一种高保真dna聚合酶及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了一种高保真DNA聚合酶、编码该高保真DNA聚合酶的基因，以及该高保真DNA聚合酶的制备方法，及其在核酸扩增中的应用。本发明公开的高保真DNA聚合酶，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。该高保真DNA聚合酶能够扩增高GC含量的核酸模板、样品纯度较低的核酸模板，同时，也能实现对极低的模板量的扩增，大幅提高了高保真DNA聚合酶的灵敏度和扩增效率，同时具有较高的保真性，适合各类PCR及对扩增保真性要求较高的实验，也适合作为PCR扩增试剂盒中的高保真DNA聚合酶。
【专利说明】一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] DNA聚合酶广泛应用于分子生物学研究中，如DNA测序、标记、突变和核酸扩增等 反应。耐热DNA聚合酶由于其热稳定性，在核酸高温变性的条件下不会失活，是目前核酸扩 增的常用酶。根据序列的不同，DNA聚合酶可以分为六大族：A、B、C、D、X和Y，耐热DNA聚 合酶主要属于A族和B族，并具有相似的生物学性质。A族DNA聚合酶的代表是Taq DNA聚 合酶，该聚合酶分离自Thermus aquaticus YT-1的基因组，具有5'_3'的DNA外切酶活性 和5' -3' DNA聚合酶活性，其菌株生长于75°C左右的温泉中，由于其能耐受高温变性，自发 现后被广泛应用于PCR反应，目前已被开发成多种试剂盒；后来的研究又从其他物种中分 离出了多种A族DNA聚合酶，但由于其不具有3' -5'的外切酶校正活性，容易在扩增时掺 入错误的碱基，导致不能忠实地扩增模板，直到B族DNA聚合酶的发现，才使得高保真地扩 增模板成为可能。B族DNA聚合酶主要分离自古细菌，包括广古菌、泉古菌、纳古菌和初古 菌，其具有更高的热稳定性，同时其3' -5'外切酶校正活性能识别错误掺入延伸链中的碱 基，并将其切下，利用DNA聚合酶活性添加为与模板互补的碱基，从而保证了新扩增链与模 板的高度一致性。
[0003] 超嗜热古菌具有严格厌氧和超嗜热生长的特性，如Pyrodictium和Methanopyrus 属的物种能在ll〇°C生长，而低于80°C则不能生长；从大西洋中脊3650米的超热烟囱中分 离的Pyrolobus fumarii是目前已知最耐热的古菌，其能在高达113°C的高温条件下增值， 而低于90°C则停止生长。目前已经从Pyrococcus和Thermococcus属中分离出了许多DNA 聚合酶，某些DNA聚合酶在极高的温度下仍能保持稳定，被应用于分子生物学研究，尤其是 核酸扩增中。其中，Pfu DNA聚合酶是一种来源于Pyrococcus furiosus的热稳定的DNA聚 合酶，具有5' -3' DNA聚合酶活性和3' -5'的外切酶活性。由于Pfu DNA聚合酶有3' -5' 的外切酶活性，因此在核酸扩增过程中出错的机率大大降低，保真性约为Taq DNA聚合酶的 6倍。目前，Pfu DNA聚合酶通常作为首选的高保真DNA聚合酶，用于核酸的高保真扩增，但 是，在实际应用过程中，Pfu DNA聚合酶对引物和样品的结构、纯度和浓度要求比较高，反应 灵敏度较低，扩增效率较低，限制了 Pfu DNA聚合酶的使用和推广。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高扩增效率的高保真DNA聚合 酶及其制备和应用。
[0005] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下的技术方案：
[0006] 本发明提供了一种高保真DNA聚合酶，命名为Tco DNA聚合酶，其具有（I )、（11) 所示的氨基酸序列中任意一个：
[0007] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0008] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。
[0009] 本发明提供了一种Tco DNA聚合酶在核酸扩增中的应用，Tco DNA聚合酶具有 (I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一个：
[0010] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0011] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。
[0012] 本发明提供了一种编码Tco DNA聚合酶的DNA分子，其具有I、II所示的核苷酸序 列中任意一个：
[0013] I具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；
[0014] II具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得 的核苷酸序列；
