激酶Lats2在调控前体脂肪细胞增殖中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及激酶Lats2及Hippo信号通路在调控动物前体脂肪细胞增殖中的应用，所述应用为过表达激酶Lats2，激活Hippo信号通路，从而抑制动物前体脂肪细胞增殖。本发明首次揭示了Lats2和Hippo信号通路对于动物脂肪发育的调控作用，尤其是调控前体脂肪细胞增殖的作用。本发明可应用于减少动物脂肪沉积，提高瘦肉率；也可为畜牧业的遗传育种、改善肉质等提供新的候选基因及信号通路。
【专利说明】激酶Lats2在调控前体脂肪细胞增殖中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学、细胞生物学和细胞信号转导领域，具体地说，涉及激酶 Lats2及Hippo信号通路在调控前体脂肪细胞增殖中的应用。
【背景技术】
[0002] 在生物体内，脂肪组织主要分布在皮下和器官周围，称为皮下脂肪垫和围器官脂 肪垫，这些脂肪垫对于维持动物体温平衡和保护器官具有重要的作用。在生物体系统中脂 肪组织发挥着举足轻重的作用，其主要作用为维持机体的能量平衡，以甘油三酯的形式储 存多余能量，当能量消耗大于能量摄入时，动员脂肪将能量以游离脂肪酸和甘油的形式释 放出来继续代谢产能。此外，皮下脂肪可以保持动物体温，对机械碰撞也具有缓冲作用。由 于脂肪组织对于机体具有重要的作用，因此对脂肪发育调控机制的研究也显得尤为重要。
[0003] Hippo信号通路首先在果蝇中发现，在哺乳动物中也存在这样的通路，在物种间高 度保守。Hippo信号通路控制器官的大小，是一种激酶级联反应，由一些对生长起负调节作 用的因子组成，最终引起转录辅活化子的磷酸化和失活，从而调控一些靶基因的表达，抑制 细胞增殖和控制器官大小。
[0004] Lats2属于Ser/Thr激酶的AGC家族，C-端激酶结构域高度保守。Lats2作为Hippo 信号通路中的一个核心激酶，通过与下游的转录辅助因子YAP和TAZ相互作用从而调控靶 基因的表达，对细胞的增殖和凋亡发挥调控作用。
[0005] Hippo信号通路和激酶Lats2参与多种组织和器官的发育调控，但是对于脂肪组 织的发育调控却没有明确的报道。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明的目的是提供激酶Lats2及Hippo信号通路在控制动物脂 肪发育中的新用途。
[0007] 本发明提供了激酶Lats2在调控动物脂肪细胞增殖中的应用，所述应用为过表达 激酶Lats2,激活Hippo信号通路，从而抑制动物脂肪细胞增殖。
[0008] 优选地，所述脂肪细胞为前体脂肪细胞。
[0009] 所述动物为哺乳动物。优选地，所述动物为小鼠、牛或羊。
[0010] 本发明还提供了一种过表达激酶Lats2的小鼠前体脂肪细胞的制备方法，所述方 法包括如下步骤：
[0011] (1)提取小鼠大脑组织RNA，反转录成cDNA，以CDNA为模板，以引物Fl和Rl为引 导进行 PCR 扩增，获得 Lats2 基因；引物 Fl :AGATCTATGAGGCCAAAGACTTTTCC(SEQ ID No. 1); 引物 Rl :CTCGAGTTACACGTACACCGGCTGGC (SEQ ID Νο·2);
[0012] (2)将Lats2基因克隆至表达载体pPB-CAG-EBNXN，获得重组表达载体 pPB-CAG-EBNXN-Lats2 ；
[0013] (3)将重组表达载体pPB-CAG-EBNXN-Lats2转染小鼠前体脂肪细胞，药物筛选得 到稳定整合Lats2的细胞，即得到过表达激酶Lats2的小鼠前体脂肪细胞。
[0014] 步骤（1)中，反转录成cDNA的方法为M-MLV反转录酶反转录方法。
[0015] 步骤（1)中，PCR扩增所用引物为Fl和Rl，PCR扩增的反应体系为50微升KOD高 保真酶PCR扩增体系：
【权利要求】
1. 激酶Lats2在调控动物脂肪细胞增殖中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为过表达激酶Lats2,激活Hippo 信号通路，抑制动物脂肪细胞增殖。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述脂肪细胞为前体脂肪细胞。
4. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述动物为哺乳动物；优选地，所述 动物为小鼠、牛或羊。
5. -种过表达激酶Lats2的小鼠前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包 括如下步骤： (1) 提取小鼠大脑组织RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，以引物F1和R1为引导进 行PCR扩增，获得Lats2基因； 引物 FI :AGATCTATGAGGCCAAAGACTTTTCC ; 引物 R1 :CTCGAGTTACACGTACACCGGCTGGC ; (2) 将Lats2基因克隆至表达载体pPB-CAG-EBNXN，获得重组表达载体 pPB-CAG-EBNXN-Lats2 ； (3) 将重组表达载体pPB-CAG-EBNXN-Lats2转染小鼠前体脂肪细胞，药物筛选得到稳 定整合Lats2的细胞，即得到过表达激酶Lats2的小鼠前体脂肪细胞。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，PCR扩增的反应体系为50微 升K0D高保真酶PCR扩增体系： 组分 体积 ddH20 32 ^il l〇x缓冲液 5{il dNTP Mix 5 pi MgS04 2 引物 FI 1.5 ^1 引物 R1 1.5 il\ cDNA 模板 2 ill KOD 酶 1 ill 总体积 50 |il; PCR扩增的反应程序为：94°C预变性2分钟；94°C变性30秒，62 °C退火30秒，72 °C延伸 3分钟，重复30次；72 °C延伸7分钟。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，重组表达载体 pPB-CAG-EBNXN-Lats2的制备方法为将步骤（1)中的PCR产物与表达载体pPB-CAG-EBNXN 分别进行Bglll和Xhol双酶切，PCR产物目的片段和表达载体pPB-CAG-EBNXN骨架的酶切 产物分别回收后用T4 DNA连接酶连接，得到重组表达载体pPB-CAG-EBNXN-Lats2。
8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，所述药物筛选为嘌呤霉素药 物筛选。
9. 激酶Lats2在减少动物脂肪沉积，提高瘦肉率中的应用。
10. 激酶Lats2在动物优化遗传育种中的应用。
【文档编号】C12N5/10GK104278054SQ201310279922
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月4日 优先权日:2013年7月4日
【发明者】胡晓湘, 安杨, 李宁 申请人:中国农业大学