一种提高白酒风味物质芽孢杆菌(Bacillus sp.)B-010固体培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高白酒风味物质芽孢杆菌（Bacillussp.）B-010固体培养方法，包含以下步骤：将芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，于30-40℃培养12-36h；液体种子培养：接种斜面种子，接种量为10-15%，30-40℃，100-300rpm，培养时间15-30h；固体种曲培养：接种的三级液体种子，拌匀，接种温度30-40℃，培养时间为15-30h；通风培养：以1-10‰的接种量接种的固体种曲，翻料混匀，培养时间16-30h，期间进行间歇鼓风，控制品温在40-60℃。利用本方法制曲，芽孢杆菌（Bacillussp.）B-010经固体培养后，α-乙酰乳酸脱羧酶活力为80-150U/g，糖化酶20U/g-50U/g，中性蛋白酶100U/g-500U/g，碱性蛋白酶300U/g-800U/g。另外该菌株还产生3-羟基丁酮的量为：10-20mg/g。
【专利说明】—种提高白酒风味物质芽孢杆菌(公C/7/?/s Sp.)B-010固体培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于酿酒的细菌固体培养方法，属生物工程领域，具体涉及一种由芽孢杆菌制备并应用于芝麻香白酒的细菌培养方法。
【背景技术】
[0002]在芝麻香白酒生产中，麸曲质量的优劣直接影响白酒的产量、质量与风格。随着芝麻香型白酒研究的进展，微生物在白酒酿造中的机理逐渐明了。其中，细菌具有一定的液化力、糖化力、蛋白质分解力和脂肪分解力，为美拉德反应提供多种氨基酸，推进美拉德反应的进行，生成芝麻香香味成份及其前体，芽孢杆菌能产生大量中/碱性蛋白酶，原料中的蛋白质通过细菌蛋白酶的作用，为美拉德反应提供多种氨基酸，这些氨基酸是生成芝麻香香味成份的前体物质；另外，芽孢杆菌能够通过自身代谢产生3-羟基丁酮，进一步合成四甲基吡嗪等芝麻香微量香味物质，是形成芳香物质的重要菌源。因此细菌是提高芝麻香型白酒质量的有效菌株，在芝麻香型白酒生产中的作用日益受到重视。
[0003]本项目研究选育了一株高产脱羧酶、中/碱性蛋白酶，及少量3-羟基丁酮的芽孢杆菌B-010，经过一、二、三级液体种子培养、固体种曲培养、通风培养，制成芽孢杆菌{Bacillus sp.) B-010，在不改变原有工艺的前提下添加到芝麻香白酒生产中，进行连续发酵试验。结果表明:添加芽孢杆菌B-010的芝麻香白酒窖池出酒率无明显变化，但是优质酒产量平均提高15.7%，最高可达24.4%，芝麻香型白酒中四甲基吡嗪、3-羟基丁酮、高级醇类、高级酯类、以及3-甲硫基丙醇等风味物质明显提高，芝麻香白酒香味协调，尾净，风格较突出，真正达到降低消耗，增加效益的目的。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种提高白酒风味物质芽孢杆菌sp.) B-OlO固体培养方法。
[0005]本方法主要通过一、二、三级液体种子培养、固体种曲培养、通风培养，制成芽孢杆麗{Bacillus sp.) B-OlO0 一种芽孢杆菌(ifeciJrJrW1S sp.) B-010固体培养方法,其特征在于包含以下步骤:
将芽孢杆菌(feci77心sp.) B-010 (CJMCC N0.1922)接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，于 30-40°C培养 12-36h。
[0006]一、二、三级液体种子培养:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH7.0，灭菌，接种芽孢杆菌 UaciWm sp.) B-010 (CJMCC N0.1922)接种量为 10-15%，30_40°C，100-300rpm，培养时间 15_30h。
