猪链球菌多肽和编码其的多核苷酸以及它们在疫苗和诊断中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及链球菌的领域。更具体地，本发明涉及鉴定多肽，和编码其的多核苷酸序列，其涉及猪链球菌的发病机制。本发明还涉及将这样的多肽用于预防，治疗和诊断猪链球菌相关疾病和由猪链球菌造成的感染的组合物和方法的应用。
【专利说明】猪链球菌多肽和编码其的多核苷酸以及它们在疫苗和诊断中的应用
[0001]本申请是申请日为2006年9月I日的发明名称为“猪链球菌多肽和编码其的多核苷酸以及它们在疫苗和诊断中的应用”的中国专利申请No. 200680038555. 9的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及链球菌（Streptococcus)领域。更具体地，本发明涉及鉴定多肽和编码其的多核苷酸序列，其涉及猪链球菌（Streptococcus suis)的发病机制。本发明还涉及将所述多肽用于预防、治疗和诊断与猪链球菌相关的疾病和由猪链球菌导致的感染的组合物和方法中的应用。
[0003]发明背景
[0004]猪链球菌是一种重要的猪病原体，其导致许多病理疾病诸如关节炎，心内膜炎，脑膜炎，肺炎和败血病（13，14)。其还是对于接触污染的猪或它们的副产物的人的重要的动物传染病病原体，导致脑膜炎和心内膜炎（1，36)。目前已知基于荚膜抗原的三十三种血清型(1-31型，33和1/2型）（9-11，15，17，31)。2型被认为是在染病的猪中最致命和最流行的类型。目前还不完全了解涉及猪链球菌的发病机理和致病力的机制（13)并且尝试控制感染的努力被缺乏有效疫苗所阻碍。
[0005]已经开展了一些方法来开发猪链球菌的疫苗。然而，取得的成功十分有限，因为保护是血清型或菌株依赖型的并且结果在大多数情形中是不可靠的（16，30)。例如，报道了一些用杀死的全细胞和活的无毒疫苗获得的保护，但是这需要重复的免疫并且针对异种攻击的保护是不确定的（18，38)。将幼猪暴露于活的致病力强的菌株显示在减少猪链球菌感染的临床体征特征上具有积极的效果，但是在减少中枢神经体征和死亡率上则差强人意
(35)。由于猪链球菌荚膜在致病`力中具有重要作用，因此进行了基于荚膜物质开发疫苗的尝试。然而，这种疫苗是不令人满意的，因为荚膜多糖的免疫原性较差（7)。最近，已经将兴趣转移到将猪链球菌的蛋白质抗原作为疫苗候选物上。已经显示，使用suilysin(20)，或MRP (溶菌酶-释放蛋白质）和EF(细胞外蛋白质因子）（39)的亚单位疫苗保护猪免于同型和异型2型血清型菌株，但是它们的应用被这样的事实所妨碍，即在一些地理区域中的显著数量的致病力强的菌株并不表达这些蛋白质（8，12，29)。因此，鉴定其它的抗原因子，尤其是表面蛋白质可以有助于开发亚单位疫苗。
[0006]因此，有开发和应用用于预防、治疗和诊断猪链球菌相关疾病和猪链球引起的疾病的新靶标的需要。
[0007]发明概述
[0008]本发明的目标满足上述需要。更具体地，通过提供在SEQ ID NO: I提出的氨基酸序列的N端区域包含至少15个连续氨基酸的分离的多肽来实现该目标。
[0009]本发明的另一个目标还涉及编码如上定义的多肽的多核苷酸。
[0010]本发明还涉及特异性结合于本发明的多肽的抗体。
[0011]本发明的另一个目的是提供包含如上定义的多核苷酸的载体。[0012]本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗猪链球菌相关疾病或由猪链球菌导致的感染的组合物，其包含可接受的载体和下列成分的至少一种：
[0013]-如上定义的多肽；
[0014]-如上定义的多肽；
[0015]-如上定义的抗体；
[0016]-如上定义的载体。
[0017]本发明的另一个目标涉及治疗和/或预防动物中猪链球菌相关疾病或感染的方法，所述方法包括向动物施用如上定义的组合物的步骤。
[0018]另一个目标涉及检测样品中猪链球菌菌株的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步骤：
[0019]a)在足以形成免疫复合物的条件下，将所述样品与本发明的抗体接触一段时间；和
[0020]b)检测在a)中形成的免疫复合物的存在或不存在。
[0021]本发明的另一个目标涉及检测样品中针对猪链球菌菌株产生的抗体的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步骤：
[0022]a)在足以形成免疫复合物的条件下，将所述样品与本发明的多肽接触一段时间；和
`[0023]b)检测在a)中形成的免疫复合物的存在或不存在。
[0024]本发明还在另一个目的中提供用于检测指示猪链球菌菌株的抗体的存在或不存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：
[0025]-根据本发明的多肽；
[0026]-检测多肽-抗体免疫复合物的试剂；
[0027]-缺乏与所述肽免疫性结合的抗体的生物参比样品；和
[0028]-包含可以特异性结合于所述肽的抗体的比较样品；
[0029]其中所述多肽，试剂，生物参比样品，和比较样品以足以进行所述检测的量存在。
[0030]另一个目的是提供用于检测指示猪链球菌菌株的抗体的存在或不存在的诊断试剂盒，其包括：
[0031]-本发明的抗体；
[0032]-检测多肽-抗体免疫复合物的试剂；
[0033]-与所述抗体免疫结合的生物参比样品多肽；和
[0034]-包含可以与所述肽特异性结合的多肽的比较样品；
[0035]其中所述抗体，试剂，生物参比样品，和比较样品以足以进行所述检测的量存在。
[0036]另一个目标是提供包含与SEQ ID NOll中提出的序列或其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的分离的多肽，和编码所述多肽的分离的多核苷酸，和它们在用于治疗和/或预防动物中猪链球菌相关疾病或感染的组合物和/或方法中的应用。
[0037]附图简述
[0038]除非另外特别相反地指出，术语“SP1”和“Sao”交互使用。
[0039]图I:本发明的优选多核苷酸，即重组质粒pSS735的DNA插入物的示意图和部分限制性酶切图谱。数字指示从5’端的距离（以碱基对表示）。[0040]图2:编码本发明的第一个实施方案的优选多肽，即猪链球菌的SPl (或Sao)蛋白质的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。SD序列以斜体字母和下划线表示。以粗体显示起始密码子，ATG和终止密码子，TAA。用下划线表示SPl的N-和C端的两个疏水片段。垂直箭头指示可能的信号肽酶的裂解位点。Rl-RlO表示重复单位的起始。用虚线下划线表示可能的细胞壁相关区域。用框表示LPVTG膜锚定基序，并且指示带电荷的C端尾。
[0041]图3: SPl 的 Lys319 到 Val6ci1 区域与水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzaepv. oryzae)的AvrXa7无毒因子的氨基酸序列排比。垂直线表示具有相同残基的位置。双点表示保守替换，而单点表示功能替换。
[0042]图4:MBP_SP1融合蛋白质在大肠杆菌（E. coli)XLl-Blue中的表达和重组成熟SPl的纯化。用恢复期猪血清检测的相应样品的考马斯蓝染色的凝胶（A)和蛋白质印迹分析(B)显示在用IPTG诱导前（泳道I)和后（泳道2)的大肠杆菌全细胞裂解物，细胞质的提取物（泳道3)，亲和性纯化的MBP-SPl融合蛋白（泳道4)，通过因子X裂解的SPl和MBP (泳道5)，和使用离子交换层析法纯化的无MBP的重组SPl (泳道6)。在左边显示标准蛋白质的分子量。
[0043]图5:猪链球菌的免疫电镜显微观察（4500x)。使用单特异性SPl抗血清和金缀合的二抗（B)证实了 SPl在猪链球菌上的表面定位。在对照细菌细胞上没有观察到标记（A)。棒，200nm。
[0044]图6:在小猪中用SPl接种疫苗后的抗体反应。⑷通过ELISA测量在血清中的总的SPl-特异性IgG，显示单一 SPl注射激发显著的IgG反应，其明显由强化剂增强。（B)在SPl免疫的猪中对于血清IgG同种型的ELISA显示IgGl水平持续比IgG2水平更高。将结果表示为吸光度的平均值和标准偏差。*:p < 0.05 [0045]图7:在用Quil A和Quil A加SPl免疫的小鼠中的SPl -特异性总的体液IgG滴度。
[0046]图8:在来自用重组SPl免疫的小鼠的血清中的IgG亚类。
[0047]图9:用重组SPl接种疫苗保护小鼠免于猪链球菌攻击感染。
[0048]图10:用重组SPl接种疫苗保护小鼠免于猪链球菌引起的死亡。
[0049]图11:本发明的优选的功能性多核苷酸片段的核苷酸序列，即SPlA基因片段和推导的氨基酸序列。
[0050]图12:重组噬菌体的示意图和6. 3kb插入物的部分限制性酶切图谱。数字指示从5’端的距离（以碱基对表示)。
[0051]图13:编码本发明的另一个实施方案的优选多肽的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列，即猪链球菌的SP2蛋白质。用下划线表示SP2的N端的带正电荷的簇。用虚线下划线表示可能的N-端信号序列。用框表示LysM结构域，并且用箭头指示重复单位的开始。
