA并进行Cy3标记，得到各个基因的cRNA。
[0032]上述试剂盒中，所述离体样本为离体神经胶质瘤组织。
[0033]本发明的另一个目的是提供一组用于预测或辅助预测神经胶质瘤患者预后生存期的基因群组。
[0034]本发明提供的基因群组，由PM基因群和EM基因群共68个基因组成:
[0035]所述PM基因群由如下39个基因组成:
[0036]C10orfl8、ClQLl、Clorf 106、C9orfl40、CACNG4、CHD7、CSNK1E、EIF4EBP2、ETVl、FAM5C、KLRC3、LIX1L、L0C283174、LPHN3、LPPRUMARCKS, MEX3A、MMP16、MYTl、NAV1、NLGNl、NOVAl、NXPHl、OLIGl、0LIG2、PATZ1、PCGF2、PDGFRA,P0LR2F、RFX7、S0X4、S0X6、S0X8、TACC2、TMCCl、TSHZl、ZEBl、ZNF22、ZNF462 ；
[0037]所述EM基因群由如下29个基因组成:
[0038]ACSS3、CDKN2C、DENND2A、DMRTA2、EGFR、EL0VL2、HS3ST3B1、ITGB8、LFNG, NC0A3、NES、NFIA、PDGFA、PMS2P11、P0U3F2、PRPF31、RNF180、SALL1、SEC61G、SEMA6D、SH0X2、SNX5、S0CS2、S0X9、TNFRSF19、TR10ΒΡ, UHRF1、VAV3、ZNF558。
[0039]上述的试剂盒或上述的基因群组在制备预测或辅助预测神经胶质瘤患者预后生存期的产品中的应用。
[0040]上述基因群组作为标志物在制备预测或辅助预测神经胶质瘤患者预后生存期的产品中的应用。
[0041]上述中，基因群的平均表达量指基因群中各基因mRNA表达量的平均值。
[0042]上述中，PM基因群平均表达量是指PM基因群中每个基因的表达量之和除以39 ；
[0043]上述中，EM基因群平均表达量是指EM基因群中每个基因的表达量之和除以29。
[0044]上述中，每个基因的表达量是指每个基因表达的mRNA的量。
[0045]本项发明利用神经胶质瘤数据库mRNA表达谱数据，筛选获得与I3DGFRA和EGFR共表达的两个基因群(分别称为PM和EM基因)共68个分型标志基因。利用基因芯片、分子杂交、RT-PCR等方法分别检测PM和EM基因群中的多个或全部基因的mRNA水平，可对神经胶质瘤样本进行稳定的分型鉴别诊断，并有效预测患者预后生存期。
[0046]本发明还可以利用68个分型标志基因制备成基因芯片用于神经胶质瘤的分型鉴定，该基因芯片为将这些基因的cDNA或寡核苷酸探针固定成微阵列，其中每个探针可以特异性地与来源于组织样本中相应基因的cDNA、mRNA或其扩增产物杂交。微阵列可以是平板、微珠、细针或膜相阵列，可以是寡核苷酸、多核苷酸或者cDNA阵列。
[0047]本发明通过检测组织标本中的68个分型标志基因mRNA表达量，可以通过核酸分子杂交探针或RT-PCR扩增检测mRNA表达量进行神经胶质瘤的分型鉴别。核酸分子杂交可以是组织切片的原位杂交，RT-PCR可以是定量、半定量方法，及定性方法。
[0048]本发明中利用68个分型标志基因进行鉴别神经胶质瘤亚型的方法具体如下:
[0049]a)从神经胶质瘤患者的手术切除癌组织样本中提取总RNA ；
[0050]b)对样本总RNA中的mRNA扩增为反义RNA (cRNA)并进行荧光标记；
[0051]c)用标记后的样本cRNA与基因芯片(可以为利用68个分型标志基因制备成基因芯片，也可以为人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片)杂交；
[0052]d)用NMF聚类分析样本基因表达；并计算胶质瘤样本PM基因群与EM基因群的mRNA表达量的均值之比，与各亚型比值相比较，准确鉴别诊断神经胶质瘤亚型，并根据相应亚型患者的生存期，判断患者的预后生存期。
[0053]本发明的实验证明，本发明所获得的与I3DGFRA和EGFR共表达的两大基因群共68个基因所组成的分型标志基因群可将不同数据库来源的神经胶质瘤样本稳定地区分为特异的三个亚型，极大地克服了现有形态学诊断的局限性，可应用于神经胶质瘤临床诊断而指导临床治疗，并可较为准确判断神经胶质瘤患者的预后生存期。此外，由于该68个基因与神经干细胞、祖细胞的增殖和分化以及肿瘤的产生和恶化紧密相关，为揭示神经胶质瘤的细胞和遗传学起源、进而发现和筛选治疗靶点提供重要指导，并为建立筛选治疗化合物的相关模型等提供快速便捷的检测平台。因此，本项发明可在科研、医疗、制药等产业中得到广泛应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0054]图1为REMBRANDT数据库神经胶质瘤样本的PM/EM分型基因表达谱
[0055]图2为REMBRANDT数据库神经胶质瘤分子亚型的生存期分析