[0015] Tco DNA聚合酶具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一个：
[0016] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0017] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。
[0018] 本发明提供了一种重组载体，其含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子，该DNA分子 具有具有I、II所示的核苷酸序列中任意一个：
[0019] I具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；
[0020] II具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得 的核苷酸序列；
[0021] Tco DNA聚合酶具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一个：
[0022] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0023] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。
[0024] 优选地，上述的重组载体为含有T7启动子的重组载体。
[0025] 本发明提供了一种PCR扩增试剂盒，其含有Tco DNA聚合酶，该Tco DNA聚合酶具 有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一个：
[0026] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0027] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。
[0028] 本发明还提供一种高保真DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
[0029] 获得具有编码如（I )或（II )所限定的氨基酸序列的DNA分子；
[0030] 取上述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；
[0031] 取上述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；
[0032] 诱导上述转化体表达融合蛋白，经分离纯化，获得高保真DNA聚合酶；
[0033] ( I )为：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0034] ( II )为：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨 基酸获得的氨基酸序列。
[0035] 优选地，具有编码如（I )或（II )所限定的氨基酸序列的DNA分子，具体为具有 I、II所示的核苷酸序列中任意一个：
[0036] I具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；
[0037] II具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得 的核苷酸序列。
[0038] 优选地，获得具有编码如（I )或（II )所限定的氨基酸序列的DNA分子，具体为 从超嗜热古菌Thermococcus coalescens中分离、重组构建出上述的DNA分子；上述的超嗜 热古菌购自日本微生物菌种保藏中心，其保藏编号为JCM:12540,其分离自伊豆小笠原海沟 水耀海山的超高温海水中，为0. 5-2 μ Μ的不规则球形，在指数生长期时，能融合为约5 μ Μ 的融合细胞；该细菌生长于57-90°C，pH值为5. 2-8. 7,其最适pH值为6. 5,最佳生长温度为 87°C，具有超强嗜热生长特性；
[0039] ( I )为：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0040] ( II )为：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨 基酸获得的氨基酸序列。
[0041] 优选地，一种高保真DNA聚合酶的制备方法中所用到的宿主细胞，为原核系统宿 主细胞。
[0042] 优选地，一种高保真DNA聚合酶的制备方法中所用到的宿主细胞，为大肠杆菌宿 主细胞。
[0043] 优选地，一种高保真DNA聚合酶的制备方法中的纯化操作，具体为，采用凝胶介质 纯化。
[0044] 在本发明的一些实施例中，一种制备Tco DNA聚合酶的方法，具体为：
