人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法

人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法，该方法是将新鲜的肝组织经暴露的血管用灌注溶液I和灌注溶液II冲洗干净；直至肝组织失去弹性消化完全；然后置于含有细胞洗液的培养皿中，筛选得到单细胞悬液；低密度接种到胶原包被的培养板或培养皿中培养，首先在生长因子的作用下形成100%融合度的单层共培养；最后置于加入含有2%DMSO的维持培养液培养；肝细胞堆积形成肝非实质细胞环绕、入侵生长的肝岛状结构。本发明利用常规的肝细胞分离技术，实现了长达120天的肝细胞体外长期培养与长达72天保持HBV易感性。并且该系统可发展为新的抗HBV药物筛选与评价平台，对抗病毒药物研究具有重要价值。
【专利说明】人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞的培养方法，具体涉及一种简易的、能长期维持人原代肝细胞特性与HBV易感性的肝细胞与肝非实质细胞共培养方法。
【背景技术】
[0002]肝脏细胞在功能分类上可分为肝实质细胞与肝非实质细胞，肝实质细胞即为肝细胞，履行肝脏大部分功能如消化功能、能量代谢、解毒等；而肝非实质细胞包括肝星形细胞，窦状内皮细胞，肝上皮细胞，KupfTer细胞等，主要行使辅助肝细胞、肝脏免疫与肝脏结构支持等功能。目前为止，传统的共培养方法是将纯的原代肝细胞与纯的肝非实质细胞按一定比例混合培养，在共培养过程中，肝细胞与肝非实质细胞恢复了部分细胞与细胞之间的自然通讯，因此，原代肝细胞的形态特征和生理功能可以得到最大限度的维持。然而，这种传统的共培养系统有严重缺点，例如有限的细胞寿命、复杂繁琐的纯化步骤及至关重要的共培养细胞比例难以掌握。因此，急需开发一种在体外能使肝细胞分化特性得以长期维持的便捷的方法。利用原代肝细胞与肝非实质细胞混合物经低密度铺板的共培养方法，可以形成肝细胞堆积的，肝非实质细胞环绕、入侵生长的岛状结构，该方法相对简单易行，不需要繁琐的肝细胞与非实质细胞纯化过程，极大地延长了原代肝细胞的分化特性维持时间，最长维持时间长达120天。
[0003]乙肝病毒(英文缩写为HBV)感染是一种常见病，中国约有1.7亿的乙肝携带者，每年死于相关疾病的病人约一百万。由于长期缺乏合适的抗HBV药物筛选与评价平台，HBV的治疗策略与方法相对滞后。用于抗HBV药物筛选与评价的细胞模型长期局限于肝癌细胞系如H印G2、H印G2.2.15、Huh7等等。由于这些细胞系去分化严重，与体内肝细胞相比在分化状态上相差甚远，所以在筛选与评价抗HBV药物时不能反映药物真实的抗病毒效果与细胞毒作用。更糟糕的是这些细胞系不支持HBV感染，不能用于抗HBV感染性药物如小肽、抗体等研究。人原代肝细胞是H BV研究最为理想的细胞感染模型，大量的研究表明原代肝细胞能被HBV感染，但其在体外培养时很快失去分化特性，HBV的易感性通常也在I周内完全丢失，这严重制约了对HBV感染机制研究、药物筛选与评价的细胞模型的建立。本发明专利所述方法，通过人原代肝细胞与肝非实质细胞的共培养，原代肝细胞的肝细胞特性如形态特征、白蛋白的表达得以长期维持，对HBV的易感性维持可达72天，极大地提升了人原代肝细胞用于抗HBV药物筛选与评价的应用价值。
[0004]大量的研究表明，肝细胞移植对肝功能衰竭病人的治疗效果卓著，可以极大缓解病人对供肝的需求，是一种很有应用前景的治疗策略。由于肝细胞体外培养相对落后，实现肝细胞的体外扩增及肝细胞分化特性的长期维持仍然是摆在医疗工作者面前的难题。

【发明内容】

[0005]本发明所要解决的技术问题就是提供一种人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法，在体外人原代肝细胞与肝非实质细胞混合物，经低密度铺板与经培养形成了肝细胞堆积的，肝非实质细胞环绕、入侵生长的肝岛状结构，实现了长达120天的肝细胞体外长期培养与长达72天保持HBV易感性。
[0006]为解决上述技术问题，本发明一种人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法，包括以下步骤:
[0007]I)新鲜的肝组织经暴露的血管用灌注溶液I灌注约30分钟，直至肝组织中血液被冲洗干净；
[0008]2)用37°C预热的灌注溶液II灌注步骤I)中冲洗干净的肝组织，直至肝组织失去弹性消化完全；
[0009]3)将步骤2)消化完全的肝组织转移至含有细胞洗液的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液；