[0007]固体种曲培养:取麸皮加水润料2-6h，蒸料20-80min，使水分控制在40_60%，接种三级液体种子，拌匀，接种温度30-40°C，培养时间为15-30h，期间翻曲，控制品温在30-60。。。
[0008]通风培养:取麸皮，加水润粮了 2-8h，蒸料20-90min，使水分控制在40_60%，用酒糟调整酸度1.0%-2.0%，以1_10%。的接种量接种固体种曲，翻料混匀，培养时间16-30h，期间进行间歇鼓风，控制品温在40-60°C。作为对本方法的进一步改进，通风培养过程中要2h-10h以后间歇通风，控制顶温不超过40-60°C，成品酸度〈1%-3.5%。
[0009]作为对本技术方案的进一步改进，通风培养要2-10h以后间歇通风，控制顶温不超过40-60°C，成品酸度〈1%-3.5%。
[0010]作为对本技术方案的进一步改进，用葡萄糖蛋白胨液体培养基中培养，产脱羧酶的量为300-500U/mL，产3-羟基丁酮的量为5_20g/L。
[0011]作为对本技术方案的进一步改进，选择的葡萄糖蛋白胨液体培养基为:葡萄糖1-5%,蛋白胨0.5-5%，牛肉膏0.1-1%，酵母膏0.1-1%，硫酸镁0.001-0.1%，磷酸氢二钾0.1-2%，硫酸铵0.1-5%，硫酸锌0.001-0.01%。在工业化的生产中可用牛肉汁代替，牛肉汁的用量为30-80%。
[0012]本发明的芽孢杆菌sp.) B-OlO菌株具有以下培养特征:牛肉膏蛋白胨培养基37°C培养24h，菌落呈现圆形，乳白色，凸起，边缘有绒毛不规整，表面光滑粘稠不易挑起。
[0013]本发明的芽孢杆菌sp.) B-OlO菌株具有以下形态特征:于光学显微镜观察芽孢杆菌的菌体形态，该菌株特征为:菌体杆状，单生，大小约0.8X1.65ym(TO),W芽孢，椭圆形，包囊不膨大，中生或次中生。
[0014]本发明的芽孢杆菌5/7.) B-OlO具有以下生物学特征:芽孢杆菌{Bacillus sp.) B-OlO的生长温度为20_60°C，最适生长温度为30_50°C，在pH3_8的范围内均能生长。
[0015]本发明的芽孢杆菌sp.)B-010菌株在牛肉膏蛋白胨培养基和葡萄糖琼脂培养基培养24h，连续传代数代培养，其培养特征及形态均无明显变化，该菌株的生物学性状稳定。
[0016]本发明涉及的应用于芝麻香白酒生产的细菌培养方法具有如下显著进步:
O培养应用于生产的菌种B-010是一株耐高温的芽孢杆菌,产香功能较好；
2)利用该方法培养的B-010，香气浓郁，曲料粘稠，氨味较重；
3)利用该方法培养的B-010，适合于酿酒工艺中的高温堆积高温发酵，丰富了原生产用细菌菌种类型。
[0017]利用本方法制曲，一、二、三级液体种子培养中三级液体种子细胞数:10 X 108-100 X 108个/mL ;种曲细胞数:100 X 108-500 X 108个/g ;通风曲细胞数:100 X 108-1000 X 108个/g。用葡萄糖蛋白胨液体培养菌株B-OlO脱羧酶活力可达200-600U/mL，产 3-羟基丁酮的量为:5_20g/L。
[0018]芽孢杆菌(feci77心sp.) B-010经固体培养后，α-乙酰乳酸脱羧酶活力为80-150U/g 糖化酶 20U/g-50U/g，中性蛋白酶 100U/g_500U/g，碱性蛋白酶 300U/g_800U/go另外该菌株还产生3-轻基丁酮的量为:10-20mg/g。
[0019]将该菌种应用于芝麻香白酒生产中，发酵结束后，经微量成分分析可知，不仅能提高四甲基吡嗪、2，3- 丁二醇、3-羟基丁酮等重要风味物质的含量，通过添加新菌种B-010，增加体系中的α -乙酰乳酸脱羧酶和3-羟基丁酮，从而提高2，3- 丁二醇、3-羟基丁酮、四甲基吡嗪等相关物质的含量,丰富芝麻香型白酒香气成分；同时可大大增加酿造体系里中/碱性蛋白酶的含量，增加体系中氨基酸的含量从而为美拉德反应提供大量的前体物质；此外，B-OlO还能产生少量的糖化酶，为提高出酒率做出贡献。