[0045] (1)通过同源比对Thermococcus属不同DNA聚合酶基因核苷酸序列，以相似性较 高的区段设计引物，扩增Thermococcus coalescens DNA聚合酶基因片段，再根据得到的序 列信息，不断扩增得到基因的全长序列如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列；
[0046] (2)分析上述基因结构，扩增成熟蛋白编码序列，通过重叠 PCR得到如SEQ ID N0:2 所示的基因片段，构建至含T7启动子的载体上，得到重组载体；
[0047] (3)将上述重组载体转化至宿主细胞E. coli Rosetta(DE3)中，得到能生产该高保 真DNA聚合酶的转化体；
[0048] (4)扩大培养该转化体，诱导后用于制备该高保真DNA聚合酶；
[0049] (5)利用镍凝胶介质和肝素层析柱依次纯化，获得该高保真DNA聚合酶。
[0050] 本发明提供了一种高保真DNA聚合酶及其制备方法和在核酸扩增中的应用。该高 保真DNA聚合酶具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序 列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。实验数据表明，采用本发明所 公布的制备方法所制备得的高保真DNA聚合酶的纯度达95%以上，与Pfu高保真DNA聚合 酶相比，本发明提供的高保真DNA聚合酶能够扩增高GC含量的核酸模板、样品纯度较低的 核酸模板，同时，也能实现对极低的模板量的扩增，大幅提高了高保真DNA聚合酶的灵敏度 和扩增效率，同时具有较高的保真性，适合各类PCR及对扩增保真性要求较高的实验，也适 合作为PCR扩增试剂盒中的高保真DNA聚合酶。
【专利附图】
【附图说明】
[0051] 图1示Tco DNA聚合酶的纯化结果；其中，泳道1示纯化的Tco DNA聚合酶；泳道 Μ不蛋白分子量Marker ;
[0052] 图2示Tco DNA聚合酶扩增不同长度的核酸片段的结果；其中，泳道Μ示DNA分子 量Marker ;泳道1示人基因组800bp β -Actin片段；泳道2示人基因组1. 3kb β -globin片 段；泳道3示人基因组1. 5kb β -globin片段；泳道4示人基因组3. Okb β -globin片段；泳 道5示4. lkb β -globin片段；泳道6示λ基因组8kb片段；
[0053] 图3示Tco DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增高GC含量核酸模板和含抑制剂模板 的结果；其中，1?4示Tco DNA聚合酶扩增结果；a?d示PfuDNA聚合酶扩增结果；泳道Μ 示DNA分子量Marker ;泳道1示人全血237bp片段；泳道2示大肠杆菌菌液1. 5kbl6srDNA 片段；泳道3示Thermus thermophilus HB8基因2kb片段；泳道4示人基因组1. 5kb片段； 泳道a示人全血扩增237bp片段；泳道b示大肠杆菌菌液1. 5kbl6srDNA片段；泳道c示 Thermus thermophilus HB8基因2kb片段；泳道d不人基因组1. 5kb片段；
[0054] 图4示Tco DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增不同模板量的pUC19质粒的结果； 其中1?5示Tco DNA聚合酶扩增结果；6?10示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道Μ示DNA 分子量Marker ;泳道1示10ng的pUC19;泳道2示lng的pUC19 ;泳道3示0· lng的pUC19 ; 泳道4示0· Olng的pUC19 ;泳道5示0· OOlng的pUC19 ;泳道6示10ng的pUC19 ;泳道7示 lng 的 pUC19 ;泳道 8 示 0· lng 的 pUC19 ;泳道 9 示 0· Olng 的 pUC19 ;泳道 10 示 0· OOlng 的 pUC19 ；
[0055] 图5示Tco DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增不同模板量的人基因组DNA的结果； 其中1?4示Tco DNA聚合酶扩增结果；5?8示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道Μ示DNA 分子量Marker ;泳道1示25ng的人基因组1. 3kb片段；泳道2示10ng的人基因组1. 3kb 片段；泳道3示5ng的人基因组1. 3kb片段；泳道4示lng的人基因组1. 3kb片段；泳道5 示25ng的人基因组1. 3kb片段；泳道6示10ng的人基因组1. 3kb片段；泳道7示5ng的人 基因组1. 3kb片段；泳道8示lng的人基因组1. 3kb片段；
[0056] 图6示不同DNA聚合酶扩增错误率；其中1示Taq DNA聚合酶；2示Pfu DNA聚合 酶；3示Tco DNA聚合酶。
【具体实施方式】