[0010]4)将步骤3)中细胞悬液通过70 μ m的细胞筛，得到单细胞悬液；
[0011]5)将步骤4)获得的单细胞悬液在50Xg和4°C条件下，离心5分钟沉降肝细胞与肝非实质细胞，用上述细胞洗液重悬，重复离心三次，然后利用铺板培养液重悬细胞；
[0012]6)利用台酚蓝染色法计算步骤5)中重悬细胞的细胞密度与细胞活力；
[0013]7)将步骤6)中单细胞悬液以< 8X IO4活细胞/cm2的细胞密度接种到胶原包被的培养板或培养皿中，胶原包被的目的是促进细胞贴壁与肝细胞特性的维持，加入铺板培养液，摇匀，在37°C、5% CO2培养箱中培养以充分让其贴壁；经4至6小时后，加入生长培养液培养，3至4天换I次生长培养液；
[0014]8)培养28至35天，加入含有2%DMS0的维持培养液，3至4天换I次维持培养液；
[0015]9)培养30至40天，肝细胞堆积形成肝非实质细胞环绕、入侵生长的肝岛状结构；
[0016]其中，所述灌注溶液I为具体配方为:8.00g/l氯化钠、0.40g/l氯化钾、3.57g/l羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/l 二水磷酸氢二钠、0.06g/l磷酸二氢钾、lg/1葡萄糖、ImM丙酮酸纳、2mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸，调pH至7.4 ;
[0017]所述灌注溶液II的具体配方为:8.00g/l氯化钠、0.40g/l氯化钾、3.57g/l羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/l 二水磷酸氢二钠、0.06g/l磷酸二氢钾、lg/1葡萄糖、ImM丙酮酸纳、5mM氯化钙、0.3g/l IV型胶原酶，调pH至7.4 ;
[0018]所述细胞洗液为:在商业化购买的DMEM培养液(购至美国GIBCO公司)使用前加入10% v/v胎牛血清，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素；
[0019]所述铺板培养液为:在商业化购买的William’ s E medium (简称WE,购至美国GIBCO公司)使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羟乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氢钠，550mg/l丙酮酸钠，0.2mM抗坏血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，10_7M地塞米松,ITS+premix,100units/ml 青霉素，100mg/ml 链霉素，5% v/v 胎牛血清；其中，ITS+premix 含有 6.25 μ g/ml胰岛素，6.25 μ g/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亚油酸；
[0020]所述生长培养液为:在商业化购买的WE使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羟乙基哌嗪乙磺酸,17mM碳酸氢钠,550mg/l丙酮酸钠,0.2mM抗坏血酸-2-磷酸,14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，KT7M地塞米松，ITS+premix, 100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素，20ng/ml表皮生长因子;其中，ITS+premix含有6.25 μ g/ml胰岛素，6.25 μ g/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亚油酸；[0021]维持培养液为:在商业化购买的WE使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羟乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氢钠,550mg/l丙酮酸钠,0.2mM抗坏血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺，KT7M地塞米松，ITS+premix, 100units/ml 青霉素，100mg/ml 链霉素,2% v/v DMSO ;其中，ITS+premix 含有 6.25 μ g/ml 胰岛素，6.25 μ g/ml 转铁蛋白，6.25ng/ml 亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亚油酸。
