一种高表达snd1-flag转基因小鼠模型的制备方法
【专利摘要】一种高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型的制备方法。SND1蛋白与哮喘、过敏、结肠癌、肺癌等多种疾病相关。本发明即为针对位于染色体6A3.3的鼠源SND1转基因小鼠构建方法。主要流程：首先构建pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1转基因载体；然后利用受精卵原核注射技术，将外源SND1基因在C57BL6/j小鼠基因组中随机插入，最终建立小鼠基因组中带有外源SND1基因的遗传性小鼠突变模型。由本发明所制备的SND1转基因小鼠在实际应用中有助于研究多功能SND1蛋白在生殖发育、糖脂代谢、肿瘤增殖、迁移等方面的作用机制，为临床相关疾病的诊疗提供有效的研究平台。
【专利说明】—种高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及转基因【技术领域】，具体涉及一种高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型的制备方法。
【背景技术】
[0002]SNDl (staphylococcal nuclease domain containing I)蛋白，又称 plOO 蛋白，Tudor-SN (tudor staphylococcal nuclease),首次作为 EBNA2 (Epstein-Barr virusnuclear protein 2, EB病毒细胞核抗原2)的转录调控激活因子被发现。研究发现，SNDl蛋白广泛表达于人、牛、小鼠、大鼠及斑马鱼等物种中，可参与基因转录、剪接体加工、细胞增殖、细胞应激、RNA干扰、病毒感染等多种重要的细胞生物学事件。
[0003]SNDl蛋白由N端四个重复葡萄球菌核酸酶样(Staphylococcal nucleases-like,SN-1ikeMA SN( I?4)结构域及 C 端的 SN5a-Tudor_SN5b(TSN)结构域组成。SND1-TSN 包含 4个α -螺旋、9个β -折叠和14个连接环，其中β (广2)折叠参与SN5a(679 - 703)的构成，大部分α 1-螺旋和β (3?6)折叠形成典型的β -桶状tudor(704 - 793)结构域，β (7?9)-折叠和α (2?4)螺旋参与SN5b (794 - 895)的构成。Tudor结构域具有负电荷表面，还包含一个由保守的3个酪氨酸(Tyr721、Tyr738、Tyr741)及I个苯丙氨酸(Phe715)残基组成的芳香族笼子，其可以钩住富含尿卩密唳的小核核糖核蛋白体(Uridine-rich small nuclearribonucleo-proteins, U snRNPs)的甲基化基团，而将其锚定于剪接体(spliceosome)上。另外，SNDl蛋白的三维模型发现SN (1?4)结构域具有正电荷表面，而SM具有与TSN相似的可能参与蛋白结合作用的负电荷表面。SNDl蛋白的SN3、SM、Tudor-SN5结构域聚集在一起形成新月状结构，其SN3、SM所形成的凹陷型碱性表面是RNase活性位点上柠檬酸盐离子的结合部位，可像夹子一样特异性地结合并降解处于高编辑(hyper-edited)状态的含有IU、UI的双链microRNA前体。
[0004]多功能SNDl蛋白具有较为广泛且重要的生物学作用，其中任一环节出现异常，都有可能引起一定的临床疾病。陆续有文献报道SNDl蛋白与哮喘、过敏、结肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌等多种人类疾病相关。比如，SNDl蛋白可通过NF-KB/mir221途径促进人类肝细胞癌的肿瘤血管生成。寡居核苷酸微阵列基因表达分析发现人类结肠腺癌SNDl基因表达上调。SNDl蛋白在结肠癌早期表达升高，并通过转录后调控抑制腺瘤状结肠息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein, APC)的表达,影响细胞的接触抑制、极化、增殖等，在结肠癌早期形成过程中发挥着重要的作用。对比肾细胞癌与正常肾组织的基因表达谱微阵列分析发现非编码基因的转录在肾组织中较普遍，并且若干肿瘤相关的编码与非编码基因转录水平在肾细胞癌组织中均显著下调。