[0056]图3为天坛数据库神经胶质瘤样本的PM/EM分型基因表达谱
[0057]图4为天坛数据库神经胶质瘤分子亚型的生存期分析
【具体实施方式】
[0058]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0059]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060]实施例1、神经胶质瘤分型标志基因群的筛选及分型标准的确定
[0061]1、神经胶质瘤分型标志基因群的筛选和分型标准的确定
[0062]利用NCBI公布的神经胶质瘤基因表达谱数据库GSE4290
[0063](http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE4290&submit.x=0&submit.y=0),通过Pearson相关性分析,获得37个与表皮生长因子受体(EGFR)共表达基因(称为EM基因)组成的基因群，以及44个与血小板来源的生长因子受体A(TOGFRA)共表达基因(称为PM基因)组成的基因群。两个基因群互相独立，无重叠。非监督型等级聚类分析发现，该数据库胶质瘤样本的PM基因群与EM基因群的表达量表现出三种特异的模式:PM基因高表达而EM基因低表达(称为PMhigh)、PM基因低表达而EM基因高表达(称为EMhigh)以及两群基因皆低表达(称为PMlmEMlwX因此，利用PM/EM基因群，可对该数据库的神经胶质瘤样本进行分类，称为PM/EM分型法。通过进一步过滤去除非差异表达的一部分基因后，最终确定29个EM基因和39个PM基因，共68个基因，组成PM/EM分型的标志基因群(见表1)。并根据该39个PM基因mRNA表达量的平均值(即PM基因群平均表达量)与29个EM基因的平均表达量(即EM基因群平均表达量)的相对高低，确定PM/EM分型标准如下:
[0064]I)若PM基因群平均表达量大于EM基因群平均表达量，样本亚型为PMhigh ；
[0065]2)若PM基因群平均表达量等于EM基因群平均表达量，样本亚型为EMlwPMlw ；
[0066]3)若PM基因群平均表达量小于EM基因群平均表达量，样本亚型为EMhigh。
[0067]具体也可以根据神经胶质瘤样本中PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值(简称PM/ΕΜ比值)确定PM/EM分型标准:
[0068]I)若PM/EM的比值=1.2-5，样本亚型为PMhigh ；
[0069]2)若 PM/EM 的比值=0.9-1.1，样本亚型为 EM1otPM1ot ；
[0070]3)若PM/EM的比值=0-0.8，样本亚型为EMhigh,且不为O。
[0071] 表1.神经胶质瘤分型标志基因群的基因列表(共68个基因)
[0072]
【权利要求】
1.一种预测或辅助预测神经胶质瘤患者预后生存期的试剂盒，包括用于检测待测神经胶质瘤患者离体样本中PM基因群和EM基因群中的各个基因的表达量的试剂和比对卡； 所述PM基因群由如下39个基因组成:
ClOorf18,ClQLU Clorf106,C9orf140,CACNG4,CHD7、CSNK1E、EIF4EBP2、ETV1、FAM5C、KLRC3、LIX1L、L0C283174、LPHN3、LPPRl、MARCKS, MEX3A、MMP16、MYTl、NAVl、NLGNl、NOVAl、NXPHl、OLIGl、0LIG2、PATZ1、PCGF2、PDGFRA,P0LR2F、RFX7、S0X4、S0X6、S0X8、TACC2、TMCCl、TSHZl、ZEBl、ZNF22、ZNF462 ； 所述EM基因群由如下29个基因组成:
ACSS3、CDKN2C、DENND2A、DMRTA2、EGFR、EL0VL2、HS3ST3B1、ITGB8、LFNG, NC0A3、NES、NFIA、PDGFA、PMS2P11、P0U3F2、PRPF31、RNF180、SALL1、SEC61G、SEMA6D、SH0X2、SNX5、S0CS2、S0X9、TNFRSF19、TR10ΒΡ, UHRFl、VAV3、ZNF558 ； 所述比对卡记载如下内容: 若所述待测神经胶质瘤患者离体样本中所述PM基因群平均表达量大于或等于所述EM基因群平均表达量，则所述待测神经胶质瘤患者的预后生存期超过或候选超过1.9年； 若所述待测神经胶质瘤患者离体样本中所述PM基因群平均表达量小于所述EM基因群平均表达量，则所述待测 神经胶质瘤患者的预后生存期不超过或候选不超过1.9年。