[0022]作为优选方案，所述步骤6)中，确定细胞密度与细胞活力的方法为:将细胞悬液与0.4% m/v台酚蓝染色液以1:1的体积比混匀，迅速将20μ1混合液加入到计数板中且将该计数板插入相应的计数仪中，仪器读出相应的细胞密度与细胞活力，0.4%台酚蓝染色液具体配置方法为:0.4g台酚蓝固体完全溶解到100ml的磷酸缓冲液溶液中(英文缩写为PBS)，具体配方为:8.0g/Ι氯化钠，0.2g/l氯化钾，3.58g/l十二水磷酸氢二钠，0.24g/l磷酸二氢钾，PH7.2至7.4，高压蒸汽灭菌，4°C保持备用。
[0023]作为优选方案，所述胶原包被的培养板或培养皿的制备方法:将172 μ I冰醋酸加入到100ml去离子水中，再加入终浓度为50 μ g/ml的IV型鼠尾胶原，在无菌条件下，0.22 um滤膜过滤除菌后，4°C保持待用；将该工作液以5 μ g/cm2的包被量加入到需要包被处理的培养板或培养皿中，常温孵育；1小时后，将胶原工作液吸出，自然晾干后封口 4°C保藏；用前，胶原包被的培养板或培养皿需用PBS清洗一次，以去除残留的醋酸。
[0024]本发明的有益效果在于:
[0025]其一，本发明利用常规的肝细胞分离技术，分离到肝细胞与肝非实质细胞的混合物，以低密度的方式铺板，经生长因子刺激，最后形成100%融合度的单层细胞培养，实现了人原代肝细胞与肝非实质细胞的体外扩增，有望发展为新的肝细胞移植的细胞来源；
[0026]其二，本发明相对于常规的共培养方法更简便，不需要纯化肝细胞与肝非实质细胞的封锁操作；
[0027]其三，该共培养体系在 DMSO的诱导下，肝细胞堆积成肝非实质细胞环绕、入侵的肝岛状结构，岛上的肝细胞可以长期维持原代肝细胞性状，最长培养周期可达120天，克服了原代肝细胞寿命短的缺陷；
[0028]其四，本发明得到的岛上的肝细胞在DMSO的维持下，HBV的易感性可以维持长达72天，这极大地克服了肝原代细胞对HBV的易感性在I周内丢失的缺陷，初步建立了新颖的抗HBV侵染药物筛选与评价的体外细胞模型，该共培养方法为医疗用肝细胞来源的体外扩增与长期肝细胞特性维持提供了可能，并且该系统可发展为新的抗HBV药物筛选与评价平台，对抗病毒药物研究具有重要价值。
【专利附图】

【附图说明】
[0029]图1为共培养肝细胞在不同培养时间点的形态学观察；
[0030]图2为肝岛状结构的形态学观察与免疫荧光检测；
[0031]图3为HBV感染长期培养的肝细胞；
[0032]图4为肝岛状结构形成与HBV成功感染模式图。
【具体实施方式】
[0033]为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0034]1.两步胶原酶灌注法分离人原代肝细胞与肝非实质细胞:
[0035]两步胶原酶灌注法第一步:新鲜的肝组织材料经暴露的血管用灌注溶液I灌注约30分钟，直至肝组织中血液被冲洗干净。灌注溶液I的具体配方为:8.00g/l氯化钠、0.40g/I氯化钾、3.57g/l羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/l 二水磷酸氢二钠、0.06g/l磷酸二氢钾、Ig/I葡萄糖、ImM丙酮酸纳、2mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸，调pH至7.4，用0.22 μ m微孔滤器过滤除菌，4°C储存。
[0036]两步胶原酶灌注法第二步:用37°C预热的灌注溶液II灌注直至肝组织失去弹性。灌注溶液II的具体配方为:8.00g/l氯化钠、0.40g/l氯化钾、3.57g/l羟乙基哌嗪乙磺酸、
0.06g/l 二水磷酸氢二钠、0.06g/l磷酸二氢钾、lg/1葡萄糖、ImM丙酮酸纳、5mM氯化钙、
0.3g/l IV型胶原酶(购至美国Sigma公司),调pH至7.4,用0.22 μ m微孔滤器过滤除菌,4°C储存。