[0052]图14:在不同的猪链球菌血清型中的SP2基因的分布。通过PCR从33个猪链球菌血清型参比菌株中的31个扩增SP2基因。
[0053]图15:在大肠杆菌中的Trx-His-SP2融合蛋白的表达和重组成熟SP2的纯化。考马斯蓝染色凝胶显示用IPTG诱导后的大肠杆菌全细胞裂解物，亲和性纯化的Trx-His-SP2融合蛋白，通过肠激酶裂解的SP2和Trx-His，通过阴离子交换层析法分离的成熟的SP2和Trx-His标记。在左边表示分子量。
[0054]图16:重组SP2的免疫原性和IgG-结合活性。a) SP2-特异性兔血清与猪链球菌S735的细胞制备物反应。b)重组SP2与恢复期猪血清反应。重组SP2与人（c)和猪（d)IgG结合。[0055]图17:在小鼠中用重组SP2接种疫苗后的抗体反应。通过ELISA测量血清中的SP2-特异性IgG。
[0056]图18:用重组SP2接种疫苗减缓了用致病力强的猪链球菌菌株攻击的小鼠中的临床体征。
[0057]图19:用重组SP2接种疫苗保护小鼠免于猪链球菌引起的死亡。
[0058]图20:用根据本发明的优选实施方案的组合物接种疫苗的猪，在攻击后的体温。
[0059]图21:用根据本发明的优选实施方案的组合物接种疫苗的猪在攻击后的临床疾病。
[0060]图22:用根据本发明的优选实施方案的组合物接种疫苗的猪在攻击后的存活。
[0061]图23:用根据本发明的优选实施方案的组合物接种疫苗的猪的血清总的IgG滴度。
[0062]图24:从用根据本发明的优选实施方案的组合物接种疫苗的猪诱导的IgG亚类。
[0063]图25:在根据本发明的优选实施方案的两个SPl多肽，即SEQ ID NOl和2之间的氨基酸序列排比。
[0064]图26:在根据本发明的优选实施方案的两个SPl多肽，即SEQ ID NOl和3之间的氨基酸序列排比。
[0065]图27:在根据本发明的优选实施方案的两个SPl多肽，即SEQ ID N02和3之间的氨基酸序列排比。
[0066]图28:在根据本发明的优选实施方案的三个SPl多肽，即SEQ ID NOU2和3之间的氨基酸序列排比。
[0067]发明简述
[0068]发明人意外发现两种新的猪链球菌多肽和编码其的多核苷酸，其在猪链球菌发病机制中有所涉及。就此而论，本发明具体涉及它们的鉴定和所述多肽或多核苷酸在组合物和方法中的应用，所述组合物和方法用于预防，治疗和诊断猪链球菌相关疾病或由猪链球菌导致的感染。
[0069]本发明的方法可以应用的猪链球菌相关疾病的非穷举性列表包括那些，如关节炎，心内膜炎，脑膜炎，肺炎和败血症。
[0070]定义
[0071]术语“分离的”意为描述在不同于其中多核苷酸，多肽，抗体或宿主细胞天然存在的环境的环境中存在的多核苷酸，多肽或抗体。
[0072]术语“动物”指对链球菌菌株如猪链球菌感染敏感的任何动物。具体地，这样的动物可以是，但不限于，小鼠，猪，山羊，马和人。更具体地，所述动物由猪组成。
[0073]术语“治疗”指通过其与链球菌菌株相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。用于本文时，术语“预防”指通过其与链球菌菌株相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟。[0074]术语“保护性反应”意为在动物中预防猪链球菌相关疾病或由猪链球菌导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。例如，可以通过指定如在实施例4中限定的临床评分来评估“保护性反应”的水平。
[0075]表述“可接受的载体”意为包含通过本发明的方法获得的化合物的赋形剂，其可以施用于动物宿主，而没有不利副作用。本领域已知的适合的载体包括，但不限于，金颗粒，无菌水，盐水，葡萄糖，右旋糖或缓冲溶液。载体可以包含助剂，包括但不限于，稀释剂，稳定剂(即，糖和氨基酸)，防腐剂，湿润剂，乳化剂，PH缓冲剂，粘度增强添加剂，颜料等。
[0076]用于本文时，术语“片段”指这样的多核苷酸序列(例如，cDNA)，其是人工构建(例如通过化学合成)或通过将天然产物裂解成多个小片段(使用限制性内切酶，或机械剪切)构建的本发明核酸的分离的部分，或通过PCR，DNA聚合酶或本领域公知的任何其它聚合技术合成的核酸的部分，或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸的部分。
[0077]1、本发明的多核苷酸和多肽
[0078]在第一个实施方案中，本发明涉及分离的多肽，其由表面蛋白质，更具体地猪链球菌的C-端锚定表面蛋白，即所谓SPl或Sao组成。如在实施例部分中所显示，当施用于动物，如猪时，SPl多肽有利地激发针对猪链球菌菌株攻击的保护性反应。
[0079]具体地，本发明的第一个实施方案的分离的多肽在SEQ ID NO:1提出的氨基酸序列的N端区域包含至少1 5个或优选地甚至25个或更优选地甚至至少35个连续氨基酸。如本领域技术人员可理解的，当指Sao蛋白时，在本发明上下文中的术语“N-端区域”优选地由跨越SEQ ID NO:1提出的氨基酸序列的氨基酸残基1-293的区域组成。
[0080]根据一个优选实施方案，第一个实施方案的分离的多肽可以还包含至少一个重复的氨基酸序列，如在图2中所 显示。更具体地，本发明所意欲的重复氨基酸序列由在SEQ IDN09中显示的氨基酸序列组成，
[0081]其中
[0082]-Xaa1 是 Val, Thr 或 Ile;
[0083]-Xaa3 是 Lys 或 Glu;
[0084]-Xaa4 是 Lys 或 Glu;
[0085]-Xaa5 是 Ala 或 Gln;
[0086]-Xaa7 是 Thr 或 Pro;
[0087]-Xaa8 是 Gly, Ser 或 Val;
[0088]-Xaa9 是 Lys, Val, Ile 或 Asn;
[0089]-Xaa10 是 Glu 或 Val;
[0090]-Xaa11 是 Lys 或 Asn;
[0091]-Xaa12 是 Gly, Glu 或 Asp;
[0092]-Xaa13 是 Asn 或 Met;
[0093]-Xaa14 是 lie, Ala 或 Val;
[0094]-Xaa15 是 Glu 或 Val;
[0095]-Xaa16 是 Pro 或 Thr;
[0096]-Xaa18 是 Glu 或 Gln;[0097]-Xaa19 是 Lys 或 Glu;
[0098]-Xaa22 是 Thr 或 Ala;
[0099]-Xaa26 是 Lys 或 Asn;
[0100]-Xaa27 是 Asp 或 Glu;
[0101]-Xaa28 是 Asn 或 Lys;
[0102]-Xaa29 是 Ile 或 Val 和
[0103]-Xaa30 是 Glu 或 Val。
[0104]要理解，本发明的优选的SPl多肽可以包含仅一个所述重复序列，而在一些其它情形中，本发明的优选的SPl多肽可以包含至少两个重复序列或甚至多于10个这样的重复序列。
[0105]根据本发明的另一个优选实施方案，分离的SPl多肽在SEQ ID N0:1提出的氨基酸序列的C端区域有利地包含至少15个或优选地甚至25个或更优选地甚至至少35个连续氨基酸。优选地，C端区域包含膜锚定基序，如由在SEQ ID NOlO提出的氨基酸序列组成的膜锚定基序，即Lys Pro Val Thr Gly0
[0106]如本领域技术人员可以理解的，当指SPl蛋白时，在本发明的上下文中的术语“C-端区域”优选地由跨越SEQ ID NO:1中提出的氨基酸序列的氨基酸残基的593-670的区域组成。
`[0107]根据甚至更优选的实施方案，本发明的SPl多肽包含与选自由SEQ ID N0S1-3或其功能衍生物组成的组的序列基本上相同的氨基酸序列。最优选地，本发明的SPl多肽由与SEQ ID NOl显示的序列或其功能衍生物基本上相同的氨基酸序列组成。
[0108]如本文一般理解和使用，“功能衍生物”指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物活性的蛋白/肽序列。换言之，其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时，基本上保留了激发免疫应答，如针对猪链球菌菌株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。本发明所意欲的优选的功能衍生物包含基本上与SEQ ID N04中提出的序列相同的氨基酸序列。更具体地，优选的功能衍生物由SEQ ID NOl的315个氨基酸片段(S28-K342)组成。将这样的片段或多肽称为SPlA并且将其核苷酸和氨基酸序列显示在图11中。SPlA与恢复期猪血清在免疫印迹中强烈反应并且用重组SPlA进行的免疫在猪和小鼠中激发显著的体液抗体反应，证实了 SPlA是高度免疫原性的(见，实施例5)。
[0109]根据第二个实施方案，本发明涉及另一种分离的猪链球菌多肽，即所谓SP2，其有利地激发动物中的保护性反应。
[0110]具体地，本发明的第二个实施方案的分离的多肽包含与在SEQ ID NO: 11中提出的序列，或其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0111]当指氨基酸序列时，“基本上相同”可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NOS1-4和11中所示的序列的部分或全部具有至少75%同源性，或甚至优选地85%同源性，或甚至更优选地95%同源性。
