一种人诱导多能干细胞的传代方法及应用的制作方法
【专利摘要】一种人诱导多能干细胞的传代方法及应用，该方法解决了传统克隆块传代方法使细胞易于分化，且转染效率低，难以进行基因修饰的问题。该方法为单细胞传代及其培养方法，包括如下步骤：用消化酶添加ROCK抑制剂将诱导多能干细胞克隆充分消化为单细胞；使用血球计数板或细胞计数仪计数；按照20000-30000细胞/平方厘米的密度将细胞铺至经ECM包被的培养板上；使用添加ROCK抑制剂的培养基对诱导多能干细胞置于37℃，8-15％CO2条件下培养；传代20代后，诱导多能干细胞的多能性未发生变化，包括多能性基因表达，体内及体外分化潜能等。
【专利说明】一种人诱导多能干细胞的传代方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及人诱导多能干细胞的传代方法，具体涉及人诱导多能干细胞单细胞传代和培养技术。
【背景技术】
[0002]2006年，日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把0ct3/4、SoX2、C-MyC和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，成功获得类似于胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞)的多能干细胞，命名为诱导多能干细胞(iPSCs, inducedpluripotent stem cell)。产生的iPSCs在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似，从而对iPSCs多能性进行了肯定。依此证明处于终末分化的成熟细胞可以通过重编程技术逆转为未分化状态，而达到恢复多能性分化潜能的目的。
[0003]Shinya Yamanaka研究小组利用相同的技术,将上述同样的4个转录因子导入到人类皮肤成纤维细胞中，也成功获得了 iPSCs。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为iPSCs。这类iPSCs在细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性等方面与hESCs相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的不同细胞类型(Takahashi K和Yamanaka S等人,利用特定因子诱导成人成纤维细胞到多能干细胞。细胞2007 ;131:861-872)。与此同时，威斯康辛大学J.A Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hESCs基本特征的人类iPSCs，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了 0ct4、Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转导(俞君英等人，从人的体细胞诱导成为多能干细胞系，科学，2007 ；318:1917-1920)。这一被学界称为生物科学“里程碑”的重大突破有望帮助科学家绕过克隆技术的伦理、道德纷争，为医学应用打开大门。
[0004]iPSCs的出现为研究细胞核重新编程提供了新的思路，在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响，这不仅是因为它在基础研究方面的重要性，更为再生医学带来了新的希望。在实际应用方面，iPSCs的获得方法相对简单和稳定，不需要使用生殖细胞或破坏早期胚胎。这在技术上和伦理上都比其他方法更有优势。iPSCs的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离，在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大的潜在价值。此外，iPSCs在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈现，iPSCs在体外已成功地被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等，因具有与患者自身相同的基因组成，所以不会引起机体自身的免疫排斥反应。