[0037]将消化好的肝组织转移到含有细胞洗液的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液。细胞洗液为商业化购买的DMEM培养液(购至美国GIBCO公司)，使用前加入10%v/v胎牛血清(购至美国GIBCO公司)，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素。再将该细胞悬液通过70 μ m的细胞筛，以获得单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心机中离心以沉降肝细胞与肝非实质细胞，离心条件为:50Xg，4°C，5分钟。用细胞洗液重悬，重复以上离心三次。最后，利用铺板培养液重悬细胞，再利用台酚蓝染色法计算细胞密度与细胞活力。重悬细胞的铺板培养液为商业化购买的William’ s E medium (简称WE，购至美国GIBCO公司)，使用前加入IOmM尼克酰胺,20mM轻乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氢钠，550mg/l丙酮酸钠，0.2mM抗坏血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，IO^7M地塞米松，ITS+premix (含有6.25 μ g/ml胰岛素，6.25 μ g/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，
5.35 μ g/ml亚油酸)，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素,5% v/v胎牛血清(购至美国GIBCO 公司)。
[0038]2.细胞浓度与细胞活力的检测:
[0039]将细胞悬液与0.4% m/g台酚蓝染色液以1:1的体积比混匀，迅速将20 μ I混合液加入到计数板中(购至美国Counterstar公司)且将该计数板插入相应的计数仪中，仪器读出相应的细胞密度与细胞活力。0.4%台酚蓝染色液具体配置方法为0.4g台酚蓝固体溶解到100ml的磷酸缓冲液溶液中(英文缩写为PBS，具体配方为:8.0g/Ι氯化钠，0.2g/l氯化钾，3.58g/l十二水磷酸氢二钠，0.24g/l磷酸二氢钾，pH7.2至7.4，高压蒸汽灭菌，4°C保持备用)。
[0040]3.人原代肝细胞与肝非实质细胞混合物低密度铺板与培养:
[0041]经方法(I)分离得到的单细胞悬液，以小于等于8X IO4的活细胞/cm 2的密度接种到胶原包被的培养板或培养皿中，加入适量铺板培养液，摇匀，在37°C、5% CO2培养箱中培养以充分让细胞贴壁。铺板培养液为商业化购买的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM轻乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氢钠,550mg/l丙酮酸钠,0.2mM抗坏血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺，IO^7M地塞米松，ITS+premix (含有6.25 μ g/ml胰岛素,6.25 μ g/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亚油酸)，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素，5%v/v胎牛血清(购至美国GIBCO公司)。4至6小时后，将铺板培养液吸出，加入新鲜生长培养液，每3至4天换I次新鲜培养液。生长培养液为商业化购买的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羟乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氢钠，550mg/l丙酮酸钠，0.2mM抗坏血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，IO^7M地塞米松，ITS+premix (含有6.25 μ g/ml胰岛素，6.25 μ g/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，
5.35 μ g/ml亚油酸)，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素,20ng/ml表皮生长因子(购至美国BD公司)。培养约一个月后，典型单层培养已经形成，加入含2% v/v DMSO的维持培养液，3至4天换一次新鲜培养液。维持培养液为商业化购买的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺,20mM轻乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氢钠，550mg/l丙酮酸钠,0.2mM抗坏血酸_2_磷酸，14mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺，10-7Μ地塞米松,ITS+premix(含有6.25 μ g/ml胰岛素,6.25 μ g/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亚油酸)，IOOunits/ml青霉素，100mg/ml链霉素,2% v/v DMS0。培养约一个月后,肝细胞堆积形成肝非实质细胞环绕、入侵生长的肝岛状结构。该共培养系统一般还可培养长达两个月。