[0112]在该背景下的“同源性”意味着还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P (基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。[0113]本发明还涉及编码本发明的优选的SPl或优选的SP2多肽的分离的多核苷酸。优选地，当指SPl和SEQ ID N012时，当指SP2和它们的各个功能片段时，本发明的分离的多核苷酸包含与SEQ ID N0S5-7显不的序列基本上相同的核苷酸序列。
[0114]当指核酸序列时，所谓“基本上相同”要理解的是本发明的多核苷酸优选地具有这样的核酸序列，其与SEQ ID N0S5-7和12或其功能片段的部分或全部具有至少65%相同，更特别地80%相同和甚至更特别地95%相同。
[0115]如本文一般理解和使用，“功能性片段”指编码与完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。换言之，在本发明的上下文中，其优选地指基本上保留了编码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白质当施用于动物时，激发针对猪链球菌菌株攻击的免疫应答，和更优选地保护性反应。例如，这样的片段是在SEQ ID N08中显示的多核苷酸，其编码如上定义的SPlA多肽。
[0116]在另一个实施方案中，本发明还涉及载体(例如，克隆的或表达载体)，其包含本发明的如上定义的多核苷酸。
[0117]用于本文时，术语“载体”涉及被设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体可以是，例如“克隆载体”，其被设计用于分离，增殖和复制插入的核苷酸，“表达载体”，其被设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列，或“病毒载体”，其被设计用于生产重组病毒或病毒样颗粒，或“穿梭载体”，其包含不只一种类型的载体的性质。
[0118]公众可获得适合于稳定转染细胞和细菌的许多载体(例如，质粒，腺病毒，杆状病毒，酵母杆状病毒，植物病毒，腺伴随病毒，反转录病毒，单纯疱疹病毒，α病毒，慢病毒)，还可以获得构建这样的细胞系的方法。要理解的是，本发明包括包含本发明的任何多核苷酸分子的任何类型的载体。
[0119]2.抗体`
[0120]在另一个实施方案中，本发明的特征是特异性结合本发明的多肽的抗体。更具体地，所述抗体是特异性结合于如上定义的优选猪链球菌多肽的纯化的多克隆或单克隆抗体。
[0121]本发明的抗体可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行制备。例如，本发明的多肽可以施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。备选地，如上所述，如本文所述使用的抗体可以是单克隆抗体，其使用已知的杂交瘤技术进行制备(见，例如Ha_erling等，在 Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (单克隆抗体和 T 细胞杂交瘤)中，Elsevier, NY, 1981; Charland, N., M.Jacques, S.1acouture 和 M.Gottschalk.1997.Characterization and protective activity of a monoclonal antibody against acapsular epitope shared by Streptococcus suis 血清型 1，2andl/2 (针对猪链球菌血清型1，2和1/2共享的荚膜表型的单克隆抗体的特征和保护活性).Microbiology (微生物学)143(Ptll):3607-14)。
[0122]关于本发明的抗体，术语“特异性结合于”指以相对较高亲和性与本发明的SPl或SP2多肽的一个或多个表位结合的抗体，但是其未基本识别并且结合除了本发明的SPl或SP2多肽的分子。如本文所用，术语“相对较高的亲和性”意味着在抗体和SPl或SP2多肽之间的结合亲和性为至少IO6M'和优选地至少约IO7M'和甚至更优选地IO8M4到IOwM'优选地，在对于是本领域技术人员公知常识的标准的竞争结合免疫测定条件下进行这样的亲和性的确定。
[0123]3.治疗的方法和组合物
[0124]可以以许多方式，将SPl和SP2多肽，编码其的多核苷酸和本发明的抗体用于治疗和/或预防猪链球菌相关疾病或由猪链球菌导致的感染。
[0125] 例如，按照本发明的一方面，可以将本发明的SPl和/或SP2多肽用作免疫原，以生产用于治疗和/或预防猪链球菌感染的特异性抗体。适合的抗体可以使用适合的筛选方法进行确定，例如通过测量特异性抗体在测试模型中被动保护猪链球菌感染的能力。动物模型的实例是在本文的实施例中所述的小鼠和猪模型。
[0126]按照另一个方面，编码本发明的多肽的多核苷酸或其衍生物可以用于DNA免疫方法。即，它们可以结合到载体中，所述载体在注射后可以复制并且可以表达由此体内生产抗原性多肽。例如，多核苷酸可以结合到在CMV启动子控制下的质粒载体中，其在真核细胞中发挥功能。优选地，所述载体通过肌内注射。
[0127]本发明的多核苷酸在遗传免疫中的应用优选地使用适合的递送的方法或系统如直接将质粒DNA注射到肌肉中[Wolf等.H M G (1992) 1:363，Turnes等,Vaccine(疫苗)(1999), 17:2089, Le 等,Vaccine(疫苗)(2000) 18:1893, Alves等，Vaccine (疫苗)(2001) 19:788]，与或不与佐剂一起注射质粒DNA [Ulmer等,Vaccine (疫苗)(1999) 18:18, MacLaughlin 等,J.Control Release (控制释放杂志)(1998) 56:259，Hartikka 等，Gene Ther(基因治疗).(2000) 7:1171-82，Benvenisty 和Reshef, PNAS USA (1986) 83:9551，Singh 等，PNAS USA (2000) 97:811],通过递送与特异性载体复合的DNA靶向细胞[Wa等，J Biol Chem(生物化学杂志)(1989) 264:16985，Chaplin等，Infect.1mmun.(感染免疫学)(1999)67:6434],注射复合或包封在各种形式的脂质体中的质粒[Ishii 等，AIDS Research and Human Retroviruses (AIDS 研究和人逆转录病毒)(1997) 13:142，Perrie 等，Vaccine (疫苗)(2001) 19:3301],用不同的轰击方法施用 DNA[Tang 等，Nature (1992) 356:152，Eisenbraun 等，DNA Cell Biol (DNA细胞生物学)(1993) 12:791, Chen 等，Vaccine(疫苗)(2001) 19:2908],和用活的载体施用 DNA[Tubulekas 等,Gene (基因)(1997) 190:191, Pushko 等,Virology (病毒学)(I"7)239:389, Spreng 等 FEMS (2OOO) 27:2"，Dietrich 等，Vaccine (疫苗)(2001)19:2506]。
[0128]本发明的另一个方面是使用针对本发明的多肽的抗体进行被动免疫。可以使用本申请中所述的抗体。
[0129]在这个方面，本发明的另一个实施方案涉及用于预防或治疗这样的疾病或感染的组合物。本发明的组合物有利地包含可接受的载体和本发明的SPl和/或SP2多肽。备选地，本发明的组合物可以包含本发明的抗体和/或多核苷酸和/或表达载体。
[0130]在一个优选的实施方案中，本发明的组合物还包含佐剂。用于本文时，术语"佐剂"指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。佐剂怎样发挥功能的机制尚不完全清楚。据信，一些佐剂通过缓慢释放抗原增加免疫应答(体液和/或细胞应答)，而其它的佐剂本身是强免疫原性的并且据信它们协同发挥功能。已知的佐剂包括，但不限于:油和水乳状液(例如，完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)，Corytzebacte1-1um parvuin,
Quil A，细胞因子如IL12，Eimilsigen-Phis?,卡介苗，氢氧化铝，葡聚糖，硫酸葡聚糖，氧化铁，藻酸钠，Bacto佐剂，某些合成聚合物如聚氨基酸和氨基酸的共聚物，皂草苷，石蜡油，和胞壁酰二肽。佐剂还包括遗传佐剂如在共接种的DNA中编码的免疫调控分子或作为CpG寡核苷酸。共接种的DNA可以在相同的质粒构建体中如质粒免疫原或在单独的DNA载体中。
[0131]本发明的另一个实施方案是提供治疗和/或预防动物中猪链球菌相关疾病或感染的方法。本发明的方法包含向动物施用根据本发明的组合物的步骤。