[0020]由此可见，在芝麻香型白酒的酿造中，在不改变原有酿酒工艺的基础上，将固体培养的芽孢杆菌(feci77心sp.) B-010以适当比例添加到原生产中，能够有效的丰富白酒的香气成分，提闻白酒品质。
【具体实施方式】
[0021]以下是本发明的一种提高白酒风味物质芽孢杆菌sp.)B-010固体培养方法的具体实施例，下面的实施例是对本发明的技术方案做进一步描述。但，本发明的保护范围不限于这些实施例，凡是不背离本发明技术方案构思的改变或对其技术特征的等同代替均包含在本发明的保护范围之内。
[0022]实施方式一:
a)将芽孢杆菌心sp.) B-010 (CJMCC N0.1922)接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，于30°C培养12h。
[0023]b) 一、二、三级液体种子培养:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，ρΗ7.0,121°C灭菌20min，接种步骤a)的斜面种子，接种量为10%，30°C，lOOrpm，培养时间15h。
[0024]c)固体种曲培养:取麸皮加水润料2h，蒸料20min，使水分控制在40%，接种步骤b)的三级液体种子，拌匀，接种温度30°C，培养时间为15h，期间翻料，控制品温在30°C。
[0025]d)通风培养:取麸皮，加水润粮2h，蒸料20min，使水分控制在40%，用酒糟调整酸度1.0%，以1_10%。的接种量接种步骤C)的固体种曲，翻料混匀，培养时间16h，期间进行间歇鼓风，控制品温在40°C，即可得到本方法所述的芽孢杆菌。
[0026]实施方式二:
a)将芽孢杆菌心sp.) B-010 (CJMCC N0.1922)接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，于30-40°C培养12-36h。
[0027]b) 一、二、三级液体种子培养:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH7.0，121°C灭菌20min，接种步骤a)的斜面种子，接种量为15%，40°C，300rpm，培养时间30h。
[0028]c)固体种曲培养:取麸皮加水润料6h，蒸料80min，使水分控制在60%，接种步骤b)的三级液体种子，拌匀，接种温度40°C，培养时间为30h，期间翻料，控制品温在60°C。
[0029]d)通风培养:取麸皮，加水润粮8h，蒸料90min，使水分控制在60%，用酒糟调整酸度2.0%，以1_10%。的接种量接种步骤c)的固体种曲，翻料混匀，培养时间30h，期间进行间歇鼓风，控制品温在60°C，即可得到本方法所述的芽孢杆菌。
[0030]实施方式三:
a)将芽孢杆菌心sp.) B-010 (CJMCC N0.1922)接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，于30-40°C培养12-36h。
[0031]b) 一、二、三级液体种子培养:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，ρΗ7.0,121°C灭菌20min，接种步骤a)的斜面种子，接种量为13%，35°C，200rpm，培养时间23h。
[0032]c)固体种曲培养:取麸皮加水润料4h，蒸料50min，使水分控制在50%，接种步骤
b)的三级液体种子，拌匀，接种温度35°C，培养时间为23h，期间翻料，控制品温在45°C。
[0033]d)通风培养:取麸皮，加水润粮5h，蒸料55min，使水分控制在50%，用酒糟调整酸度1.0%-2.0%，以1_10%。的接种量接种步骤c)的固体种曲，翻料混匀，培养时间24h，期间进行间歇鼓风，控制品温在50°C。即可得到本方法所述的芽孢杆菌。