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于: 所述比对卡记载如下内容: 若所述待测神经胶质瘤患者离体样本中所述PM基因群平均表达量大于所述EM基因群平均表达量，则所述待测神经胶质瘤患者的预后生存期为或候选为3.7-4.9年或2.3-2.7年； 若所述PM基因群平均表达量等于所述EM基因群平均表达量，则所述待测神经胶质瘤患者的预后生存期为或候选为1.9-3.0年或1.9-2.5年； 若所述待测神经胶质瘤患者离体样本中所述PM基因群平均表达量小于所述EM基因群平均表达量，则所述待测神经胶质瘤患者的预后生存期为或候选为1.3-1.7年或1.1-1.6年。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于: 所述PM基因群平均表达量大于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为1.2-5 ； 所述PM基因群平均表达量等于所述EM基因群平均表达量无显著差异指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为0.9-1.1 ； 所述PM基因群平均表达量小于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为0-0.8，且不为O。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于: 所述比对卡记载如下内容A或B:
A: 所述PM基因群平均表达量大于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为1.714±0.032 ； 所述PM基因群平均表达量等于所述EM基因群平均表达量无显著差异指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为1.074±0.022 ； 所述PM基因群平均表达量小于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为0.592±0.012 ；
B: 所述PM基因群平均表达量大于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为1.427±0.034 ； 所述PM基因群平均表达量等于所述EM基因群平均表达量无显著差异指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为0.939 ±0.033 ； 所述PM基因群平均表达量小于所述EM基因群平均表达量指PM基因群平均表达量与EM基因群平均表达量的比值为0.460±0.031。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于: 所述试剂包括能与所述离体样本中的所述68个基因或各个基因的mRNA或各个基因的cRNA杂交的芯片； 所述芯片具体为人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于: 所述离体样本为离体神经胶质瘤组织。
7.—组用于预测或辅助预测神经胶质瘤患者预后生存期的基因群组，由PM基因群和EM基因群共68个基因组成: 所述PM基因群由如下39个基因组成:
ClOorf18,ClQLU Clorf106,C9orf140,CACNG4,CHD7、CSNK1E、EIF4EBP2、ETV1、FAM5C、KLRC3、LIX1L、L0C283174、LPHN3、LPPRl、MARCKS, MEX3A、MMP16、MYTl、NAVl、NLGNl、NOVAl、NXPHl、OLIGl、0LIG2、PATZ1、PCGF2、PDGFRA,P0LR2F、RFX7、S0X4、S0X6、S0X8、TACC2、TMCCl、TSHZl、ZEBl、ZNF22、ZNF462 ； 所述EM基因群由如下29个基因组成:
ACSS3、CDKN2C、DENND2A、DMRTA2、EGFR、EL0VL2、HS3ST3B1、ITGB8、LFNG, NC0A3、NES、NFIA、PDGFA、PMS2P11、P0U3F2、PRPF31、RNF180、SALL1、SEC61G、SEMA6D、SH0X2、SNX5、S0CS2、S0X9、TNFRSF19、TR10ΒΡ, UHRF1、VAV3、ZNF558。
8.权利要求1-6中任一所述的试剂盒或权利要求7所述的基因群组在制备预测或辅助预测神经胶质瘤患者预后生存期的产品中的应用。
9.权利要求7所述基 因群组作为标志物在制备预测或辅助预测神经胶质瘤患者预后生存期的产品中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104178556SQ201310202569
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月28日 优先权日:2013年5月28日
【发明者】樊小龙, 孙颖郁, 江涛 申请人:北京师范大学