[0132]可以将其它的试剂加入本发明的组合物。例如，本发明的组合物还可以包含试剂如药物，免疫刺激剂(如α-干扰素，β-干扰素，Y-干扰素，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2 (IL2))，抗氧化剂，表面活性剂，着色剂，挥发性油，缓冲剂，分散剂，推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所意欲成分的治疗有效量是容许其在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需的量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0133]可以通过各种给药途径向动物给药本发明的组合物。例如，所述组合物可以以无菌可注射制剂形式进行施用，如无菌可注射的水性或油性混悬液。这些混悬液可以使用适合的分散剂或湿润剂和悬浮剂根据本领域已知的技术进行配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液。它们可以通过肠胃外给药，例如通过静脉内，肌内或皮下，通过注射，通过输注或口服的方式。适合的剂量将根据因素如组合物中每种成分的量，需要的效果(短或长期)，施用的途径，待治疗的动物的年龄和体重而变化。可以使用本领域公知的任何其它方式来施用本发明的组合物。
[0134]4.检测或诊断方法和试剂盒
[0135]还可以以不同方式 将本发明的SPl和/或SP2多肽，编码其的多核苷酸和抗体用于检测和诊断猪链球菌相关疾病或由猪链球菌引起的感染。
[0136]在该方面和在另一个实施方案中，本发明提供检测样品中猪链球菌菌株的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步骤:
[0137]a)在足以形成复合物的的条件下，将所述样品与如上定义的抗体接触一段时间；和
[0138]b)检测在a)中形成的复合物的存在或不存在。
[0139]用于本文时，术语〃样品〃指获自动物的各种样品类型并且可以用于诊断或检测测试。该定义还包括生物起源的血液和其它液体样品，固体组织样品如活组织检查样品或组织培养物或来自其中的细胞。
[0140]在另一个实施方案中，本发明提供检测样品中针对猪链球菌菌株产生的抗体的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步骤:
[0141]a)在足以形成免疫复合物的条件下，将所述样品与如上定义的多肽接触一段时间；和
[0142]b)检测在a)中形成的免疫复合物的存在或不存在。
[0143]本领域技术人员将认识到该诊断测试可以采取多种形式，包括免疫测试如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射性免疫测定，以基本确定特异于蛋白质(如SPl和/或SP2)的抗体是否在生物中存在。[0144]本发明还提供用在任何上述诊断方法中的试剂盒。这些试剂盒典型地包含两种或多种进行诊断测试所需要的成分。成分可以是化合物，试剂，容器和/或设备。例如，在试剂盒中的一个容器可以包含特异性结合于本发明的SPl或SP2多肽的抗体或其片段。一种或多种另外的容器还包括组分，如用在所述测试中的试剂或缓冲剂。
[0145]在该方面，本发明还提供用于检测指示猪链球菌菌株的抗体的存在或不存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包括:
[0146]-根据本发明的SPl和/或SP2多肽；
[0147]-检测多肽-抗体免疫复合物的试剂；
[0148]-缺乏与所述肽免疫性结合的抗体的生物参比样品；和
[0149]-包含可以特异性结合于所述肽的抗体的比较样品；
[0150]其中所述多肽，试剂，生物参比样品，和比较样品以足以进行所述检测的量存在。
[0151]优选地意欲的另一种诊断试剂盒是用于检测指示猪链球菌菌株的存在或不存在的试剂盒，其包括:
[0152]-根据本发明的抗体；
[0153]-检测多肽-抗体免疫复合物的试剂；
[0154]-与所述抗体免疫结合的生物参比样品多肽；和
[0155]-包含可以与所述肽特异`性结合的多肽的比较样品；
[0156]其中所述抗体，试剂，生物参比样品，和比较样品以足以进行所述检测的量存在。实施例
[0157]参考下面的实施例，本发明将更容易理解。这些实施例举例说明本发明的广泛的应用性并且不倾向于限制其范围。可以在不背离本发明的精神和范围的前提下对其进行各种修饰和改进。尽管与本文所述的那些相似或等价的任何方法和材料可以用在实施本发明的测试中，在下面描述的是优选的方法和材料。
[0158]实施例1
[0159]鉴定猪链球菌的表面蛋白并评价其在猪中的免疫原性和保护能力
[0160]鉴定一种新的猪链球菌表面蛋白，其与来自被2型猪链球菌临床感染猪的恢复期血清反应。命名为SPl的表观分子量为IlOkDa的蛋白质显示革兰氏阳性细菌的膜锚定表面蛋白的典型特征如信号序列和LPVTG膜锚定基序。此外，检测到经常发现于植物病原体的保守的无毒结构域。使用SPl特异性的抗血清进行电镜显微检查证实SPl蛋白在猪链球菌上的表面定位。SPl特异性抗体在免疫印迹中与大多数猪链球菌血清型和2型分离株的细胞裂解物反应，证实了其在猪链球菌物种中的高度保守性。用重组SPl通过肌内途径免疫小猪激发了显著量的总免疫球蛋白G(IgG)抗体反应。然而，抗体反应没有被反映在猪的保护中，所述猪用致病力强的菌株以我们常规的接种模型进行气管内攻击。
[0161]材料和方法
[0162]细菌菌株，噬菌体，质粒和培养基。将2型血清型猪链球菌的参比菌株S735用于基因组文库构建。将33种血清型(1-31，33和1/2型)的参比菌株，来自不同来源的2型血清型的26种菌株以及5种野生(field)其它的革兰氏阳性生物列于表1中。噬菌体λ ZapII 和大肠杆菌(Escherichia coli)XLl-Blue MRF菌株获自商业来源(Stratagene, LaJolla, Calif.)。将猪链球菌在37°C，5%C02下，培养在Todd-Hewitt链球菌肉汤培养基(THB, Difco,底特律，密歇根州.)或琼脂培养平板(Quelab实验室，蒙特利尔，加拿大)上，而将其它的革兰氏阳性细菌如ATCC目录推荐进行培养。将大肠杆菌在单独的LB培养基中或补充了 2g麦芽糖/升的LB培养基中，在37°C进行培养。如果适合，将大肠杆菌在50 μ g氨苄青霉素/ml和0.8mM异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)存在下进行培养。将pMal?_p载体(新英格兰生物实验室(New England BioLabs))用于生产MBP-SP1融合蛋白。
[0163]抗血清从临床感染了 2型猪链球菌菌株S735的猪中收集了恢复期猪血清。通过用230μ g以0.5ml的弗氏不完全佐剂乳化的纯化的SPl静脉内免疫的新西兰白兔获得单特异性抗-SPl血清。所述兔以相同剂量的SP1，以2周间隔接受了两次强化注射，并接着在最后一次强化免疫后10天采血。在_20°C贮存血清直到使用。
[0164]spl基因的鉴定，克隆和测序.如以前所述(33)分离猪链球菌S735菌株的染色体DNA。用限制性酶EcoRI部分消化纯化的染色体DNA，并将得到的片段在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶中提取6-10kb大小的片段并与λ ZapII载体的EcoRI臂连接，使用Gigapack II包装提取物(Stratagene)将载体进行包壳作用。将重组曬菌体用于感染大肠杆菌XLl-Blue MRF’，接着将所述大肠杆菌接种到LB琼脂上。将得到的噬菌斑转移到硝化纤维素膜上(Bio-Rad, Mississauga, Ontario,加拿大)。使用具有2%脱脂乳的Tris-盐水缓冲液(TBS)封闭膜并用来自猪链球菌2型血清型感染的恢复期猪血清，过氧化物酶缀合的兔抗猪免疫球蛋白G(IgG)抗血清(Jackson免疫研究实验室公司，West Grove, Pa.)和邻苯二胺顺序温育。将阳性曬菌斑纯化到均质。用ExAssist辅助曬菌体(Stratagene)Jg据生产商的说明书切除重组的PBluescript质粒。使用T3和T7启动子作为引物，在DNA测序仪器，Maine大学(Orono，ME，USA)中确定插入物的序列。使用网上可获得的程序分析核苷酸和从开发阅读框(ORFs)推导的氨基酸序列。
[0165]将编码成熟SPl的 序列从菌株S735的纯化的染色体DNA通过PCR引物Pl [0166](5，-ATGGATCCATTGAAGGCCGCTCGGCACAAGAAGTAAAA-3’ ;
[0167]SEQ ID NO 13)
[0168]和P2 (5，-CCAAGTCGACTTATAATTTACGTTTACGTGTA-3’ ; SEQ ID NO 14)进行扩增，所述引物分别包含BamHI和Sal I限制性位点。如下进行PCR:在94°C 5分钟，随后进行30个循环的在94°C I分钟，560C 30秒和在72°C I分钟。将得到的PCR片段克隆到pMAL-p表达载体的Bam HI和Sal I位点。将包含spl基因的重组质粒命名为p0RF3。
[0169]重组SPl蛋白的表达和纯化通过用Genepulse II仪器(Bio-Rad),按照生产商的推荐进行电穿孔，将纯化的质粒P0RF3用于转化大肠杆菌XLl-Blue菌株。将该重组菌株培养在加入2g葡萄糖/L和50 μ g氨苄青霉素/ml的LB培养基中。对于过度表达，将培养物从其起始0D_被调整为0.1的过夜培养物进行接种。将培养物进行温育，伴随搅拌直到OD600为约0.8，并接着加入IPTG以诱导生产MBP-SPl融合蛋白。2小时的诱导后，在细菌周质以及细胞质中发现融合蛋白。确定使用细菌裂解物的提取物来纯化SPl蛋白。