[0034]利用本方法制曲，一、二、三级液体种子培养中三级液体种子细胞数:10 X 108-100 X 108个/mL ;种曲细胞数:100 X 108-500 X 108个/g ;通风曲细胞数:100 X 108-1000 X 108个/g。用葡萄糖蛋白胨液体培养菌株B-OlO脱羧酶活力可达200-600U/mL，产 3-羟基丁酮的量为:5_20g/L。
[0035]芽孢杆菌(feci77心sp.) B-010经固体培养后，α-乙酰乳酸脱羧酶活力为80-150U/g，糖化酶 20U/g-50U/g，中性蛋白酶 100U/g_500U/g，碱性蛋白酶 300U/g_800U/g。另外该菌株还产生3-羟基丁酮的量为:10-20mg/g。
[0036]将该菌种应用于芝麻香白酒生产中，发酵结束后，经微量成分分析可知，不仅能提高四甲基吡嗪、2，3- 丁二醇、3-羟基丁酮等重要风味物质的含量，通过添加新菌种B-010，增加体系中的α -乙酰乳酸脱羧酶和3-羟基丁酮，从而提高2，3- 丁二醇、3-羟基丁酮、四甲基吡嗪等相关物质的含量见下表，丰富芝麻香型白酒香气成分；同时可大大增加酿造体系里中/碱性蛋白酶的含量，增加体系中氨基酸的含量从而为美拉德反应提供大量的前体物质；此外，Β-010还能产生少量的糖化酶，为提高出酒率做出贡献。
[0037]由此可见，在芝麻香型白酒的酿造中，在不改变原有酿酒工艺的基础上，将固体培养的芽孢杆菌(feci77心sp.) B-010以适当比例添加到原生产中，能够有效的丰富白酒的香气成分，提闻白酒品质。
【权利要求】
1.一种提高白酒风味物质芽孢杆菌(^3ci77i/5.sp.)B-010固体培养方法,其特征在于包含以下步骤: a)将芽孢杆菌Uaci77心sp.) B-OlO (CJMCC N0.1922)接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，于30-40°C培养12-36h ； b)一、二、三级液体种子培养:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH7.0，121°C灭菌20min，接种步骤a)的斜面种子，接种量为10_15%，30-40°C，100-300rpm,培养时间 15-30h ； c)固体种曲培养:取麸皮加水润料2-6h，蒸料20-80min，使水分控制在40_60%，接种步骤b)的三级液体种子，拌匀，接种温度30-40°C，培养时间为15-30h，期间翻料，控制品温在 30-60 0C ； d)通风培养:取麸皮，加水润粮2-8h，蒸料20-90min，使水分控制在40_60%，用酒糟调整酸度1.0%-2.0%，以1_10%。的接种量接种步骤c)的固体种曲，翻料混匀，培养时间16-30h,期间进行间歇鼓风，控制品温在40-60°C。
2.根据权利要求1所述的一种提高白酒风味物质芽孢杆菌sp.) B-010培养方法，其特征在于:所述的通风培养要2-10h以后间歇通风，控制顶温不超过40-60°C，成品酸度〈1%-3.5%。
3.根据权利要求1所述的一种提高白酒风味物质芽孢杆菌sp.) B-010培养方法，其特征在于:用葡萄糖蛋白胨液体培养基中培养，产脱羧酶的量为300-500U/mL，产3-羟基丁酮的量为5-20g/L。
4.根据权利要求1所述的一种提高白酒风味物质芽孢杆菌(Bacillussp.) B-OlO培养方法，其特征在于:选择的葡萄糖蛋白胨液体培养基为，葡萄糖1_5%，蛋白胨0.5-5%，牛肉膏0.1-1%，酵母膏0.1-1%，硫酸镁0.001-0.1%，磷酸氢二钾0.1-2%，硫酸铵0.1-5%，硫酸锌 0.001-0.01%。
【文档编号】C12N1/20GK104250622SQ201310259607
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月27日 优先权日:2013年6月27日
【发明者】袁建国, 赵纪文, 李峰, 任明 申请人:山东省中协食品添加剂研究开发中心, 山东扳倒井股份有限公司