[0057] 本发明公开了一种高保真DNA聚合酶，Tco DNA聚合酶，以及所述的高保真DNA聚 合酶的制备方法和在核酸扩增中的应用。本领域技术人员可以参考本文内容，获得所述的 高保真DNA聚合酶，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通 过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文 制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0058] 本发明提供的一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用中所用到的试剂及原料均 可由市场购得。
[0059] 为了使本【技术领域】的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施 例，进一步阐述本发明：
[0060] 实施例1编码Tco DNA聚合酶的DNA分子的获得
[0061] 菌种Thermococcus coalescens，购买于日本微生物菌种保藏中心，其保藏编号为 JCM: 12540。将购买的菌种以12000rpm离心5min，弃上清；细胞沉淀，参照Promega公司的 Wizard? Genomic DNA Purification kit 提取基因组 DNA,其简要步骤如下：
[0062] 细胞沉淀以 600 μ L Nuclei Lysis Solution 重悬，80 °C 水浴 5min 裂解细胞； 冷却至室温后，加入200 μ L Protein Preciptitation Solution,震荡混勻，冰浴5min; 12000rpm离心5min ;吸取上清至另一个干净的离心管，加入600 μ L异丙醇，混匀后冰浴 10min ;12000rpm离心5min ;核酸沉淀以700 μ L70%乙醇洗漆两次，12000rpm离心5min后， 弃上清，室温干燥核酸沉淀l〇min至无酒精味，加入50 μ L TE溶解，即获得该菌种的基因组 DNA。
[0063] 获得的Thermococcus coalescens基因组DNA未进行全基因组测序，因此无法 得到其DNA聚合酶的基因序列。通过BLAST相似性分析得到同属已测序菌种DNA聚合 酶序列相似度高的区域，设计引物调取Tco DNA聚合酶编码序列。从NCBI数据库中搜 索已测序古菌DNA聚合酶全长基因及其上下游lkb左右核苷酸序列，使用Clustal W软 件 t匕对 Thermococcus gammatolerans EJ3> Pyrococcus yayanosii CH1> Thermococcus kodakarensis K0D1、 Thermococcus onnurineus NA1、 Thermococcus sibiricus MM739 序 列，设计引物：
[0064] 引物BamHITcoF:具有如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列；
[0065] 引物Tco493R:具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
[0066] 引物Tco3085F:具有如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；
[0067] 引物TcoDownR:具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列；
[0068] 以提取的该菌种的基因组DNA为模板，按照下列体系分别配制PCR反应 液,50 μ L体系中包含：上述基因组DNA50ng，引物各400nmol/L，dNTPs200 μ mol/L， 5 x PrimeSTAR#Butfer (Mg2+Plus)10y L，宝生物公司的 Pl-in.ieSTARkHS 0.5μ1...... PCR 扩增程序为：98°C 2min，（94°C 10s ;55°C 20s ;68°C 3min)25cycles，68°C延伸 SmiruPCR产物 电泳检测，使用引物BamHITcoF+Tco493R扩增得到约2. 5kb片段，引物Tco3085F+TcoDownR 扩增得到约3kb片段，分别回收目的条带，并分别使用Taq DNA聚合酶加 A后，将所得的两 个DNA分子分别连接至pGM-T载体中，将得到阳性克隆测序确认。
[0069] 将上述测序得到的核苷酸序列，通过NCBI搜索，确认其与Thermococcus和 Pyrococcus属的编码DNA聚合酶B基因相似性最高，与Thermococcus sp. AM4DNA聚合酶B 序列相似性达到79%，说明扩增得到的是Tco DNA聚合酶的编码序列。分析其序列得知，其 编码的DNA聚合酶含有内含肽，且扩增得到的两个序列无法拼接为全长基因。
[0070] 根据测序结果、分析结果再设计引物：
[0071] 引物Tco30F:具有如SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列；
