两亲性α螺旋自组装肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及衍生自SEQ ID NO:1的两亲性α螺旋自组装肽及其在蛋白生产和纯化中的应用。与目的蛋白融合表达时，所述两亲性α螺旋自组装肽能够诱导融合蛋白在胞内形成活性聚集体，且与SEQ ID NO:1的多肽相比，形成的活性聚集体在细胞中的空间分布被改变，改善了宿主细胞生长状态，提高了融合蛋白的产量。
【专利说明】两亲性α螺旋自组装肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域。具体地说，本发明涉及新的两亲性α螺旋自组装肽及 其在蛋白生产和纯化中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着人们对酶制剂、蛋白药物等蛋白和多肽类产品的需求日益增加，利用原核系 统表达重组蛋白在工业生物技术中的应用变得越来越广泛。在原核系统中表达外源基因 时，目的蛋白容易以不可溶的蛋白聚集体(也称包涵体)的形式存在[1]。传统观点认为，包 涵体是指多肽错误折叠形成的没有生物学活性的不可溶沉淀[2]。然而，蛋白以包涵体形式 表达有很多优点，比如蛋白表达量大、纯度较高、分离操作简便、避免蛋白酶降解等，并且适 用于生产对细胞有毒的外源蛋白或多肽。但是，包涵体形式表达的蛋白需经过体外的变复 性和纯化操作才能得到具有生物活性的功能性蛋白。目前蛋白变复性技术仍存在成本高、 收率低、技术复杂等问题[3]，极大地限制了包涵体表达形式在实际生产中的应用。
[0003] 活性聚集体的发现改变了人们对包涵体的传统看法[4-6]。研究表明，通过调整表 达条件或者融合表达能引起聚集的结构单元可以得到具有部分活性的蛋白聚集体。这种不 溶、具有生物活性的蛋白聚集体继承了包涵体表达蛋白的优势，同时也避免了复杂的变复 性操作。
[0004] 本发明人先前的研究发现一些两亲性自组装短肽在与目的蛋白融合表达时可以 诱导融合蛋白在大肠杆菌中形成活性蛋白聚集体[7-9]。这样的自组装两亲性短肽二级结 构简单，形成的聚集体比活性高，且制备十分方便。
[0005] 本发明对已有的两亲性自组装短肽进行改造，使得可以改变活性聚集体在细胞内 的分布，改善了宿主细胞的生长状态，同时提高目的蛋白的产量。这样的改进拓展了两亲性 自组装短肽在蛋白生产和纯化方面的应用。
[0006] 发明概述
[0007] 在第一方面，本发明提供了一种多肽，其包含衍生自SEQ ID Ν0:1的氨基酸序列， 所述氨基酸序列与SEQ ID Ν0:1相比含有选自K4E/E1K、K4E/E8K、K9E/E12K、K15E/E12K和 Κ13Ε/Ε16Κ的一或多种双突变，其中当所述多肽作为与目的蛋白形成的融合蛋白在宿主细 胞中表达时，所述融合蛋白能够在所述宿主细胞内形成活性聚集体。
[0008] 在一些实施方案中，本发明的多肽包含选自SEQ ID Ν0:2、SEQ ID Ν0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、 SEQ ID N0:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20 的氨基酸序列。
[0009] 在一些实施方案中，当所述多肽作为与目的蛋白形成的融合蛋白在宿主细胞中表 达时，所述融合蛋白的蛋白产量与由SEQ ID N0:1的多肽与所述目的蛋白形成的融合蛋白 的蛋白产量相比是增加的。
[0010] 在第二方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明的上述的多肽。 toon] 在第三方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含目的蛋白和本发明上述的多肽。 在一些实施方案中，所述目的蛋白和所述多肽通过接头相连。在一些实施方案中，所述接头 包含SEQ ID N0:40的序列。在另一些实施方案中，所述接头包含切割位点。所述切割位点 可以选自化学切割位点、酶法切割位点和自切割位点，优选为自切割位点。在一些实施方案 中，所述自切割位点为内含肽，例如序列示于SEQ ID N0:41的内含肽。
[0012] 在第四方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码本发明的融合蛋白的核 苷酸序列。
[0013] 在第五方面，本发明提供了表达构建体，其包含本发明上述的多核苷酸。