[0170]使用直链的淀粉树脂(新英格兰生物实验室)，按照生产商的说明书，通过亲和层析法纯化融合蛋白。将大肠杆菌细胞沉淀物悬浮在亲和性柱结合缓冲液(20mMTris-HCl, 50mM NaCl, pH7.4)中并使用弗氏细胞压碎器(SLM仪器公司)裂解细胞。在用0.45 μ m膜过滤后，将上清液经过直链淀粉树脂。用在结合缓冲液中的1%麦芽糖洗脱MBP-SPl融合蛋白，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定包含蛋白质的级分。将纯化的融合蛋白用蛋白酶因子Xa(新英格兰生物实验室)，以20 μ g/mg蛋白质的浓度进行裂解,并将其应用到mono-Q柱上(阿莫仙药物生物技术(AmershamPharmacia Biotech), Baie d’ Urfee,加拿大)。通过使用线性 NaCl 梯度(在 20mMTris-HCl, pH7.4中的0_0.4M NaCl)将无MBP载体的重组SPl从柱上洗脱。将包含SPl-的级分进行合并并针对PBS缓冲液进行透析。通过SDS-PAGE评估重组SPl的纯度，并通过Bradford蛋白质测定(Bio-Rad),根据生产商的说明书来确定蛋白质的浓度。
[0171]SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹。如Laemmli (21)所述进行SDS-PAGE。在10%丙烯酰胺凝胶上分离总的细胞提取物或纯化的蛋白，并接着用考马斯亮蓝R250(希格玛(Sigma), St.Louis, Mo)对凝胶进行染色。将预染色的低分子量标记物(Bio-Rad)用于确定蛋白质的表观分子量。备选地，基本上如Burnette (5)所述进行被转移到硝化纤维素膜上的蛋白质的蛋白质印迹。
[0172]免疫电镜术.将猪链球菌S735菌株在5ml的THB上培养过夜，离心并重悬在500 μ I的PBS (ρΗ8.0)中。将20 μ I的细菌混悬液置于镍-透明载网(INRS，InstitutArmand Frappier,拉瓦勒，加拿大)上并容许部分风干。用在稀释缓冲液(PBS_1%牛白蛋白-1%吐温20，pH8.0)中的10%正常驴血清封闭30分钟后，将所述载网在室温浸没在50 μ I的在稀释缓冲液中稀释1/25的SPl -特异性兔血清或对照兔抗-MBP血清(新英格兰生物实验室(New England BioLabs))中达2小时。将载网在PBS_1%吐温20中洗涤3次并接着将其转移到在稀释缓冲液中稀释1/30的50 μ I的12nm胶体金-亲和纯的驴抗兔-1gG(Jackson 免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories))中，并在室温温育I小时。用PBS-1%吐温20洗涤3次，并用蒸馏水洗涤一次后，将细菌用1%磷钨酸染色并用电子显微镜(菲利普(Philips)201)以60kV的加速电压进行检查。
[0173]免疫和保护研究。`在VIDO(萨斯卡通，加拿大)，根据加拿大动物管理委员会(Canadian Council on Animal Care)的“实验动物管理和使用的指南”中提出的原则，使用由动物管理大学委员会(University Committee on Animal Care) (37)批准的方法,将猪用于进行免疫和保护测试。将来自畜群的平均重量8.23kg的无2型血清型猪链球菌的3周龄小猪随机分为两组，每组8只。以3周的间隔，用Iml的与30%的Emulsigen-Plus (MVP实验室，Ralston, Nebr.)佐剂混合的100 μ g纯化的SPI或作为对照的在生理盐水中的30%Emulsigen-Plus,以3周间隔对猪进行肌内注射2次。第二次注射后11天,通过Iml (4.6x106CFU)的猪链球菌致病力强的菌株166的对数期培养物的气雾剂攻击免疫的和对照动物。所述菌株166已经被证实是高度致病的(3)。在每次注射前，攻击和实验结束时收集血液样品来确定抗体反应。在攻击后10天，每天监测猪的临床体征，体温和死亡率。通过尸体检查研究所有的猪的宏观病理学，并培养血液以监测猪链球菌菌血症的存在。
[0174]ELISA.通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定免疫的小猪的血清SPl -特异性总 IgG 和 IgG 同种型(IgGl 和 IgG2)。在 4°C,将 Polysorb 板(Nunc-1mmunoplates，罗彻斯特，纽约，美国)用100 μ I/孔的纯化的重组SPl，以在碳酸盐缓冲液中0.3 μ g/ml的浓度包被过夜。用包含0.05%吐温20的PBS (PBST)洗涤三次后，将板用在PBST中的5%的脱脂乳，于37°C进行封闭I小时。为了测定总的IgG，将来自对照和接种疫苗组的猪血清在PBST中稀释1/5000并以100 μ I/孔，一式二份地加入适合的孔中。在37°C温育I小时并洗涤3次后，通过在37 °C，用过氧化物酶缀合的山羊抗猪IgG(H+L)抗血清(Jackson免疫研究实验室(Jackson Immuno Research Laboratories))温育I小时来检测结合的抗体。对于IgGl和IgG2检测，将来自接种疫苗组的1/500稀释的猪血清以100 μ I/孔加入。将小鼠抗猪IgGl或IgG2(Serotec, Kidlington,牛津，英国)用作一抗，并将过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠 IgG(H+L) (Serotec)用作二抗。用 TMB 底物(Zymed, S.San Francisco,美国)显影所述板。在450nm，在ELISA阅读器(Power Wave340，Bio-Tek仪器公司)上测量吸光度。将结果表示为平均值土S.D。用斯氏t检验确定统计学显著性。
[0175] 核苷酸序列登记号将编码猪链球菌的SPl蛋白的基因的序列显示在图2中并确定其 GenBank 登记号为 AY864331。
[0176]结果
[0177]鉴定spl基因。猪链球菌染色体文库用入2々?11，从猪链球菌3735菌株进行构建，并使用来自猪链球菌2型血清型感染动物的恢复期猪血清进行筛选。选择这样的一个克隆进行进一步的表征，所述克隆表达具有表观分子量(MW)IlOkDa的蛋白质，其对恢复期猪血清具有强烈反应性。将命名为PSS735的重组pBluescript质粒从噬菌体臂上切下，并将其示意性结构表示于图1中。PSS735的6057-bp插入物的DNA序列分析显示四个0RF。该基因簇见于具有相同结构的猪链球菌加拿大菌株89/1591 (NZ_AAFA00000000)和欧洲菌株P1/7(NC_004549)的部分测序的基因组中。ORFl和0RF2的推导的氨基酸序列显示与糖基转移酶具有50-80%范围的同一性，0RF4的推导的氨基酸序列显示与来自许多细菌种类的代谢物控制蛋白A具有50-75%范围的同一性，所述许多细菌大多数属于链球菌属(Streptococcus)。0RF3编码被命名为SPl的670个氨基酸的蛋白，具有预期的pI6.0和计算的分子量74.8kDa。将SPl的氨基酸序列与在可获得的数据库中的那些进行比较揭示与其它的蛋白没有显著的同源性。在pMal-p载体中的spl序列的亚克隆分析揭示SPl与恢复期猪血清强烈反应，证实SPl是免疫原性蛋白质。
[0178]SPl是新的猪链球菌C端锚定表面蛋白.2010bp的spl基因以ATG密码子起始，以TAA密码子终止，推定的SD序列(GAAAGGA)在所述ATG密码子前，其位于起始密码子上游IObp处(图2)。预期的SPl氨基酸序列的分析揭示在N端的15个氨基酸的疏水核心和在Ala29和Gln3tl之间的推定的信号肽酶裂解位点。在蛋白质的羧基半部分中检测到以3个氨基酸残基间隔区分隔的具有强共有模式的27个氨基酸序列的10个重复序列。紧接重复区域的C端的是细胞壁相关区域，其跨越49个氨基酸残基并且特征是高百分比的苏氨酸残基(20.4%)。紧随这种富含苏氨酸的区域之后的是许多革兰氏阳性细菌的膜锚定表面蛋白典型的LPVTG共有基序。从膜锚定基序的C端4个氨基酸开始，鉴定了 16个氨基酸的第二疏水片段，其后是在蛋白质的C端末端的四个带正电荷的氨基酸残基(图2)。
[0179]分析氨基酸组成揭示在Glu272和Thr63°之间不存在芳香族残基的区域，其跨越所有的重复序列。此外，使用BLAST的保守结构域检索鉴定了在Lys319到Val6tl1区域中的无毒结构域，其显示与来自植物病原体水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)的AvrXa7无毒因子(41)具有20%同一性的相似性(图3)。如果考虑保守的氨基酸替换，相似性为48%。
[0180]生产重组SPl.通过PCR扩增编码成熟SPl蛋白质的序列并将其连接到IPTG-诱导的pMAL-p载体中。将得到的重组质粒在大肠杆菌XLl-Blue菌株中进行表达。如在图4A中所显示,诱导具有malE-spl融合基因的大肠杆菌重组体导致约150kDa的MBP-SPl融合蛋白的表达(泳道2)，其在非诱导的大肠杆菌细胞中不存在(泳道I)。所述融合蛋白大部分见于大肠杆菌细胞的细胞质(泳道3)。令人感兴趣的是，完全将其中缺失特征是不存在芳香族残基替换的重复区域的截短的MBP-SPl融合蛋白转移到周质空间(数据未显示)，说明该区域在某种程度上干扰MBP定位。