[0072] 以Tc〇30F和TcoDownR为引物，所提取的菌种基因组DNA为模板，扩增得到约 3. 5kb的片段，构建至pGM-T载体后测序，分析序列发现其中还含有内含肽。根据测序结 果拼接该3. 5kb片段与由引物BamHITcoF+Tco493R扩增得到的约2. 5kb的片段，得到Tco DNA聚合酶全长基因，其全序列包含6186bp，其序列如SEQ ID NO: 3所示，编码的蛋白共 2061aa，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0073] 将拼接所得的基因序列与NCBI数据库中其他DNA聚合酶成熟蛋白的编码序列比 对发现，Tco DNA聚合酶基因被三个内含肽分割为四个编码框，去除内含肽后其基因包括 2328bp，编码的成熟蛋白为775aa。
[0074] 根据分析得到的Tco DNA聚合酶成熟蛋白编码序列，设计引物分别扩增四个0RF :
[0075] 引物Tcol2R:具有如SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列；
[0076] 弓丨物Tco0RF12F:具有如SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列；
[0077] 引物NTco0RF2R:具有如SEQ ID N0:12所示的核苷酸序列；
[0078] 引物NTco0RF23F:具有如SEQ ID N0:13所示的核苷酸序列；
[0079] 引物Tco0RF3R:具有如SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列；
[0080] 弓丨物NTco0RF34F:具有如SEQ ID N0:15所示的核苷酸序列；
[0081] 弓丨物NotITcoWR:具有如SEQ ID N0:16所示的核苷酸序列；
[0082] 以提取得到的菌种基因组DNA为模板，PrimeSTAR扩增不同编码框，其中 BamHITcoF 和 Tcol2R 扩增得到约 1. 2kb 的 0RF1，Tco0RF12F 和 NTco0RF2R 扩增得到约 250bp 的 0RF2, NTco0RF23F 和 Tco0RF3R 扩增得到约 150bp 的 0RF3, NTco0RF34F 和 NotITcoWR 扩 增得到约700bp的0RF4。四个0RF分别连接至pGM-T载体，测序后与拼接的全长基因比对， 结果显不 对应。
[0083] 加 相同摩尔量的0RF1、2、3、4片段，以基因两端引物BamHITcoF和NotITcoWR进行 重叠 PCR，拼接得到全长编码区，其序列如SEQ ID N0:2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列 如SEQ ID NO: 1所示，回收得到的全长约2. 3kb片段，所得片段即为编码Tco DNA聚合酶的 DNA分子。
[0084] 实施例2含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子的重组载体的构建
[0085] 将实施例1获得的全长约2.3kb的目的片段以BamH I和Not I进行酶切，连接 至同样酶切的含T7启动子的载体中，转化至DH5 α感受态细胞中。
[0086] 通过菌液PCR鉴定、酶切鉴定和测序验证，证实编码Tco DNA聚合酶的基因序列的 正确性，培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，所获得的质粒即为含有编码Tco DNA聚 合酶的DNA分子的重组载体。
[0087] 实施例3表达Tco DNA聚合酶融合蛋白的转化体的制备
[0088] 将实施例2获得含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子的重组载体转化到宿主细胞 E. coli Rosetta(DE3)中，挑取单菌落培养至0D6QQ=0. 4,加入IPTG，至其浓度为0. lmmol/L 诱导4h，收集菌体超声破碎，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，发现所制备得的转化体 能够表达Tco DNA聚合酶融合蛋白。
[0089] 实施例4Tco DNA聚合酶的制备