[0042]检测与分析
[0043]1.对该共培养系统进行肝细胞特性检测:
[0044]—方面，用相差显微镜形态学观察在不同培养时间点的肝细胞形态；另一方面，利用免疫荧光的方法鉴定白蛋白的表达。
[0045]白蛋白免疫荧光的具体方法是:以六孔板的一孔为例，细胞培养至两个月时，吸去旧培养液，用常温PBS洗一次,立即用冰冷的4%多聚甲醒Iml (具体配方为:称取4g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入80ml去离子水，放入37°C恒温水浴箱，每隔I至2小时摇晃混匀，16至24小时后多聚甲醛会完全溶解，补充去离子水至100ml，调节pH值至7.2)，常温固定10至15分钟；用PBS在水平摇床上洗3次，每次5分钟；为增强抗体与细胞内蛋白的结合，使用Iml含0.25% v/v TritonlOO的PBS溶液常温处理45分钟；用PBS在水平摇床上洗3次，每次5分钟；封闭，加入适量封闭液(含有5% v/v山羊正常血清，2% m/v BSA的PBS溶液)，常温水平摇床孵育至少 I小时；利用含3% v/v山羊正常血清的PBS溶液稀释抗体，白蛋白兔多抗(购至美国Proteintech公司)稀释比例为1: 400,4°C摇床孵育过夜；再用含3%山羊正常血清的PBS溶液在水平摇床上洗3次，每次10分钟，以去除非特异结合的抗体；二抗为山羊抗兔IgG偶联DyLight-488 (购至美国Thermo Fisher Scientific Inc公司)，以1: 400稀释到含3%山羊正常血清的PBS溶液，于暗处避光常温孵育I小时，此后操作一律避光；再用含3%山羊正常血清的PBS溶液在水平摇床上洗2次，每次10分钟，第三次清洗时加入1: 1000的DAPI (购至瑞士 Roche公司)用于细胞核染色，常温孵育10分钟；再清洗一次以清洗掉残留的DAPI，10至20分钟；加入适量含3%山羊正常血清的PBS溶液防止在观察时细胞因干燥变形。最后，利用Leica DFC425C荧光显微镜(购至德国Leica公司)观察突光信号。
[0046]结果分析
[0047]a.共培养肝细胞在不同培养时间点的形态学观察分析:
[0048]利用上述两步胶原酶灌注法分离得到的单细胞混合物包括大细胞(成熟肝细胞)、小细胞(未成熟肝细胞)、肝星形细胞、肝表皮细胞、窦状内皮细胞等。为了避免原代细胞的接触抑制性，该混合物以低密度(小于等于8X IO4活细胞/cm2)的方式铺板，在生长培养基的培养下，这样可以极大限度的刺激肝细胞和肝非实质细胞的快速增殖。如图1 (A)所示，在第10天时肝细胞区(大箭头)被非实质细胞环绕，肝细胞与肝非实质细胞接触尚且不紧密，存在一定的非细胞区，此时细胞仍需继续生长，肝细胞之间的胆小管结构清晰可见(小箭头)，而环绕生长的主要是肝星形细胞(五角星);30天后(如B图)，细胞紧密程度加深，特别是非实质细胞区，此时为生长培养的终点，继续在生长培养基中培养对长期培养不利；此后，细胞在含2%DMSO的维持培养基中培养，第60天时，该共培养发生了显著变化，肝细胞聚集凸起，胆小管结构消失，肝细胞与非实质细胞的界线高亮明显，形成典型的肝岛状结构；接下来的培养，第80天(如D图)，和第100天(如E图)时，细胞状态没有明显变化，从细胞形态上看肝细胞仍然维持真肝细胞分化状态；但第120天(如F图)，肝细胞状态尚好，肝非实质细胞出现凋亡与老化现象，个别区域出现了集体死亡现象，我们把该时间点确定为共培养的终点。图片标尺为100微米。
[0049]b.肝岛状结构的形态学观察与免疫荧光检测:
[0050]为了进一步了解肝岛状结构及肝细胞的状态，首先利用相差显微镜在同一视野下观察同一肝岛状结构，在不同的焦平面拍照，如图2 (A，B, C)所示，肝细胞堆积成簇生长，在水平面上肝细胞高于非实质细胞生长；为了进一步弄清肝非实质细胞是否入侵到肝岛底层生长及肝岛上的肝细胞是否具有肝细胞特性，我们利用免疫荧光的方法检测了肝细胞的白蛋白表达及肝细胞核是否与非实质细胞重叠，如图2(D:绿色，白蛋白；E:蓝色，细胞核；F:同一视野下白蛋白与细胞核重叠图)，肝岛上的肝细胞表达白蛋白，说明该肝细胞尚未丢失肝细胞特性，再者肝细胞与肝非实质细胞的细胞核部分重叠，说明肝非实质细胞入侵到肝细胞的底层，形成一种类似细胞生物学上的饲养层结构。这种结构是肝细胞得以长期维持培养的关键所在。图片标尺为100 μ m。