[0181]通过使用亲和性基质直链淀粉柱并用麦芽糖洗脱来纯化融合蛋白，并在SDS-PAGE上显示约150kDa的单一蛋白质条带(泳道4)。将纯化的融合蛋白用因子Xa进行蛋白水解裂解，产生表观分子量IlOkDa的成熟SPl和预期45kDa的MBP标记物(泳道5)。通过随后用离子交换层析法纯化，来获得无MBP的成熟SPl，其纯度通过SDS-PAGE估计为>95% (泳道6)。MBP-SPl融合蛋白和纯化的重组SPl都在蛋白质印迹中显示与用于起始筛选基因组文库的恢复期猪血清的特异性反应性(图4B)。通过N端蛋白质测序证实了纯化的SPl的身份。用Bradford蛋白质测定法测量蛋白质浓度并将其调整为lmg/ml。
[0182]在猪链球菌中SPl的细胞表面表达。为了证实SPl在猪链球菌细胞表面上的定位，通过使用单特异性多克隆抗-SPl抗体，R44进行免疫电镜术。发现免疫金颗粒均匀分布在猪链球菌S735菌株的表面上。这说明SPl蛋白在细胞表面上均质表达。将兔抗-MBP血清用作对照并且没有显示任何标记(图5)。
[0183]在猪链球菌中的SPl的分布
[0184]为了评价SPl在猪链球菌不同血清型的参比菌株和2型血清型野生菌株中的保守性，将细菌的全细胞制备物进行蛋白质印迹，并通过SP-特异性抗体R44检测。如在表1中所显示，除了血清型13，16，20，22和24的菌株，R44与其它28种猪链球菌血清型反应，而来自不同地理起源的26个测试的2型分离株的25个与R44抗体反应。将来自其它链球菌物种的5个菌株用于证实SPl的 特异性并且没有检测到SPl蛋白。
[0185]SPl的免疫原性和针对用猪链球菌的攻击对猪的保护。将每组8只小猪用以佐剂乳化的100 μ g的纯化的重组SPl或仅有佐剂通过肌内免疫2次。用SPl免疫猪引发抗原特异性反应(图6A)。从对照动物和免疫前的动物获得的相应血清的分析清楚地显示没有SPl特异性抗体，因为仅记录了背景ELISA值。仅在第一次注射后2周，SPl激发了明显的IgG反应，其明显地由强化免疫强化。评估IgG同种型证实了来自免疫的猪的血清包含IgGl和IgG2抗体(图6B)。然而，IgGl反应比IgG2占优势，说明用SPl进行的接种主要诱导Th2-样的免疫应答。用猪链球菌166菌株进行的猪的气雾剂攻击导致从攻击后的第2天开始的临床评分的稳定增加并且接种疫苗没有明显的效果。如在表2中所总结，尽管与对照组相比，在接种疫苗组中更少的猪遭受关节炎，两个组都显示在攻击后相似的症状。来自每组的三只猪死亡或在实验结束前，由于高临床评分被安乐死。在所有死亡的猪中发现猪链球菌菌血症并且在存活的猪中没有检测到。
[0186]讨论
[0187]猪的第一次免疫激发快速的SPl特异性体液抗体反应，其可以明显地用随后的注射强化。然而，针对SPl的抗体没有赋予针对使用猪链球菌菌株166的异型攻击的免疫性。在抗体反应和保护之间的这种差异已经在革兰氏阳性细菌中的一些其它的表面抗原中报道，如链球菌纤连蛋白结合蛋白(Sfbl) (26)，肺炎球菌表面蛋白A(PspA) (27)，B组多糖(25)和马链球菌(Streptocococcus equi)的M样蛋白(SeM) (34)。为什么针对SPl的抗体没有针对猪链球菌166攻击的保护性的原因尚不清楚。在噬菌细胞杀死研究中，来自SPl免疫的猪的合并的血清的存在没有促进猪嗜中性粒细胞杀死猪链球菌，说明抗体缺乏调理吞曬细胞(opsonophagocytic)的功能。主要由卩遼菌作用介导宿主针对由猪链球菌,一种高度被有荚膜的微生物导致的感染的保护(32)。因此，在 申请人:的常规接种疫苗模型中产生的总的IgG水平可能不足以反映能够引发白细胞效应子功能的保护性抗体的存在。为了进一步举例说明由SPl引发的免疫应答类型，评估在免疫的血清中的IgG同种型。IgGl水平一直高于IgG2水平，说明诱导了 Th2-样反应。尽管"Thl/Th2"平衡的概念尚没有像在一些其它物种中一样，在猪中有充分文献记载，最近的证据显示猪IgG2比IgGl具有更大的补体激活能力(6)。
[0188]在该研究中，将Emulsigen-Plus用作佐剂，因为据信其能够在接种位点产生抗原长效制剂，从所述抗原长效制剂抗原缓慢释放并且因此提供延长的对免疫系统的刺激(23，37)。然而,最近的证据显示与单独的Emulsigen —起配制的疫苗主要引发IgGl反应’而Thl类型的免疫应答非常弱(19，28)。来自使用其它革兰氏阳性细菌的表面抗原进行的接种疫苗的证据已经证实调理吞噬细胞的效率可以通过使用Thl定向的佐剂，如CpG和白介素-12(IL-12)而大大增强(4，22，24)。这些佐剂促进Thl-型免疫应答，其特征在于调理抗体，特别是IgG2同种型的增加的产生。此外，增加的抗体介导的调理作用明显地反映在保护中(2,40)。
[0189]总而言之，SPl是一种猪链球菌新的C端锚定表面蛋白质，如通过分析分子特征和电镜所证实的。在小猪中，用重组SPl接种疫苗激发显著的体液抗体应答，以及恢复期猪血清存在高滴度的针对该蛋白的抗体的事实，说明SPl是猪链球菌的暴露的抗原。与其在不同猪链球菌的血清型中的广泛分布综合考虑，这些发现使SPl成为在开发亚单位疫苗中考虑的候选物。SPl作为疫苗候选物的可能性将在下面的实施例中得到证实。
[0190]实施例2`
[0191]重组SPl保护小鼠免于猪链球菌攻击的感染
[0192]该研究评估SPl重组蛋白作为亚单位疫苗候选物在具有修饰的免疫途径和佐剂的小鼠模型中是否具有保护性。
[0193]实验方法:
[0194]将小鼠(CDl)随机分成两组，每组10只，并且用20 μ g的与作为佐剂的20 μ g QuilA混合的纯化的SPl或仅作为对照的20 μ g Quil A,以2周间隔皮下免疫两次(表1)。第二次接种后的10天，将动物用IxlO8CFU猪链球菌致病力强的菌株(31533)进行1.p.攻击。每天监测小鼠2次，监测其临床体征和死亡率直到感染后的第14天。在每次接种疫苗和攻击前收集血液样品来测定抗体反应。
[0195]结果:在初始免疫后，用SPl接种疫苗激发小鼠中的显著的体液IgG反应(平均滴度3xl04)，并且强化注射明显增加抗体滴度(1.SxlO6)。与此相反，在对照组的血清中的SPl-特异性的IgG在不可检测的水平(图1)。此外，所有的四个IgG亚类在SPl -免疫的小鼠中得到诱导，其中IgG2a滴度是最高的(1.75xl06)，其次是IgGl (1.2xl06)，IgG2b(7.25x10s)和IgG3(3.7xl04)(图2)。SPl诱导的抗体的特异性通过蛋白质印迹得到证实，其中从SPl-免疫的小鼠收集的合并的血清可以识别猪链球菌S735和31533细胞制备物中纯化的SPl和SPl蛋白。
[0196]施用攻击感染后16小时，在对照组中的所有小鼠开始显示临床体征(败血症)，如皱褶的毛皮(显示发烧)，和对刺激反应缓慢。从攻击后第4天开始，在该组中的10只小鼠中的8只连续出现严重的中枢神经系统症状(脑膜炎)如转圈跑和角弓反张。所有的8只生病小鼠死亡，或由于严重的病症不得不安乐死。与此相反，在SPl接种的组中的10只小鼠中除了 6只具有短暂的临床体征如在攻击后16-40小时轻微毛躁的毛和勉强活动，在该组中的所有小鼠在观察阶段仍保持健康(图3和4)。
[0197]讨论和结论:在小鼠和猪模型中观察到的保护的差异通过在小鼠接种疫苗模型中激发的充分平衡的IgG亚类水平，尤其是非常高的IgG2a滴度进行解释。在鼠抗体同种型中，IgG2a显示在激活白细胞的调理吞噬细胞功能中是最有效的(2，42，43))。此外，猪链球菌，这种被有荚膜的细菌通过调理吞噬细胞作用被最有效地清除。因此，可能占优势的IgG2产生对观察到的保护贡献最大。但是，这些数据说明通过使用Thl诱导性佐剂如QuilA，用SPl免疫小鼠可以诱导有效的抗原特异性反应，并且保护小鼠免于致死剂量的致病力强的猪链球菌菌株的攻击感染，并导致完全的保护来免于猪链球菌引起的死亡(图4)。
[0198]实施例3
[0199]鉴定编码具有IgG-结合活性和保护能力的猪链球菌蛋白的新基因
[0200]在 申请人:持续的了解猪链球菌的病理机制和探索其可能用于开发可靠的诊断试剂或疫苗的可能性努力中，从猪链球菌2型血清型的致病力强的菌株中鉴定了一种显示IgG结合活性的新蛋白。这种被命名为SP2的表观分子量58-kDa的蛋白包含23个氨基酸的可裂解N端信号序列和靠近N端的赖氨酸M基序，以及在C端部分的每个13个氨基酸的6个相同的重复序列。SP2在不同的猪链球菌血清型中是高度保守的，如通过SP2基因的PCR扩增所证实的。重组SP2与从被2型猪链球菌临床感染的猪中收集的恢复期猪血清强烈反应。用纯化的重组SP2免疫小鼠激发显著的抗体反应，其赋予针对用致病力强的猪链球菌菌株引起的攻击感染的部分保护。
[0201]这些结果显示SP2是一种对于猪链球菌感染的可能的诊断剂和疫苗候选物。
[0202]实验方法和结果
[0203]鉴定SP2基因.通过筛选构建的2型血清型猪链球菌基因组文库鉴定阳性噬菌体，其通过非免疫机制与不同种类和类别的Ig (猪IgG，人IgG和IgA)反应。DNA插入物的序列揭示这样的6.3kb的插入物，其包含分别编码脱氢酶，SP2和葡聚糖糖苷酶(44)的三个ORFs(图12)。这种基因簇见于具有相同结构的猪链球菌加拿大菌株89/1591 (NZ_AAFA00000000)和欧洲菌株Pl/7 (NC_004549)的部分测序的基因组中。与一些链球菌蛋白质具有相似性的所述SP2氨基酸序列通常显示Ig结合活性。观察到与肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的保守假定的蛋白(AAL00677)在395个氨基酸的序列中的45%的同一性。与酿胺链球菌(Streptococcus pyogenes)的推定的42kDa蛋白(AAK33481)(在388个氨基酸序列中的45%的同一性)和与B组链球菌表面免疫原蛋白(AAG18474)(434个氨基酸序列中的40%的同一性)发现具有其它的同源性(60)。