[0090] 将实施例3获得的能够表达Tco DNA聚合酶融合蛋白的转化体菌种，按1:100接种 至500mL含200mL LB培养基的锥形瓶中，加入卡那霉素至其终浓度为30mg/L和氯霉素至 其终浓度为34mg/L，37°C 200rpm振荡培养至0D6QQ=0. 4,加入IPTG至其终浓度为0. lmmol/ L，于30°C诱导4h ;收集诱导后菌液，12000rpm离心2min，弃上清，细胞用20mL的pH值为 7. 8, 20mmol/LTris-HCl, 0. lmol/L KC1,50mmol/L NaCl 的 buffer A加 30mmol/L咪唑重悬， 于-80°C冰箱中冻存12h ;37°C溶解细胞，超声波破碎后于70°C水浴锅处理30min，12000rpm 离心lOmin ;上清过购买于国家生化工程技术研究中心的镍亲和介质，以含400mmol/L咪 唑的buffer A洗脱；洗脱液过购买于国家生化工程技术研究中心的肝素亲和介质，以含 200mmol/L、400mmol/L、600mmol/L、lmol/L NaCl 的 buffer A 进行洗脱；收集各蛋白峰，经 SDS-PAGE检测，发现，含200mmol/L NaCl的buffer A能洗脱部分目的蛋白，含400mmol/L NaCl的buffer A大量洗脱目的蛋白，将得到的产物透析至Storage buffer:pH值为7. 4， 20mmol/L Tris-HCl,0. lmmol/L EDTA,0. l%Tween20,0. 5%Nonidet P40,0. lmol/L KC1,50% 甘油。
[0091] 结果表明成功获得了 Tco DNA聚合酶。SDS-PAGE显示其纯化结果如图1所示：其 中，泳道1示纯化的Tco DNA聚合酶；泳道Μ示蛋白分子量Marker。由图可得，所获得的Tco DNA聚合酶的分子量约为90KDa，与其理论大小相一致，采用BandScan软件分析得其纯度达 到95%以上。
[0092] 实施例5Tco DNA聚合酶活性的测定
[0093] 将实施例4制备得的Tco DNA聚合酶以72°C 30min掺入的核苷酸量确定其活性， 稀释为2. 5u/ μ L，以荧光探针法测试其3' -5'外切酶活性，结果显示Tco DNA聚合酶具有 较强的校正活性，说明其扩增保真性能较好。为了测试Tco DNA聚合酶的热稳定性，将酶于 90°C孵育，取0、l、2、3、4、5、6h处理的酶测DNA聚合酶活性，结果显示Tco DNA聚合酶具有 极高的热稳定性，其90°C半衰期为6h。
[0094] 实施例6Tco DNA聚合酶在核酸扩增中的应用
[0095] 将实施例4制备得的Tco DNA聚合酶应用于核酸扩增。首先，测试该Tco DNA 聚合酶在核酸扩增中的反应条件，以PUC19质粒为模板，设计引物PCR扩增约2. 7kb片 段确定其反应的最适pH值及K+、NH4+、Mg2+离子浓度。配制lOXbuffer B:500mmol/ L Tris-HCl，pH 值为 7.4 ?8.8，15mmol/L MgCl2，分别添加不同浓度 KC1、（NH4)2S04,反 应体系为 20yL，其中含：不同条件的 lOXbuffer B2yL，2.5mmol/L 的 dNTPsl.6yL， 10 μ mol/L 的引物 PAsO. 5 μ L，10 μ mol/L 的引物 PAaO. 5 μ L，Tco DNA 聚合酶 0· 2 μ L， 15ng/y L 的 pUC190. 5μ L，按 98°C 2min，（98°C 10s，6(TC 20s，68°C 2min40s) 25cycles，最 后68?延伸5min，电泳检测，确定最适buffer。根据结果，确定Tco DNA聚合酶的最适反 应条件为 lOXTco buffer:pH 值为 8.4,500mmol/L Tris-HCl，150mmol/L KCl，100mmol/ L(NH4)2S04, 15mmol/L MgCl2。
[0096] 以所述的10XTco buffer和实施例4制备得的Tco DNA聚合酶分别扩增：约 800bp β -Actin、1. 3kb、1. 5kb、3. Okb 和 4. lkb β -globin 片段的人基因组 DNA 和 8kb 片段的 λ基因组，琼脂糖凝胶电泳结果显示均能很好地扩增得到目的片段。琼脂糖凝胶电泳检测， 结果如图2所示，其中，泳道Μ示DNA分子量Marker ;泳道1示人基因组800bp β -Actin片 段；泳道2示人基因组1. 3kb β -globin片段；泳道3示人基因组1. 5kb β -globin片段；泳 道4示人基因组3. Okb β -globin片段；泳道5示4. lkb β -globin片段；泳道6示λ基因 组8kb片段。
[0097] 实施例7Tco DNA聚合酶对高GC含量核酸模板和含抑制剂模板的扩增
[0098] 嗜热微生物为了适应高温环境，其基因组含有较高的GC含量，如Thermus thermophilus HB8基因组GC含量约为70%，对普通PCR反应来说这类模板的扩增存在一定 困难；而有的模板在纯化过程中容易受材料来源中抑制剂污染，导致PCR反应失败，如血液 中抗凝剂EDTA、肝素等。