[0051]2.HBV感染长期培养的肝细胞:
[0052]铺板后42天到72天，进行了 HBV易感性调查。感染液的配置方法为:WE中加入2%v/v DMS0、4% m/v (质量体积比)聚乙二醇8000、10% v/v高病毒滴度的病人血清(病毒滴度为2X IO9拷贝/ml)。配置好的感染液加入到待感染的细胞中，孵育16至24小时候，去掉感染液，用磷酸缓冲液清洗3次 ，加入新鲜含2%DMS0的维持培养液，2天换I次新鲜的培养液；收集旧培养液用作酶联免疫吸附试验，分析乙肝病毒表面抗原(英文缩写为HBsAg)、乙肝病毒e抗原(英文缩写为HBeAg)的分泌水平。在培养的后期，细胞固定后用免疫荧光的方法检测细胞内核心抗原(英文缩写为HBcAg)的表达。
[0053]ELISA与免疫荧光检测病毒感染后的关键指标检测方法:
[0054]HBeAg检测参照上海科华公司提供的乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒说明书，首先，将试剂盒中提供的25倍浓缩的洗涤液稀释成I倍的工作浓度，具体方法为:量取480ml纯化水，加入20ml浓缩洗涤液，充分混匀后，成500ml工作浓度洗涤液，待用。每孔加入待测样品50μ 1，每个样品设三个重复，设阴、阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照或阳性对照各50 μ 1，并设空白对照I孔；接着每孔加入酶结合物50 μ 1，充分混匀，封板，置于37°C孵育30分钟；然后，手工洗板，即弃去孔内液体，用试剂盒提供的洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复五次后拍干；完成洗板后每孔加入试剂盒提供的显色剂A液、显色剂B液各50 μ I(或I滴)，充分混匀，封板，置37°C孵育15分钟，之后每孔加入终止液50 μ I (或I滴)，混匀；最后用酶标仪读数，取波长450nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。
[0055]HBsAg检测参照上海科华公司提供的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒说明书，首先将试剂盒中提供的25倍浓缩的洗涤液稀释成I倍的工作浓度，具体方法为:量取480ml纯化水，加入20ml浓缩洗涤液，充分混匀后，成500ml工作浓度洗涤液，待用；然后加入75 μ I待测样品(每个样品三个重复)和阴、阳性对照于反应孔中(共预留阴性对照3孔、阳性对照I孔、建议预留空白对照I孔)，用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37°C孵育60分钟；取出反应板，撕去封片，在已加入待测样品和阴性、阳性对照的孔中加入50μ I酶结合物，手工轻轻震荡10秒钟，之后用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37°c孵育30分钟；取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次(手工洗板:弃去孔内液体，用配制的工作浓度洗涤液注满各孔，静置30至60秒，甩干，重复5次后，在干净的吸水纸上拍干);洗涤结束后立即在所有孔内加入试剂盒提供的显色剂A、显色剂B各50 μ 1，混匀，手工轻轻震荡10秒钟。然后用封片覆盖反应板后，将反应板置37°C孵育30分钟，之后每孔加入50 μ I终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。最后用酶标仪读数，取波长450nm，则先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。