[0204]SP2蛋白的表征
[0205]1158bp SP2基因编码386-aa SP2蛋白，其理论pi为4.40，分子量为42.5kDa。这种蛋白富含缬氨酸(15%)，谷氨酸(10%)和丙氨酸(9%)。 SP2的电荷分布分析揭示在N端存在一个带正电荷的簇(K2 - K26)，和在蛋白质中部存在一个带负电荷的簇(D168-E242)(图13)。带正电荷的簇随后是23个氨基酸的推定的信号序列。SP2的氨基酸序列在位置71-109包含LysM(赖氨酸)基序。这种LysM结构域见于涉及细菌细胞壁降解的许多酶中，并且具有通常的肽聚糖结合功能，说明SP2是猪链球菌的表面蛋白。因此，SP2的N端构造提出这样的可能性，即带正电荷的簇在细胞质中保留作为暂时的终止子(stop)的功能并且通过裂解信号序列辅助形成成熟SP2和通过结合LysM结构域到肽聚糖上辅助将SP2定位到细菌表面。此外，在SP2的中部鉴定13个氨基酸的6个相同的重复序列(图13)。
[0206]SP2基因在不同猪链球菌血清型中的分布
[0207]为了评价SP2的保守水平，使用覆盖全长SP2基因的引物进行PCR。如下进行PCR，其中在94°C起始变性5分钟，随后在94°C I分钟，在52°C I分钟，在72°C 2分钟，进行30个循环，最后在72°C延伸10分钟。
[0208]用于分布在不同血清型中SP2的正向和反向引物分别是:
[0209](5，-TTTAAAAGAACGGTTGAAGGC-3’ ;SEQ ID NO:15)
[0210]和5’-GCATAAGCTGCCACTTGATCT-3’ ;SEQ ID NO:16)。
[0211]从33个血清型参比菌株的31个中扩增了具有一些大小变化的SP2基因(图14)。选择的变体片段的序列分析显示SP2基因的重复序列的数量是大小变化的原因。
[0212]生产和纯化重组SP2
[0213]从猪链球菌S735染色体进行PCR来产生编码成熟SP2的基因，并将其亚克隆到pET32+载体(新英格兰生物实 验室(New England BioLabs))中。按照生产商的推荐,通过用Genepulse II仪器(Bio-Rad)进行电穿孔将所述构建体用于转化大肠杆菌DE3菌株。为了过度表达，培养物从其起始0D_被调整为0.1的过夜培养物进行接种。将培养物进行温育，伴随搅拌直到OD6tltl为约0.8，并接着加入IPTG (0.5mM)以诱导生产Trx-His-SP2融合蛋白。2小时的诱导后，制备细菌细胞质并将其用于纯化SP2蛋白。
[0214]通过使用Ni+柱(阿莫仙药物生物科技(Amersham Pharmacia Biotech), Baied’Urfee,加拿大)的亲和层析法从细胞质中纯化Trx_His_SP2融合蛋白。用0.45 μ m膜过滤细胞质并经过柱。用在结合缓冲液中的500mM咪唑洗脱融合蛋白并且通过SDS-PAGE确定包含蛋白质的级分。通过0.001%(w/w)的肠激酶(新英格兰生物实验室(New EnglandBioLabs))裂解纯化的融合蛋白，产生表观分子量58kDa SP2和预期20kDa Trx-His标记物(图15),接着将其应用到mono-Q柱上(阿莫仙药物生物科技(Amersham PharmaciaBiotech) ,Baie d' Urfee,加拿大)。通过使用线性NaCl梯度,从柱上洗脱获得无Trx-His标记物的重组SP2，估计其的纯度大于95%，如通过SDS-PAGE所观察到的(图15)。根据生产商的说明书，用Bio-Rad蛋白测试试剂盒(Bio-Rad)确定蛋白质浓度。通过N端蛋白质测序证实纯化的SP2的身份。
[0215]SP2是猪链球菌的免疫原性蛋白质并且显示IgG结合活性
[0216]通过用100 μ g的以0.5ml弗氏不完全佐剂乳化的重组SP2蛋白肌内免疫新西兰白兔产生SP2-特异性抗体。所述兔用相同剂量的SP2以2周间隔受到两次强化注射，并且接着在最后一次强化免疫后10天采血。在蛋白质印迹中，所述SP2特异性抗体相反地识别猪链球菌细胞制备物中的SP2 (图16a)。此外，重组SP2与恢复期猪血清反应(图16b)，证实抗-SP2抗体存在于被猪链球菌临床感染的猪血清中。[0217]重组SP2与人和猪IgG的结合活性在图16c和16d中得到证实。
[0218]重组SP2部分保护小鼠免于猪链球菌攻击感染。
[0219]将小鼠(CDl)随机分成两组，I组11只(接种组)，I组10只(对照组)，并且用50 μ g的与作为Thl诱导佐剂的20 μ g Quil A混合的纯化的SP2或仅作为对照的20 μ gQuil A，以2周间隔皮下免疫两次。第二次接种后的10天，将动物用IxlO8CFU猪链球菌致病力强的菌株(31533)进行1.p.攻击。每天监测小鼠2次，监测其临床体征和死亡率直到感染后的第14天。在每次接种疫苗和攻击前收集血液样品来测定抗体反应。
[0220]用SP2接种疫苗在小鼠中激发明显的体液IgG反应。与此相反，在对照组的血清中SP2-特异性IgG在不可检测的水平(图17)。两个组都显示败血症和脑膜炎的临床体征，然而，与对照组相比，SP2接种组的临床评分更高(图18)。在SP2接种组中，11只小鼠中的4只死亡或由于严重的疾病不得不被安乐死(存活率=64%)。与此相反，在对照组中的10只小鼠中有8只死亡(存活率=20%)(图19)。这些结果显示SP2保护小鼠免于猪链球菌攻击感染。
[0221]结论
[0222]SP2是一种新的描述的猪链球菌免疫原性蛋白，其与其它已知的序列相同性极少。恢复期猪血清显示针对该蛋白的抗体，证实SP2是在猪链球菌感染过程中表达的有效的抗原。这些发现，和其在不同猪链球菌血清型中的广泛分布使SP2成为开发诊断试剂时考虑的候选物。由于用重组SP2接种小鼠得到保护，因此清楚的是SP2是针对猪链球菌感染的有潜力的疫苗候选物。
[0223]实施例4`[0224]用实验性猪链球菌疫苗对小猪免疫的效果
[0225]该研究评估了重组Sao蛋白对小猪中猪链球菌2型血清型攻击感染的保护效果。
[0226]材料和方法
[0227]动物，指定治疗和排除标准:
[0228]使用来自无猪链球菌疾病畜群(H&M Fast Farms Inc.)而且以前没有针对猪链球菌接种过疫苗的总共24只的杂交小猪。将所述猪从出生就成群(at the herd of origin)饲养在商业条件下，直到它们在23.5天龄，平均重量为7.79kg时断奶。将猪以控制的温度(27-30°C )和通风条件下圈养在乙烯基覆盖的金属地板上，并通过乳头状饮水器给其提供水，使其自由取食商业制备的，营养均衡的，无抗生素的食物。在研究开始前，由兽医检查猪。所有的猪是健康的。断奶时，将小猪随机分成两组，体重均衡。
[0229]组1:在 ImL 盐水中的 200 μ g Sao 和 400 μ g Quil A
[0230]组2:在ImL盐水中的400 μ g Qui I A (对照)
[0231]将接受了不希望的治疗或患了不相关疾病的任何动物排除在分析之外。
[0232]接种疫苗和攻击:
[0233]所有的猪以2周间隔以ImlIM接种疫苗2次。在每次注射和攻击如收集血液样品。这些处理的结果没有导致任何不利事件。
[0234]第二次接种疫苗后的2周，用氟烷麻醉猪，并用Iml猪链球菌166的混悬液的气雾剂攻击猪。将来自对数期培养物的细菌培养在过滤灭菌的Todd-Hewitt酵母肉汤链球菌培养基中到OD62tl为0.8并在盐水(0.85%NaCl)中稀释1:100。随后测量施用给猪的细菌浓度是 6.8xl06CFU/mlo
[0235]临床观察
[0236]由兽医或经过训练的动物管理技术员每天一次地临床评估猪，并在攻击后10天的每天早晨指定临床评分的过程中测量其体温。每天的临床评分(0-4)作为对每只动物的姿势和运动性评分的总合，其基于神经、肌骨骼或呼吸系统疾病的体征进行如下:
[0237]姿势:
[0238]0=正常的姿势和对刺激反应
[0239]1=不活跃并且反应缓慢；眼鼻有分泌物
[0240]2=仅对重复的刺激有反应，情感淡漠
[0241]3=不活动，无反应，对环境没有意识
[0242]4=死亡
[0243]运动件:
[0244]0=正常步态和体位
[0245]1=轻微共济失调(slight in coordination),跋，和/或关节肿胀但是没有辅助可以站起
[0246]2=明显不协调或跛但 是没有辅助可以站起
[0247]3=严重的跛，严重的共济失调，不能保持站立
[0248]4=死亡
[0249]通过致死注射来安乐死其临床评分超过2的任一等级的猪。将直肠温度等于或大于40.6°C并且临床评分大于O的猪，以及死亡的那些猪记录为在当天有病态。将在第9天在实验结束前死亡或被安乐死的猪记录为死亡以评价治疗对死亡率的影响。关于动物进行判断，评估疾病的临床体征或进行实验室测定的所有个体对治疗的本身情况是不知情的。
[0250]血液(Haemotologic)情况:
[0251]通过静脉穿刺获得肝素处理的血液样品来进行猪链球菌菌血症的检测(通过在攻击后O和3天以及尸体解剖时培养)。
[0252]抗体滴度:
[0253]通过ELISA测定血清中的Sao-特异性总IgG和IgG亚类(IgGl和IgG2)的滴度。将背景扣除后导致0D450读数为0.1的血清稀释度认为是该血清的滴度。