在肾透明细胞癌(Clear Cell RenalCarcinoma)的基因表达中，SNDI的非编码基因转录本明显下调，推测SNDl可能通过非编码基因调控方式来影响STAT信号转导通路，进而参与肾癌的发生与发展。另外，SNDl蛋白高表达于复发的雄激素非依赖型前列腺癌组织中，有望成为前列腺癌的生物诊断标记和临床治疗靶点。早期肿瘤SNDl蛋白的高表达与临床乳腺癌转移发生率呈正相关。SNDl可与一种介导癌细胞远程转移的Metadherin (或称MTDH3、Lyric、AEGl)蛋白结合,通过调节与肿瘤转移和化学耐受相关基因(ALDH3A1和KiSSl)的表达，促进小鼠乳腺癌的肺转移。SNDl还与Metadherin蛋白在结肠癌中共同高表达，有望成为结肠癌早期诊断的新靶点。本发明提供的高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型制备方法方便研究SNDl蛋白在肿瘤增殖、迁移等过程中的作用机制，为临床肿瘤疾病的诊疗提供研究平台。
【发明内容】
[0005]本发明目的是解决如何在小鼠等动物体内研究多功能SNDl蛋白的功能机制问题，提供一种高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型的制备方法。小鼠SNDl基因定位于染色体6A3.3，这里我们针对小鼠SND1-FLAG基因构建转基因小鼠，有助于从动物水平深入研究此多功能蛋白。
[0006]本发明所述转基因小鼠模型的具体构建过程如下:
第 I 步、pInsulator-CAG-3XFLAG-SNDl 转基因载体构建:
对小鼠SNDl基因转录本(BC007126.1)进行酶切位点分析(图1)。因小鼠SNDl基因ORF片段较长且含有EcoR I和Nhe I酶切位点，故根据后续载体特点，以EcoR I为分界点将ORF分为SNDl-A和SNDl-B两个片段，先后插入相应转基因载体中；转基因载体中SNDl基因N端追加有一个3 X FLAG标签基因。
[0007]第2步、转基因载体原核显微注射:
将第I步构建的外源线性Plnsulator CAG 3 XFLAG SNDl转基因载体注射到C57BL6/j小鼠受精卵细胞核内；外源的SNDl基因会随机插入到小鼠基因组中，最终构建的SNDl转基因小鼠能够在全组织中过表达携带有3XFLAG标签的SNDl蛋白，便于进行后续的蛋白沉淀、蛋白印迹、质谱分析实验。
[0008]第3步、品系基因鉴定，最终建立小鼠基因组中带有外源SNDl基因的遗传性小鼠突变模型:
经过第2步处理后出生的首代SNDl转基因阳性的小鼠即为Founder小鼠；每个Founder都将被视为一个独立的品系进行繁育，对每个founder品系都进行首次剪趾，二次剪尾的PCR鉴定。
[0009]本发明的优点及效果:
(I)本发明提供的高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型制备方法在实际应用中方便研究多功能SNDl蛋白在小鼠生殖发育、糖脂代谢、机体应激防御等方面的作用机制。
[0010](2)本发明提供的SND1-FLAG转基因小鼠模型可过表达有带有FLAG标签的SNDl蛋白方便进行后续实验，如蛋白沉淀、蛋白印迹、质谱分析等。
[0011](3)本发明提供的高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型制备方法方便研究SNDl蛋白在肿瘤增殖、迁移等过程中的作用机制，为临床肿瘤疾病的诊疗提供研究平台。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1.小鼠SNDl基因ORF重要酶切位点。
[0013]图2.小鼠SNDl基因A片段引物设计。
[0014]图3.pcDNA3.1 3 XFLAG RheB质粒酶切及与SND1-A片段连接图谱。
[0015]图4.pcDNA3.1 3 XFLAG SND1-A 质粒图谱。
[0016]图5.pCAG 3 XFLAG SND1-A 质粒图谱。
[0017]图6.pCAG 3 X FLAG SNDl 质粒图谱。
[0018]图7.plnsulator empty 载体图谱。
[0019]图8.plnsulator CAG 3 XFLAG SNDl 质粒。
[0020]图9.plnsulator CAG 3 XFLAG SNDl质粒的I Ceu I酶切鉴定及线性转基因载体纯化。
[0021]图10.SNDl转基因小鼠首次剪趾PCR鉴定。