[0005]目前iPSCs的培养和传代方法不尽相同，培养基有血清和血清替代品之分，传代方法有酶消化法和机械传代法，根据实验需求采用相应的培养和传代方法。通常的传代方式是将克隆使用Dispase或胶原酶初步处理后，使克隆变得较为松散，然后将克隆分割成克隆块以铺至滋养层细胞上的方式来传代，所用的培养条件一般为37°C，5% C02。该方法的缺陷是细胞易于分化，难于大规模扩增。而利用单细胞的传代方法通常会影响细胞的多能性，且长期培养对细胞核型有影响。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的上述问题，本发明提供了一种人诱导多能干细胞(hiPSCs)的单细胞传代及培养的方法，该方法可以迅速扩增hiPSCs，使细胞保持较好的生长状态，克服了hiPSCs易于分化、难于大规模扩增、冻存及复苏效率低的问题，易于进行核转染及单细胞克隆，为基因修饰等操作带来极大方便。
[0007]为实现上述目的，本发明采取以下技术方案:
[0008]一种人诱导多能干细胞的传代方法，该方法包括如下步骤:
[0009]A.细胞传代前l_2h铺细胞外基质到多孔板；
[0010]B.从培养箱中取出汇合率75% -85%需要传代的细胞，用DMEM/F12培养基洗一次，加Accutase消化酶置于37°C、体积分数8_15%的CO2培养箱中消化；细胞基本被消化下来时，加mTeSRl培养基终止消化；
[0011]C.离心，弃上清液，使用添加ROCK抑制剂的mTeSRl培养基重悬细胞，轻轻吹打均匀记数；
[0012]D.按20000-30000细胞/平方厘米的密度将细胞铺至经细胞外基质包被的培养板上，置于37°C、体积分数为8-15%的CO2培养箱培养；
[0013]E.第二天观察细胞密度、贴壁情况，若一切正常即撤去ROCK抑制剂，换新鲜mTeSRl培养基进行培养，以后每天换液，至汇合率再次达到75% -85%既可传代或冻存。
[0014]如上所述的传代方法，优选地，所述步骤A中的细胞外基质为ECM、Matrigel Geltrex? LDEV-Free hESC Qualified> Vitronectin(VTN-N)或 CELLstart?CTStm0
[0015]如上所述的传代方法，优选地，所述步骤B中需要传代的细胞为生长处于对数期时的细胞；更优选地，以Accutase加Y27632作为消化酶，消化时间为7min，这样既保证是单细胞传代，又不会因消化过度而影响细胞生长状态。
[0016]如上所述的传代方法，所述ROCK抑制剂可抑制细胞在单细胞状态下的凋亡，从而提高细胞存活率，优选为 Y27632，HA-100，Blebbistatin 或 Thiazovivin，更优选为 Y27632。
[0017]如上所述的传代方法，优选地，所述步骤C中用台盼蓝对细胞进行计数，为保证计数的准确性，调整细胞密度为每一大格细胞数30-50个时细胞计数。
[0018]一种人诱导多能干细胞的传代方法，该方法采用如上所述的方法，除了所述Accutase消化酶替换为胰酶。
[0019]一种人诱导多能干细胞的传代方法，该方法采用如上所述的方法，除了所述mTeSRl 培养基(StemCelI, Cat#05850)替换为 TeSR2 (StemCell，Cat#05860)，Essential8?Medium (Life, Cat#A14666SA)，或 NutriStem (BI，Cat#05-100_1A/B)。
[0020]如上所述的传代方法应用于hiPSCs细胞大规模扩增。
[0021]如上所述的传代方法应用于高效转染hiPSCs及外源基因导入。
[0022]如上所述的传代方法应用于获得单个细胞来源的克隆，以纯化细胞或筛选具有特定标记的细胞群体。
[0023]如上所述的传代方法应用于获取突变体等位基因的同基因型细胞株。
[0024]如上所述的传代方法应用于获取用于基因修饰的单细胞悬液。
[0025]本发明的有益效果在于，本发明的方法将hiPSCs细胞处理成单细胞形式，且置于高CO2浓度的条件下培养。其有益效果体现在以下几个方面:
[0026]I)使传代的细胞较为均一地铺与培养板中，接种密度为20000-30000细胞/平方厘米，太稀的话细胞间信息交流比较少、不利于生长，太密的话细胞生长较快，若传代不及时的话细胞容易老化，从而导致分化；
[0027]2)可使hiPSCs大规模扩增，适于该类细胞的工业化生产；
[0028]3)冻存后的细胞可获得大于70%复苏后成活率；
[0029]4)使hiPSCs单细胞克隆的效率提高3-5倍，易于进行基因修饰筛选具有相同基因型的克隆；
[0030]5)传代超过20代后，使用该方法传代的hiPSCs细胞仍具有人胚胎干细胞相似特征，且核型也没有发生变化。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1A为实施例1培养第二天显微镜照片。