[0056]分析HBV的核心抗原HBcAg免疫荧光的具体方法是:以六孔板的一孔为例，细胞感染至少12天后，吸去旧培养液，用常温PBS洗一次，立即用冰冷的4%多聚甲醛1ml，常温固定10至15分钟；用PBS在水平摇床上洗3次，每次5分钟；为增强抗体与细胞内蛋白的结合，使用Iml含0.25% v/v TritonlOO的PBS溶液常温处理45分钟；用PBS在水平摇床上洗3次，每次5分钟；封闭，加入适量封闭液(含有5% v/v山羊正常血清，2% m/v BSA的PBS溶液)，常温水平摇床孵育至少I小时；利用含3%山羊正常血清的PBS溶液稀释抗体，HBcAg兔多抗(购至丹麦Dako公司)稀释比例为1: 400，4°C摇床孵育过夜；再用含3%山羊正常血清的PBS溶液在水平摇床上洗3次，每次10分钟，以去除非特异结合的抗体；二抗山羊抗兔 IgG 偶联 DyLight-488 (购至美国 Thermo Fisher Scientific Inc 公司)以 1: 400 稀释到含3%山羊正常血清的PBS溶液，于暗处避光常温孵育I小时，此后操作一律避光；再用含3%山羊正常血清的PBS溶液在水平摇床上洗2次，每次10分钟，第三次清洗时加入1:1000的DAPI (购至瑞士 Roche公司)用于细胞核染色，常温孵育10分钟；再清洗一次以清洗掉残留的DAPI，10至20分钟；加入适量含3%山羊正常血清的PBS溶液防止在观察时细胞因干燥变形。最后，利用Leica DFC425C荧光显微镜(购至德国Leica公司)观察荧光信号。
[0057]结果分析
[0058]HBV感染长期培养的肝细胞分析
[0059]根据国际报道以及我们的未发表数据，原代肝细胞自分离之日起，由于快速的去分化现象，对HBV的易感性会在一周左右丢失殆尽。然而，在我们的共培养体系下，原代肝细胞在铺板42天与72天仍然具有HBV易感性。如图3所示，A, B分别表示该共培养体系在铺板42天后进行感染后HBsAg，HBeAg的分泌水平:一方面，HBsAg和HBeAg都是先降低后升高，表示该体系下的肝细胞具有HBV易感性；另一方面，感染后的肝细胞仍然能存活约10周，说明与肝非实质细胞共培养，不仅能保持肝细胞的HBV易感性，还能保持HBV感染后肝细胞的活力。铺板72天后的感染(图3，C，D), HBsAg, HBeAg的分泌水平和42天的病毒抗原分泌基本保持一致，说明该时间点该共培养体系仍然具有HBV易感性。细胞内病毒核心抗原HBcAg阳性免疫荧光信号(图3，E)更充分说明了该长期共培养的肝细胞对HBV具有易感性。[0060]3.肝岛状结构形成与HBV成功感染的模式图构建:
[0061]为了进一步简单明了地说明本发明的实施方案，我们提出了以下模式图。如图4所示，肝细胞与肝非实质细胞混合物以低密度的方式铺板(A);在生长培养基的培养下，肝细胞与肝非实质细胞特别是肝非实质细胞快速生长，铺满整个培养皿(B);在01^0的维持下，肝细胞被肝非实质细胞环绕、入侵，形成肝岛状结构(C);该岛状结构上的肝细胞能长期维持肝细胞特性和对 HBV的易感性(D) 。
【权利要求】
1.人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)新鲜的肝组织经暴露的血管用灌注溶液I灌注约30分钟，直至肝组织中血液被冲洗干净; 2)用37°C预热的灌注溶液II灌注步骤I)中冲洗干净的肝组织，直至肝组织失去弹性消化完全； 3)将步骤2)消化完全的肝组织转移至含有细胞洗液的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液； 4)将步骤3)中细胞悬液通过70μ m的细胞筛，得到单细胞悬液； 5)将步骤4)获得的单细胞悬液在50Xg和4°C条件下，离心5分钟沉降肝细胞与肝非实质细胞，用上述细胞洗液重悬，重复离心三次，然后利用铺板培养液重悬细胞； 6)利用台酚蓝染色法计算步骤5)中重悬细胞的细胞密度与细胞活力； 7)将步骤6)中单细胞悬液以<8X IO4活细胞/cm2的细胞密度接种到胶原包被的培养板或培养皿中，胶原包被的目的是促进细胞贴壁与肝细胞特性的维持，加入铺板培养液，摇匀，在37°C、5% CO2培养箱中培养以充分让其贴壁；经4至6小时后，加入生长培养液培养，3至4天换I次生长培养液； 8)培养28至35天，加入含有2%DMS0的维持培养液，3至4天换I次维持培养液； 9)培养30至40天，肝细胞堆积形成肝非实质细胞环绕、入侵生长的肝岛状结构； 其中，所述灌注溶液I具体配方为:8.00g/l氯化钠、0.40g/l氯化钾、3.57g/l羟乙基`哌嗪乙磺酸、0.06g/l 二水磷酸氢二钠、0.06g/l磷酸二氢钾、lg/1葡萄糖、ImM丙酮酸纳、2mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸，调pH至7.4 ; 所述灌注溶液II具体配方为:8.00g/l氯化钠、0.40g/l氯化钾、3.57g/l羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/l 