[0254]尸体检查
[0255]将所有的猪进行尸体检查并且培养下列组织的细菌:小脑拭子，气管支气管淋巴结，关节拭子(如果病灶存在，受影响的关节；或后膝关节)，和血液。将复苏的猪链球菌细菌的数量以从0-4的顺序等级(大约是1gltl菌落数量)记录。此外，通过视觉检查评估肺涉及的程度(百分比)。
[0256]统计分析
[0257]使用列联表分析和似然比Fisher精确概率测试(Likelihood-Ratio FisherExact Test)确定两个组在指定数据(死亡率，在组织中猪链球菌的存在或不存在，生病的天数或健康的天数)之间的差异的显著性。在顺序数据(临床评分)上两组之间的差异的显著性通过等级评定转化并通过t-检验确定。通过使用对数等级(1grank)测试(等价于Mantel-Haenszel测试)进行存活分析来确定存活曲线中两组之间的差异的显著性。使用t-检验(如果需要，在适当的转化为标准值之后)确定在连续的数据(在攻击后存活的时间长短，体温，1g2CFUAil血液)上在组之间差异的显著性。
[0258]结果
[0259]排除的动物:
[0260]因为持续恶化的直肠脱垂，将一只猪在攻击后第5天人道处死。将该猪排除在分析之外。
[0261]临床观察:
[0262]1.对免疫的反应:没有可归因于接种的不寻常的反应。
[0263]2.体温:通过t_检验分析体温数据，显示在两组之间没有显著的差异(p>0.05)。通常，接种的猪倾向于具有更低的温度(图20)。
[0264]3.临床疾病:“临床评分”是对疾病的量的测量并结合死亡率和发病率。使用Mann-Whitney分析来比较两组的疫苗对临床评分的作用，并且在接种组中的临床疾病显著少于对照组的临床疾病(P=0.024)(图21)。
[0265]4.在猪链球菌攻击后猪的存活:存活率分别在接种组中是82%，而在对照组中是42%。使用两个数据组比较存活曲线，显示接种的猪的存活时间比对照的存活时间明显更长(ρ=0.048)(图 22)。
[0266]细菌学
[0267]1.菌血症:在攻击`前，在小猪的血液中没有检测到细菌(ND)。在攻击和尸体检查后，在两组之间菌血症猪没有明显不同。然而，接种的猪具有更少的菌血症(表3)。
[0268]2.感染尸体检查:进行来自被攻击的所有猪的脑，气管支气管淋巴结和关节的样品的微生物培养以监测感染的水平。将其中复苏具有攻击菌株的菌落典型形态特征的细菌的组织的数量显示在表4中。关于接种组对中位值细菌学评分(对于每只猪的所有组织的评分的总和的中位值)影响的Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon Rank Sum test),显示该差异是显者的(p=0.007) ο
[0269]病理学(尸体解剖)
[0270]仅在6只猪中(2只在接种组中并且4只在对照组中)检测到关节炎或肺炎的病理损害。其它的死亡或安乐死的猪没有显著的病理体征。猪链球菌感染的一个特征是急性感染可以是致死的，而没有可评估的显著的病理学体征。气管支气管淋巴结增大。在肠系膜上存在痕量的血纤蛋白，显示轻度的腹膜炎。在两个后膝关节中存在关节炎的迹象，其中存在少量的脓性物质，在左肩有关节炎的迹象，其中存在痕量的脓性流出物。
[0271]抗体反应
[0272]在初始免疫后，用Sao组合Quil A免疫猪激发显著的体液IgG反应，并且强化注射明显增加抗体滴度(图23)。此外，当诱导IgGl和IgG2亚类时，在第二次接种后2周，IgG2滴度比IgGl更占优势，如在血清中所测量的(图24)。
[0273]总结和讨论
[0274]显示所述疫苗是安全的，因为接种2次的猪没有显示任何有害的反应。用Sao组合Quil A免疫猪激发显著的IgG滴度，其中以IgG2产生占优势，说明其中主要是Thl-型免疫应答。猪的气雾剂攻击导致的疾病造成的总死亡率约是对照的58%。攻击后接种的猪的存活明显好于对照(p〈0.05)。攻击后每组中有一些猪开始生病，在接种的猪中病情明显更轻(更低的临床评分)。接种对总的尸体解剖检查的病理学的发生没有明显影响，然而急性链球菌败血病在没有可评估的总病理学体征的情况下也可以是致命的。在死后，与对照猪相比，从接种的猪中复苏了更少的猪链球菌细菌(p〈0.01)。
[0275] 实施例5
[0276]用片段SPlA免疫小鼠和小猪
[0277]免疫小鼠
[0278]使用弗氏不完全佐剂，用40 μ g的纯化的SPlA-麦芽糖-结合蛋白(MBP)融合蛋白，20 μ g的MBP或仅PBS将每组10只的三组小鼠通过腹膜内免疫2次(第I天和第17天)。在每次免疫前或第二次注射后10天获得血清，并将其1:5000稀释进行ELISA测定(见表5)。
[0279]免疫猪
[0280]使用Emulsigen作为佐剂，用200 μ g的纯化SP1A-MBP融合蛋白，100 μ g的MBP或仅PBS将每组3只猪的三个组通过肌内免疫2次(第I天和第17天)。在每次免疫前或第二次注射后10天获得血清，并将其1:5000稀释以进行ELISA测定(见表6)。
[0281]表1.由SPl -特异性抗体R44检测的SPl在猪链球菌参比菌株，2型血清型的分
离株和其它在蛋白质印迹中生物中的分布
[0282]
【权利要求】
1.一种能够激发IgG免疫应答的分离的SPl多肽，其包含与SEQ ID NO: 17或SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的SPl多肽，其包含与SEQID NO: 17所示的氨基酸序列具有至少.95%同一'丨生的氨基酸序列。
3.权利要求1的分离的SPl多肽，其包含与SEQID NO:4所示的氨基酸序列具有至少.95%同一'丨生的氨基酸序列。
4.权利要求1的分离的SPl多肽，其包含与SEQID NO: 17所示的氨基酸序列具有100%同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1的分离的SPl多肽，其包含与SEQID NO:4所示的氨基酸序列具有100%同一性的氨基酸序列。
6.一种能够激发IgG免疫应答的分离的SPl多肽，其包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有95%同一性的氨基酸序列。
7.权利要求6的分离的SPl多肽，其包含与SEQID NO: 2所示的氨基酸序列具有100%同一性的氨基酸序列。
8.—种能够激发IgG免疫应答的分离的SPl多肽，其包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有95%同一性的氨基酸序列。
9.权利要求8的分离的SPl多肽，其包含与SEQID NO: 3所示的氨基酸序列具有100%同一性的氨基酸序列。
10.权利要求1的分离的SPl多肽，其中当施用于动物时，其激发针对猪链球菌(Streptococcus suis)菌株攻击的保护性反应。
11.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1-10任一项所定义的多肽。
12.权利要求11的分离的多核苷酸，其包含与SEQID NO: 18所示的序列具有95%同一性的核苷酸序列。
13.权利要求11的分离的多核苷酸，其包含与SEQID NO:8所示序列具有95%同一性的核苷酸序列。
14.一种抗体，其特异性结合如权利要求1-10任一项所定义的多肽。
15.—种载体,其包含如权利要求11所定义的多核苷酸。
16.—种载体,其包含如权利要求12所定义的多核苷酸。
17.—种载体,其包含如权利要求13所定义的多核苷酸。
18.一种用于预防或治疗猪链球菌相关疾病或由猪链球菌导致的感染的组合物，其包含可接受的载体和下列的至少一种： 如权利要求ι-?ο任一项所定义的分离的多肽； 如权利要求11所定义的分离的多核苷酸； 如权利要求14所定义的抗体；或 如权利要求15、16或17所定义的载体。
19.权利要求18的组合物，其还包含佐剂。
20.下列至少一种用于制备药物的应用，所述药物用于在动物中治疗和/或预防猪链球菌相关疾病或感染： 如权利要求1-10任一项所定义的分离的多肽；如权利要求11所定义的分离的多核苷酸； 如权利要求14所定义的抗体； 如权利要求15、16或17所定义的载体；或 权利要求18或19所定义的组合物。
21.一种用于检测指示猪链球菌菌株的抗体的存在或不存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包括： -如权利要求1-10任一项所定义的分离的多肽； -检测多肽-抗体免疫复合物的试剂； -缺乏与所述肽免疫性结合的抗体的生物参比样品；和 -包含可以特异性结合于所述肽的抗体的比较样品； 其中所述分离的多肽、试剂、生物参比样品和比较样品以足以进行所述检测的量存在。
22.一种用于检测指示猪链球菌菌株的存在或不存在的诊断试剂盒，其包括： -如权利要求14所定义的抗体； -检测多肽-抗体免疫复合物的试剂； -与所述抗体免疫结合的生物参比样品多肽；和 -包含可以与所述肽特异性结合的多肽的比较样品； 其中所述抗体、试剂、生物参比样品和比较样品以足以进行所述检测的量存在。
【文档编号】C12N15/31GK103483431SQ201310291430
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2006年9月1日 优先权日:2005年9月2日
【发明者】乔斯·哈雷尔, 马塞洛·戈特沙尔克, 李元义 申请人:蒙特利尔大学