[0032]图1B为实施例1培养第三天显微镜照片。
[0033]图1C为实施例1培养第四天显微镜照片。
[0034]图1D为实施例1培养第五天显微镜照片。
[0035]图2A为实施例3克隆团悬浮培养显微镜照片。
[0036]图2B为实施例3利用qPCR检测三个胚层标记物的表达。
[0037]图2C为实施例3畸胎瘤照片。
[0038]图3为实施例4核型分析图。
[0039]图4为实施例5GFP表达显微镜照片。
【具体实施方式】
[0040]实施例1hiPSCs单细胞传代
[0041]I)细胞传代前l_2h铺ECM到6孔板。
[0042]2)从培养箱中取出汇合率75% -85%左右的细胞，用DMEM/F12培养基洗一次，加Accutase消化酶置于37°C、体积分数12%的CO2培养箱中消化，细胞基本被消化下来时，加入mTeSRl终止消化。
[0043]3) 200g离心3min，弃上清液，含有Y27632的mTeSRl重悬细胞，轻轻吹打均匀。
[0044]4)用血球计数板对细胞进行记数，按20000-30000/平方厘米的密度接种于预先铺有ECM的6孔板上，置于37°C、体积分数12%的CO2培养箱培养。
[0045]5)第二天显微镜下观察细胞密度及贴壁情况(图1A)。细胞之间具有接触且细胞密度合适，撤去Y27632，换新鲜mTeSRl培养基进行培养。
[0046]6)第三天细胞开始聚集成团(图1B)，细胞状态稳定，换新鲜mTeSRl培养基进行培养。
[0047]7)第四天至第五天，细胞生长活跃，密度逐步增大(图1C，图1D)，至75-85%密度时，细胞即可进行传代或冻存。
[0048]实施例2hiPSCs单细胞克隆
[0049]I)从培养箱中取出汇合率75%-85%左右的细胞，加Accutase消化酶置于37°C、体积分数8-15%的CO2培养箱中消化，细胞基本被消化下来时，加入mTeSRl终止消化。
[0050]2)台盼蓝染色，利用血球计数板计活细胞数目，使用mTeSRl+Y27632抑制剂稀释细胞悬液至5-15个细胞/毫升，向ECM包被的96孔板中加入10ul细胞悬液/孔，放入8-15%的CO2培养箱中培养。
[0051]3) 10天后镜检，将长至克隆状的hiPSCs传代，扩增，即获得单细胞来源的hiPSCs。
[0052]实施例3-hiPSCs单细胞传代后的多能性鉴定
[0053]hiPSCs采用实施例1的方法单细胞传代20代后，取部分细胞进行拟胚体形成(EBformat1n)实验和畸胎瘤形成实验(Teratomas format1n)。
[0054]I)拟胚体形成
[0055]复苏hiPSCs至ECM上，待细胞长至75%时将细胞转移至feeder上培养。当克隆团在feeder上生长5-6天后，转移克隆团悬浮培养(图2A)。悬浮培养8天后转移EB球至包被Gelatin的6孔板内贴壁生长。当EB球贴壁生长8天后，收集贴壁细胞的RNA，利用qPCR检测三个胚层标记物的表达情况(图2B)。结果显示通过EB方式分化得到的细胞均比hiPSCs在三个胚层细胞的标记物上均有增长，且与hiPSCs相比，每个胚层至少有一个标记物的差别大于10倍。
[0056]2)畸胎瘤形成
[0057]复苏hiPSCs至ECM上，待细胞长至75%时，扩增至1cm培养皿，使用Accutase消化细胞为单细胞，离心去上清，使用30%的ECM重悬细胞，然后注射至SCID小鼠腋下及肌肉,8-12周后获取畸胎瘤,使用石蜡包埋后,切片，Η/E染色,结果显示畸胎瘤中含有3个胚层的组织(图2C)。
[0058]实施例4hiPSCs核型分析
[0059]复苏hiPSCs至ECM上，将汇合率达85%左右的细胞吸弃培养基，DMEM/F12洗两遍，加10% MEF培养基(90% DMEM高糖、10% FBS)和秋水仙素混合培养基，置于37摄氏度、5% CO2中处理2h，处理完成后用DPBS洗一遍，0.25%胰酶消化后收集细胞，200g离心5min，弃上清液加入37°C预温的0.075mol/L KCL溶液8ml，用吸管迅速、猛烈吹打细胞沉淀，混匀后置于37°C恒温水浴锅低渗处理18min，加入1ml新鲜配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1),用吸管轻柔吹匀，室温预固定5min, 1200rpm离心5min,弃上清液,沿壁缓慢加入新鲜配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3: 1)，轻轻吹匀，置于37°C水预40min，再重复固定一次，1200rpm离心5min，用吸管吸弃大部分固定液，留约1.5ml轻柔重悬细胞，吸取少量细胞悬液，滴2-3滴于冰水浸泡过的玻片上，马上置于烘箱中烘干，将标本置于胰酶消化8s、迅速放于生理盐水中终止消化、再Giemsa染色8min，用自来水轻轻冲洗玻片，室温干燥后于显微镜下观察分裂相的多少及分散情况。随机选取20个分裂相，使用G显带核型分析法分析所有分裂相的核型。统计结果显示共有18个分裂相为46条染色体，且形态正常，2个分裂相不正常。可以认定该细胞株经过单细胞20代传代后核型正常，随机选取一个分裂相排列出核型图(图3)。