[0014] 在第六方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明上述的多核苷酸或以本发明 上述的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白。
[0015] 在第七方面，本发明提供了产生和纯化目的蛋白的方法，所述方法包括以下步 骤：
[0016] (a)培养本发明上述的宿主细胞，从而表达所述融合蛋白；
[0017] (b)裂解所述宿主细胞，然后去除细胞裂解物的可溶部分，回收不溶部分。
[0018] 本发明产生和纯化目的蛋白的方法的一些实施方案中，如果其中所述融合蛋白中 的目的蛋白和本发明的多肽通过含有切割位点的接头相连，所述方法还可以包括以下步 骤：
[0019] (c)通过切割所述切割位点从步骤（b)获得的不溶部分释放可溶的目的蛋白；
[0020] (d)去除步骤（c)中的不溶部分，回收含有所述目的蛋白的可溶部分。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1.示出两亲性α螺旋自组装肽结构及其与磷脂相互作用示意图。A :18A的螺 旋轮图；B :18Arev的螺旋轮图；C :"Snorkel"模型结构示意图。
[0022] 图2.示出18A的自N端起第4位的赖氨酸（K)与第1位的谷氨酸（E)形成的一个 稳定螺旋的氨基酸对。
[0023] 图3.示出基于18A变体的融合蛋白表达载体图谱。A :不带切割位点；B :带自切 割位点。
[0024] 图4.示出包含18A或18A变体和LipA的融合蛋白表达分析。A :细胞生长状态； B :LipA酶活测定结果。
[0025] 图5.示出包含18A或18A变体的GFP融合蛋白聚集体在大肠杆菌中分布的结果。
[0026] 图6.示出18Av3、18Av4、18Av6和18Av8与GFP和LipA的融合蛋白的胞内分布比 较。
[0027] 图L示出18Arev和18Av8用于产生和纯化LipA的结果。
[0028] 图8.示出18Arev和18Av8用于产生和纯化ΑΜΑ的结果。
[0029] 发明详述
[0030] 本发明人先前的研究发现序列示于SEQ ID NO: 1的两亲性α螺旋自组装肽18Α 在与目的蛋白形成融合蛋白并在宿主细胞表达后能介导融合蛋白在细胞中形成不可溶的 活性聚集体。活性聚集体指的是聚集体中的目的蛋白尽管不可溶但仍然能够保持全部或部 分生物学活性。"两亲性α螺旋自组装肽18Α"与"自组装肽18Α"和"18Α"在本文可互换 使用，具有相同含义。
[0031] 两亲性α螺旋自组装肽18A (如图1A)具有如下特点：1)与普通α螺旋肽相比具 有独特的亲水、疏水氨基酸排列，使得在形成的α螺旋结构的一侧主要为亲水性氨基酸， 而在另一侧主要为疏水性氨基酸。2)根据"Snorkel"模型[10](如图1C)，两亲性α螺旋 自组装肽18Α可以同磷脂或油脂结合。这种结合主要是通过疏水相互作用以及18Α上带正 电的赖氨酸与带负电的磷脂分子的静电相互作用。
[0032] 本发明人发现，在18Α的螺旋的亲水侧有5对由空间位置相邻的带正电荷的氨基 酸和带负电荷的氨基酸形成的氨基酸对：自Ν端起第4位的赖氨酸（Κ)与第1位的谷氨酸 (E);自Ν端起第4位的赖氨酸（Κ)与第8位的谷氨酸（E);自Ν端起第9位的赖氨酸（Κ)与 第12位的谷氨酸（E);自起Ν端第15位的赖氨酸（Κ)与第12位的谷氨酸（E);自Ν端起第 13位的赖氨酸（Κ)与第16位的谷氨酸（Ε)。
[0033] 在本文中，术语"氨基酸对"是指α螺旋中正负电荷互补、空间位置相邻的氨基酸 对。本文中，空间位置相邻是指构成氨基酸对的两个氨基酸残基在空间上位于相邻的螺圈， 在一级序列上这两个氨基酸残基之间间隔不超过5个氨基酸残基。图2示例性示出了 18Α 的自Ν端起第4位的赖氨酸（Κ)与第1位的谷氨酸（Ε)形成的一个氨基酸对。不受到任何 理论的限制，推测氨基酸对中的两个残基之间可以形成盐桥，进一步稳定α螺旋结构。
[0034] 在本研究中，本发明人令人惊奇地发现将两亲性α螺旋自组装肽18Α的5个氨基 酸对分别或者组合进行突变获得的变体多肽在与目的蛋白形成融合蛋白并在宿主细胞表 达后，同样能够诱导融合蛋白在细胞中形成活性聚集体，同时所形成的的活性聚集体在细 胞中的空间分布被改变，改善了宿主细胞的生长状态，提高了融合蛋白的产量。