[0099] 为了测试实施例4制备得的Tco DNA聚合酶对此类复杂模板和含抑制剂模板的扩 增效果，以含EDTA的人全血为模板，直接PCR扩增237bp的S0X21非编码片段；以大肠杆菌 菌液为模板扩增16srDNA约1. 5kb片段；以Thermus thermophilus HB8基因组为模板，扩 增其约2kb高GC片段，其GC含量约72% ;以人基因组为模板，扩增其约1. 5kb高GC片段，其 GC含量约为65. 9% ;以购买于天根生化科技(北京）有限公司的Pfu DNA聚合酶为对比例， 按各自最适条件扩增，反应完成后吸取相同量的产物电泳检测。Tco DNA聚合酶均能很好地 扩增得到目的条带，而对比例没有目的条带出现。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示， 其中，1?4示Tco DNA聚合酶扩增结果；a?d示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道Μ示DNA 分子量Marker ;泳道1示人全血237bp片段；泳道2示大肠杆菌菌液1. 5kbl6srDNA片段； 泳道3示Thermus thermophilus HB8基因2kb片段；泳道4示人基因组1. 5kb片段；泳道 a示人全血扩增237bp片段；泳道b示大肠杆菌菌液1. 5kbl6srDNA片段；泳道c示Thermus thermophilus HB8基因2kb片段；泳道d示人基因组1. 5kb片段。
[0100] 实施例8不同模板量条件下，Tco DNA聚合酶的扩增能力
[0101] 以PUC19质粒为模版，采用实施例4制备得的Tco DNA聚合酶扩增2. 7kb的pUC19 质粒。分别以l〇ng、lng、0. lng、0. 01ng、0. OOlng pUC19质粒，50 μ L反应体系，实施例4所 制备得的Tco DNA聚合酶和购买于天根生化科技(北京)有限公司的Pfu DNA聚合酶按各自 最适条件扩增，反应完成后吸取5 μ L产物电泳检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示Tco DNA聚 合酶的扩增灵敏度远高于Pfu DNA聚合酶。电泳检测结果如图4所示，其中1?5示Tco DNA聚合酶扩增结果；6?10示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道Μ示DNA分子量Marker ;泳 道1示10ng的pUC19;泳道2示lng的pUC19 ;泳道3示0· lng的pUC19 ;泳道4示0· Olng 的pUC19 ;泳道5示0· OOlng的pUC19 ;泳道6示10ng的pUC19 ;泳道7示lng的pUC19 ;泳 道 8 示 0· lng 的 pUC19 ;泳道 9 示 0· Olng 的 pUC19 ;泳道 10 示 0· OOlng 的 pUC19。由图 4 可观察到50 μ L反应体系扩增质粒模板时，Tco DNA聚合酶能检测到0. Olng pUC19质粒， 而Pfu DNA聚合酶仅在10ng的条件下能扩增该质粒。
[0102] 实施例9不同模板量条件下，Tco DNA聚合酶的扩增能力
[0103] 以人基因组为模板，采用实施例4制备得的Tco DNA聚合酶扩增人的1. 3kb片段。 分别以25ng、10ng、5ng、lng的人基因组DNA，50 μ L反应体系，实施例4所制备得的Tco DNA 聚合酶和购买于天根生化科技(北京）有限公司的Pfu DNA聚合酶按各自最适条件扩增，反 应完成后吸取5 μ L产物电泳检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示Tco DNA聚合酶的扩增灵敏度 远高于Pfu DNA聚合酶。电泳检测结果如图5所示，其中1?4示Tco DNA聚合酶扩增结 果；5?8示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道Μ示DNA分子量Marker ;泳道1示25ng的人基 因组1. 3kb片段；泳道2示10ng的人基因组1. 3kb片段；泳道3示5ng的人基因组1. 3kb 片段；泳道4示lng的人基因组1. 3kb片段；泳道5示25ng的人基因组1. 3kb片段；泳道6 示l〇ng的人基因组1. 3kb片段；泳道7示5ng的人基因组1. 3kb片段；泳道8示lng的人 基因组1.3kb片段。由图5可得Tco DNA聚合酶能扩增低至5ng人基因组模板，而Pfu DNA 聚合酶仅能在最高模板量25ng时得到微弱扩增。
[0104] 实施例lOTco DNA聚合酶保真性测试
[0105] 以蓝白斑的方法测试实施例4所制备得的Tco DNA聚合酶的保真能力，以pUC19 质粒为模板，Tco DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶分别扩增全长质粒，测定各 酶的扩增倍数。扩增倍数d，符合公式：2d=PCR产物量/起始模板量；Dpn I消化模板质粒 并酶切、连接后转化DH5a细胞，涂布含IPTG和显色底物X-Gal的平板，并计数蓝白斑。突 变频率mf，符合公式mf=白斑数/菌落总数。以公式ER=mf/(bpXd)计算不同DNA聚合酶 扩增错误率，DNA聚合酶的保真性为1/ER，错误率越低，其保真性越好。结果表明，Tco DNA 聚合酶具有良好的保真性能，其保真性为Pfu的1. 8倍，Taq的9. 2倍。实验结果，图6所 示为三者的错误率，其中1示Taq DNA聚合酶；2示Pfu DNA聚合酶；3示Tco DNA聚合酶。 Tco DNA聚合酶的错误率为：1.2Xl(T6、Pfu DNA聚合酶的错误率为：2. 2Xl(T6、Taq DNA聚 合酶的错误率为：1〇.9Χ1〇Λ根据DNA聚合酶的保真性为1/ER得：Tco DNA聚合酶的保真 性为Pfu DNA聚合酶的1. 8倍，为Taq DNA聚合酶的9. 2倍。