[0022]图11.SNDl转基因小鼠二次剪尾PCR鉴定。
[0023]图12.成功构建的SNDl转基因小鼠。
【具体实施方式】
[0024]一种高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型的制备方法。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0025]实施例1 pInsulator-CAG-3XFLAG-SNDl 转基因载体构建
(I)SNDl基因N端追加3 X FLAG标签
O以小鼠SNDl基因转录本(BC007126.1)为模板，PCR法扩增SNDl-A片段。其中设计引物时在上游加入Bgl II酶切位点，下游依次加入Xho I ,Not I和Sal I酶切位点(图2)。然后PCR产物胶回收，纯化线性SNDl基因A片段，然后进行Bgl II和Sal I双酶切处理。
[0026]2)以 BamH I 和 Xho I 酶切 pcDNA3.1 3 XFLAG RheB 质粒，获含 3 XFLAG 标签的线性载体，并与带有Bgl II和Sal I酶切后粘性末端的SNDl基因A片段T4连接酶连接(图3)，并转化、鉴定、测序、纯化，最终获得pcDNA3.1 3XFLAG SNDl-A载体(图4)。注:BamH I I与Bgl II ,Xho I与Sal I均系同尾酶。此时已人工修改了 pcDNA3.1 3XFLAG上的酶切顺序,并且破坏BamH I和Sal I酶切位点，方便后序载体构建。
[0027](2) pCAG 3XFLAG SNDl 质粒构建
I)以 Nhe I 和 Xho I 分别酶切 pCAG_MS2 载体和 pcDNA3.1 3XFLAG SNDl-A 载体，电泳分离、纯化线性口046-1^2载体和带有3父？1^6的SNDl-A基因片段，T4连接酶连接，并转化、鉴定、测序、纯化，最终获得pCAG 3XFLAG SNDl-A载体(图5)。
[0028]注:CAG启动子是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒(the cytomegalovirus,CMV)早期增强子(early enhancer element)和鸡 β -肌动蛋白(chicken beta-actin)启动子组成，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。
[0029]2)以小鼠SNDl基因转录本为模板，PCR法扩增SNDl-B片段。其中设计引物时在上游含有EcoR I内源性酶切位点，下游加入Sal I酶切位点。然后PCR产物胶回收，纯化线性SNDl基因B片段，然后进行EcoR I和Sal I双酶切处理，电泳分离、纯化线性SNDl-B基因片段。
[0030]3)以EcoR I和Xho I酶切pCAG 3 XFLAG SND1-A质粒，电泳分离、纯化，线性pCAG3 XFLAG SNDl-A载体，再与线性SNDl-B基因片段T4连接酶连接，并转化、鉴定、测序、纯化，最终获得pCAG 3XFLAG SNDl载体(图6)。
[0031]注:由于SND1A，B两片段采用同一个内源性EcoR I，故不存在蛋白翻译的框移突变问题。
[0032](3) plnsulator CAG 3XFLAG SNDl 质粒构建与鉴定
I)以 Sal I 和 BamH I 分别酶切 plnsulator empty 载体(图 7)和 pCAG 3XFLAG SNDl载体，电泳分离、纯化线性plnsulator empty载体和带有3 X FLAG和CAG元件的SNDl基因片段，T4连接酶连接，并转化、鉴定、测序、纯化，最终获得plnsulator CAG 3XFLAG SNDl载体(图8)。注:使用隔离子(Insulator)来可减少插入位点对转基因表达的影响。
[0033]2)针对plnsulator CAG 3XFLAG SNDl转基因载体设计引物，进行测序分析，鉴定是否存在点突变。另外，根据图谱以I Ceu I酶切此转基因载体，然后进行琼脂糖电泳鉴定(图9A)，可观察到M，N两条线性条带。针对M条带进行胶回收纯化处理，电泳鉴定在7861bp左右得到较单一条带(图9B)，最终带得线性的plnsulator CAG 3XFLAG SNDl转基因载体。
[0034]所用引物序列:
SND1-M41-F:5’ GCGTCTCCTCTTTTGCTCCC 3’
SND1-M685-R:5’ TGCTTGTTCCTCGCATTCTG 3’
SND1-M862-F:5’ TCACCACCTTGTCACCGTCA 3’
SND1-M1219-R:5’ AGCAGTGGGAGGCACATAGTC 3’ 。
[0035]实施例2转基因载体原核显微注射
将外源线性plnsulator CAG 3 XFLAG SNDl转基因载体注射到C57BL6/j小鼠受精卵细胞核内；外源的SNDI基因会随机插入到小鼠基因组中，最终构建的SNDI转基因小鼠能够在全组织中过表达携带有3XFLAG标签的SNDl蛋白，便于进行后续的蛋白沉淀、蛋白印迹、质谱分析实验。
[0036]实施例3品系基因鉴定，最终建立小鼠基因组中带有外源SNDl基因的遗传性小鼠突变模型
(O首次剪趾鉴定
O剪趾并抽取90只小鼠基因组DNA:幼仔出生15天左右进行编号剪脚趾；将所剪小鼠脚趾样本加EB (裂解液)55 μ I (裂解液100:1加入蛋白酶K)，55°C裂解过夜；次日将样本取出，12000r/min，离心Imin ;将样本取出，加入700 μ I酚/氯仿(1:1)，混勻；12000r/min,离心5min.取上清至1.5mlEP管，加2倍体积100%乙醇。轻轻混匀，会有絮桩沉淀出现;12000r/min,离心 5min.弃上清；加 700 μ I 70% 冰乙醇，混勻，12000r/min,离心 5min ；弃上清，12000r/min，离心Imin ;超净台晾干，加入80 μ I EB缓冲液/ddH20，60°C溶解0.5h。
[0037]2)PCR鉴定:以小鼠基因组DNA为模板，进行PCR扩增鉴定。采用引物F: 5 ‘GCAACGTGCTGGTTATTGTG; R: CTGGGTTGTTGGCTCTCAT, PCR 产物大小为 594bp。鉴定结果显示(图 10):#2、#30、#39、#40、#43、#46、#56、#61、#64、#66、#73 为阳性鼠。(备注:43# 死亡)
(2)二次剪尾鉴定
对于首次鉴定呈阳性的小鼠进行剪尾、抽取小鼠基因组DNA，并以之为模板，进行PCR鉴定，方法同上。鉴定结果(图11)显示:#2、#30、#39、#46、#56、#61、#64、#66、#73为阳性鼠。至此，SNDl转基因小鼠模型构建成功(图12)。
【权利要求】
1.一种高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型的制备方法，其特征包括以下步骤: 第 I 步、pInsulator-CAG-3XFLAG-SNDl 转基因载体构建； 第2步、转基因载体原核显微注射； 第3步、品系基因鉴定，最终建立小鼠基因组中带有外源SNDl基因的遗传性小鼠突变模型。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于第I步所述plnsulator-CAG-3XFLAG-SNDI转基因载体的构建方法是，以EcoR I为分界点将较长的小鼠SNDl基因ORF分为SNDl-A和SNDl-B两个片段，先后插入转基因载体中；转基因载体中SNDl基因N端追加有一个3 X FLAG标签基因。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于第2步所述的转基因载体原核显微注射是:将外源线性plnsulator CAG 3 XFLAG SNDl转基因载体注射到C57BL6/j小鼠受精卵细胞核内；外源的SNDI基因会随机插入到小鼠基因组中，最终构建的SNDI转基因小鼠能够在全组织中过表达携带有3XFLAG标签的SNDl蛋白，便于进行后续的蛋白沉淀、蛋白印迹、质谱分析实验。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于第3步所述的基因鉴定是:出生的首代SNDl转基因阳性的小鼠即为Founder小鼠；每个Founder都将被视为一个独立的品系进行繁育，对每个founder品系都进行首次剪趾，二次剪尾的PCR鉴定。
【文档编号】C12N15/85GK104278056SQ201310285219
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月9日 优先权日:2013年7月9日
【发明者】杨洁, 高星杰, 魏民新, 王鑫廷, 段中潮, 辛灵彪 申请人:天津医科大学