二水磷酸氢二钠、0.06g/l磷酸二氢钾、lg/1葡萄糖、ImM丙酮酸纳、5mM氯化钙、0.3g/l IV型胶原酶，调pH至7.4 ; 所述细胞洗液具体配方为=DMEM培养液中加入10% v/v胎牛血清，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素； 所述铺板培养液为:William’ s E medium在使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羟乙基哌嗪乙磺酸,17mM碳酸氢钠,550mg/l丙酮酸钠,0.2mM抗坏血酸-2-磷酸,14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，KT7M地塞米松，ITS+premix, 100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素,5% v/v胎牛血清;其中，ITS+premix含有6.25 μ g/ml胰岛素，6.25 μ g/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亚油酸； 所述生长培养液为:William’ s E medium在使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羟乙基哌嗪乙磺酸,17mM碳酸氢钠,550mg/l丙酮酸钠,0.2mM抗坏血酸-2-磷酸,14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，KT7M地塞米松，ITS+premix, 100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素，20ng/ml表皮生长因子;其中，ITS+premix含有6.25 μ g/ml胰岛素，6.25 μ g/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亚油酸； 含2% v/v DMSO的维持培养液为:William’s E medium在使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM轻乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氢钠，550mg/l丙酮酸钠,0.2mM抗坏血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺，KT7M地塞米松，ITS+premix, 100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素，2% v/v DMSO ;其中，ITS+premix 含有 6.25 μ g/ml 胰岛素，6.25 μ g/ml 转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亚油酸。
2.根据权利要求1所述的人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法，其特征在于:所述步骤6)中，细胞密度与细胞活力方法为:将细胞悬液与0.4% m/v台酚蓝染色液以1:1的体积比混匀，迅速将20μ I混合液加入到计数板中且将该计数板插入相应的计数仪中，仪器读出相应的细胞密度与细胞活力，0.4%台酚蓝染色液具体配制方法为:0.4g台酚蓝固体完全溶解到100ml的PBS溶液中。
3.根据权利要求1所述的的人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法，其特征在于:所述胶原包被的培养板或培养皿的制备方法:在无菌条件下，将172 μ I冰醋酸加入到100ml去离子水中，再加入终浓度为50μ g/ml的IV型鼠尾胶原，0.22μπι滤膜过滤除菌后，4°C保持待用；将该工作液以5 μ g/cm2的包被量加入到需要包被处理的培养板或培养皿中，常温孵育；1小时后，将胶原工作液吸出，自然晾干后封口 4°C保持；用前，胶原包被的培养板或培养皿需用PBS清洗一次，`以去除残留的醋酸。
【文档编号】C12N5/071GK103509751SQ201310282851
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年7月8日 优先权日:2013年7月8日
【发明者】胡康洪, 周明, 曹晓蓓 申请人:康珞生物科技（武汉）有限公司