[0106] 由以上实施例可知,本发明所公开的一种高保真DNA聚合酶，即TcoDNA聚合酶，具 有扩增不同模板和片段的能力，同时对复杂模板和含抑制剂模板也能得到较好的结果，且 具有高保真扩增能力，适合各类PCR及对扩增保真性要求较高的实验，也适合作为PCR扩增 试剂盒中高保真DNA聚合酶。
[0107] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对 本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本【技术领域】的 普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改 进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种高保真DNA聚合酶，其特征在于，其具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任 意一个： (I )具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (Π)具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得 的氨基酸序列。
2. 如权利要求1所述的高保真DNA聚合酶在核酸扩增中的应用。
3. -种编码如权利要求1所述的高保真DNA聚合酶的DNA分子，其特征在于，其具有 I、II所示的核苷酸序列中任意一个： I具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； II具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核 苷酸序列。
4. 一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求3所述的DNA分子。
5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为含有T7启动子的重组载体。
6. -种PCR扩增试剂盒，其特征在于，其含有高保真DNA聚合酶； 所述的高保真DNA聚合酶，具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一个： (I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； (Π)具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得 的氨基酸序列。
7. -种高保真DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 获得具有编码如（I )或（II )所限定的氨基酸序列的DNA分子； 取所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体； 取所述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体； 诱导所述转化体表达融合蛋白，经分离纯化，获得高保真DNA聚合酶； 所述的（I )为：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； 所述的（II )为：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个 氨基酸获得的氨基酸序列。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述DNA分子为具有I、II所示的核 苷酸序列中任意一个： I具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； II具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核 苷酸序列。
9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为原核系统宿主细胞。
10. 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述原核系统宿主细胞为大肠杆 菌。
【文档编号】C12N15/70GK104250641SQ201310268966
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年6月28日
【发明者】龙虎, 狄廷娣, 周裕程, 万强 申请人:思洛生物技术股份有限公司