[0060]实施例5向单细胞状态的hiPSCs转染mRNA及质粒
[0061]I)消化细胞:用Accutase消化细胞，收集细胞，离心，弃上清，mTeSRl/Y27632重悬;
[0062]2)细胞计数:用台盼蓝计数，计算活细胞数；
[0063]3)取适量的活细胞到1.5ml离心管，115g，3min ；
[0064]4)使用核转染试剂重悬；
[0065]5)向两个转染体系中分别加入适量pMAX-GFP质粒和GFP-mRNA，轻轻吹打混匀；
[0066]6)核转染:将细胞与DNA混合液转移到电转杯中(避免气泡)，使用AmaxaNucleofactor II，选择相应程序电击；
[0067]7)恢复:将500ul培养基(37度提前预热)加入电转杯，然后将细胞从电转杯中轻轻吸出；
[0068]8)铺板:根据实验需要将细胞铺到相应的ECM包被平板上，一般为12孔板的3个孔。
[0069]9) 18小时后 ，显微镜下检查GFP表达情况(图4)。
[0070]最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【权利要求】
1.一种人诱导多能干细胞的传代方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: A.细胞传代前l_2h铺细胞外基质到多孔板； B.从培养箱中取出汇合率75%-85%需要传代的细胞，用DMEM/F12培养基洗一次，加Accutase消化酶置于37°C、体积分数8_15%的CO2培养箱中消化；细胞基本被消化下来时，加mTeSRl培养基终止消化； C.离心，弃上清液，使用添加ROCK抑制剂的mTeSRl培养基重悬细胞，轻轻吹打均匀记数； D.按20000-30000细胞/平方厘米的密度将细胞铺至经细胞外基质包被的培养板上，置于37°C、体积分数为8-15%的CO2培养箱培养； E.第二天观察细胞密度、贴壁情况，若一切正常即撤去ROCK抑制剂，换新鲜mTeSRl培养基进行培养，以后每天换液，至汇合率再次达到75% -85%既可传代或冻存。
2.根据权利要求1所述的传代方法，其特征在于，所述步骤A中的细胞外基质为 ECM、Matrigel Geltrex? LDEV-Free hESC Qualified, Vitronectin(VTN-N)或CELLstart?CTS?0
3.根据权利要求1所述的传代方法，其特征在于，所述步骤B中需要传代的细胞为生长处于对数期时的细胞。
4.根据权利要求1所述的传代方法，其特征在于，所述ROCK抑制剂为Y27632，HA-100，Blebbistatin 或 Thiazovivin0
5.一种人诱导多能干细胞的传代方法，其特征在于，该方法采用权利要求1-3中任一项所述的方法，除了所述Accutase消化酶替换为胰酶。
6.一种人诱导多能干细胞的传代方法，其特征在于，该方法采用权利要求1-3中任一项所述的方法，除了所述mTeSRl培养基替换为TeSR2 (StemCelI，Cat#05860)，Essential8?Medium (Life, Cat#A14666SA)，或 NutriStem (BI，Cat#05-100_1A/B)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的传代方法应用于hiPSCs细胞大规模扩增。
8.如权利要求1-6中任一项所述的传代方法应用于高效转染hiPSCs及外源基因导入。
9.如权利要求1-6中任一项所述的传代方法应用于获得单个细胞来源的克隆，以纯化细胞或筛选具有特定标记的细胞群体。
10.如权利要求1-6中任一项所述的传代方法应用于获取突变体等位基因的同基因型细胞株。
11.如权利要求1-6中任一项所述的传代方法应用于获取用于基因修饰的单细胞悬液。
【文档编号】C12N5/10GK104178456SQ201310276246
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年7月3日 优先权日:2013年7月3日
【发明者】杨佳银, 刘雨晴 申请人:深圳市三启生物技术有限公司