[0035] 因此，本发明提供了一种多肽，其包含衍生自SEQ ID Ν0:1 (18Α)的氨基酸序列， 所述氨基酸序列与SEQ ID Ν0:1相比含有选自K4E/E1K、K4E/E8K、K9E/E12K、K15E/E12K和 Κ13Ε/Ε16Κ的一或多种双突变。这样的多肽在本文中也称作"18Α变体"。当本发明的18Α 变体作为与目的蛋白形成的融合蛋白在宿主细胞中表达时，所述融合蛋白能够在所述宿主 细胞内形成活性聚集体。
[0036] 本发明还提供包含编码本发明18Α变体的核苷酸序列的分离的多核苷酸。
[0037] 在本文中，双突变Κ4Ε/Ε1Κ表示SEQ ID Ν0:1自Ν端起第4位的赖氨酸（Κ)突变 为谷氨酸（Ε)，且SEQ ID Ν0:1自Ν端起第1位的谷氨酸（Ε)突变为赖氨酸（Κ);Κ4Ε/Ε8Κ表 示SEQ ID Ν0:1自Ν端起第4位的赖氨酸（Κ)突变为谷氨酸（Ε)，且SEQ ID Ν0:1自Ν端起 第8位的谷氨酸（Ε)突变为赖氨酸（Κ);Κ9Ε/Ε12Κ表示SEQ ID Ν0:1自Ν端起第9位的赖 氨酸（Κ)突变为谷氨酸（Ε)，且SEQ ID Ν0:1自Ν端起第12位的谷氨酸（Ε)突变为赖氨酸 (Κ);Κ15Ε/Ε12Κ表示SEQ ID Ν0:1自Ν端起第15位的赖氨酸（Κ)突变为谷氨酸（Ε)，且SEQ ID Ν0:1自Ν端起第12位的谷氨酸（Ε)突变为赖氨酸（Κ);Κ13Ε/Ε16Κ表示SEQ ID Ν0:1自 Ν端起第13位的赖氨酸（Κ)突变为谷氨酸（Ε)且SEQ ID NO: 1自Ν端起第16位的谷氨酸 (E)突变为赖氨酸（K)。
[0038] 在一些实例中，本发明提供的18A变体包含的突变以及氨基酸序列和核苷酸序列 如表1所示。
[0039] 表1示例性18A变体
[0040]
【权利要求】
1. 一种多肽，其包含衍生自SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID N0:1 相比含有选自 K4E/E1K、K4E/E8K、K9E/E12K、K15E/E12K和K13E/E16K的一或多种双突 变，其中当所述多肽作为与目的蛋白形成的融合蛋白在宿主细胞中表达时，所述融合蛋白 能够在所述宿主细胞内形成活性聚集体。
2. 权利要求 1 的多肽，其包含选自 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、 SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:19 和 SEQ ID NO:20 的氨基酸序列。
3. 权利要求1或2的多肽，其中当所述多肽作为与目的蛋白形成的融合蛋白在宿主细 胞中表达时，所述融合蛋白的蛋白产量与由SEQ ID N0:1的多肽与所述目的蛋白形成的融 合蛋白的蛋白产量相比是增加的。
4. 分离的多核苷酸，其编码权利要求1-3任一项的多肽。
5. 融合蛋白，其包含目的蛋白和权利要求1-3任一项的多肽。
6. 权利要求5的融合蛋白，其中所述目的蛋白和所述多肽通过接头相连。
7. 权利要求6的融合蛋白，其中所述接头包含SEQ ID N0:40的序列。
8. 权利要求6的融合蛋白，其中所述接头包含切割位点。
9. 权利要求8的融合蛋白，其中所述切割位点选自化学切割位点、酶法切割位点和自 切割位点。
10. 权利要求9的融合蛋白，其中自切割位点为内含肽。
11. 权利要求10的融合蛋白，其中所述内含肽的序列示于SEQ ID N0:41。
12. 分离的多核苷酸，其包含编码权利要求5-11中任一项的融合蛋白的核苷酸序列。
13. 表达构建体，其包含权利要求12的多核苷酸。
14. 宿主细胞，其包含权利要求12的多核苷酸或以权利要求13的表达构建体转化，其 中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白。
15. 产生和纯化目的蛋白的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 培养权利要求14的宿主细胞，从而表达所述融合蛋白；和 (b) 裂解所述宿主细胞，然后去除细胞裂解物的可溶部分，回收不溶部分。
16. 权利要求15的方法，其中所述融合蛋白中的所述目的蛋白和所述多肽通过含有切 割位点的接头相连，所述方法还包括以下步骤： (c) 通过切割所述切割位点从步骤（b)获得的不溶部分释放可溶的目的蛋白； (d) 去除步骤（c)中的不溶部分，回收含有所述目的蛋白的可溶部分。
【文档编号】C12N1/21GK104250288SQ201310265579
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年6月28日
【发明者】林章凛, 周碧红, 邢磊, 赵青 申请人:清华大学