小鼠抗人prrt2单克隆抗体及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小鼠抗人PRRT2单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。PRRT2是新发现的基因，该基因突变可导致发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmalkinesigenicdyskinesia,PKD)。本发明提供了一种抗人PRRT2单克隆抗体，其对应的抗原表位的序列如SEQIDNO3-SEQIDNO8中的任意一条所示。本发明所制备的抗体具有高度特异性和敏感性，为进一步研究PRRT2在PKD发病中的作用提供了工具，具有重要应用前景。本发明还涉及上述抗人PRRT2单克隆抗体的制备方法和应用。
CGMCC No.7810
2013.07.09
【专利说明】小鼠抗人PRRT2单克隆抗体及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及PRRT2抗体的制备和应用。具体的说，本发明提供 了一种小鼠抗人PRRT2蛋白的单克隆抗体、及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 发作性运动诱发性运动障碍是（paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD)是 一种反复发作、运动诱发、持续时间短暂的运动障碍，呈常染色体显性遗传，表现为舞蹈症、 手足徐动、投掷症、肌张力障碍等不自主运动。2011年，本申请的发明人在国际上首次发现 PRRT2是家族性PKD的致病基因。
[0003] 人PRRT2位于16pl 1.2,有4个外显子，编码含340个氨基酸的富含脯氨酸跨膜蛋 白 2(proline-rich transmembrane protein 2，PRRT2)。PRRT2 蛋白属于 CD225 家族，其 靠近C端有2个跨膜结构域。
[0004] 目前，几种商品化的PRRT2抗体均为多克隆抗体，特异性差，应用Western blot和 免疫荧光的方法，该抗体检测结果显示明显的非特异性，从而对人PRRT2表达谱研究和功 能研究受到限制。因此，制备特异性较好的小鼠抗人PRRT2单克隆抗体，并应用于表达谱分 析及在PKD发病中的作用具有实际作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种特异性好的抗PRRT2蛋白的单克隆抗体。
[0006] 本发明的另一个目的是提供上述抗PRRT2蛋白的单克隆抗体的制备方法。
[0007] 本发明从PRRT2蛋白序列中设计串联的多肽抗原表位，进行抗原合成，进而制备 筛选出PRRT2单克隆抗体，并进行应用。
[0008] 本发明抗原表位设计采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序。 通过计算如下参数来确定表面肽：溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域 预测、或以上任意组合。选择长度为10个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区 以及位于无序区域的肽作为抗原表位。为了避免不同肽片段之间产生新的抗原表位，在不 同肽片段之间插入一个弱免疫原性接头GGGGS将所述肽片段串联到一起。通过全基因组化 学合成的方法合成抗原表位对应的目的cDNA序列，重组到表达载体，诱导表达免疫原，纯 化后多点免疫小鼠。经过了 3年多时间、数以千次的试验，最终得到本发明的抗体。
[0009] 本发明提供了一种抗人PRRT2单克隆抗体，其对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 3-SEQ ID NO 8中的任意一条所示。较好的，其对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 6或者 SEQ ID NO 7 所示。
[0010] 本发明提供了一种小鼠抗人PRRT2单克隆抗体，其制备方法是从PRRT2蛋白序列 中选择数个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串联到一起；合成抗原表位对应 的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原；任选组合佐剂联合所述免疫原多点免疫小 鼠，经细胞融合和筛选获得单克隆抗体。
[0011] 在本发明的一个优选例中，对所获得的抗人PRRT2单克隆抗体进行了保藏。相关 产生抗人PRRT2单克隆抗体的杂交瘤细胞，是分泌PRRT2抗体的小鼠骨髓瘤融合细胞株 9293-lhz-3P2,保藏号为CGMCC No. 7810。CGMCC即中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年7月9 曰。
[0012] 本发明的抗人PRRT2单克隆抗体，能够特异性识别PRRT2蛋白。
[0013] 本发明还提供了上述抗人PRRT2单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤： (1) 从PRRT2蛋白序列中选择1-6个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串 联到一起；所述的抗原表位的序列选自SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条或者若干 条； (2) 合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原； (3) 佐剂联合所述免疫原多点免疫小鼠,经细胞融合和筛选获得单克隆抗体。
[0014] 其中所述选择数个肽片段作为抗原表位，通常选2-10个，本发明选择6个肽片 段。
[0015] 其中，所述的肽片段是长度为10个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨 膜区并且位于无序区域的肽。
[0016] 在本发明的一个实施例中，所述的串联多肽免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO 2 所示。
[0017] 所述肽片段可以采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序获得， 然后通过实验检测验证。
[0018] 所述接头最好具有弱免疫原性。例如，在本发明的优选例中，采用的是GGGGS。制 备单抗串联多肽原是5个GGGGS将选择6个抗原表位肽片段串联在一起的肽段。
[0019] 抗原表位cDNA可以通过本领域常规基因工程技术手段获得，或者采用全基因组 化学合成的方法获得。
[0020] 串联多肽原的表达是通过将串联多肽原的cDNA重组到PET32a表达质粒，转化 Rosetta感受态细胞，诱导表达获得。
[0021] 本发明的方法中，免疫过程中所使用的佐剂选自：弗氏完全佐剂、铝、CpG、或其任 意组合。
[0022] 其中，所述多位点免疫在选自以下位点的、至少2个位点进行：颈背部、尾根、后足 掌、后侧腹股沟、前腿腋窝、后腿肌肉。
[0023] 其中，所述细胞融合是将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(例如，SP2/0)进行融 合。
[0024] 其中所述筛选是对融合的杂交瘤细胞进行筛选。杂交瘤的筛选是通过有限稀释法 亚克隆和ELISA检测。所述抗体通过Western blot和细胞免疫荧光进行特异性验证。
[0025] 在本发明的一个优选例中，所产生的单克隆抗体所对应的抗原表位是： PSSQLAGPGV。
[0026] 本发明的小鼠抗人PRRT2单克隆抗体的提取方法具体如下： 1.人PRRT2免疫抗原设计 人PRRT2蛋白全长氨基酸序列为：（SEQ ID NO I)
【权利要求】
1. 一种抗人PRRT2单克隆抗体，其特征在于，所述的抗人PRRT2单克隆抗体对应的抗原 表位的序列如SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条所示。
2. 如权利要求1所述的抗人PRRT2单克隆抗体，其特征在于，其对应的抗原表位的序列 如 SEQ ID NO 6 或者 SEQ ID NO 7 所示。
3. -种抗人PRRT2单克隆抗体，其特征在于，它由保藏号为CGMCC No. 7810的杂交瘤细 胞产生。
4. 一种产生抗人PRRT2单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是分泌PRRT2抗体的 小鼠骨髓瘤融合细胞株9293-lhz-3P2,保藏号为CGMCC No. 7810。
5. 权利要求1所述的抗人PRRT2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下 步骤： 从PRRT2蛋白序列中选择1-6个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串联到 一起；所述的抗原表位的序列选自SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条或者若干条； 合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原； 佐剂联合所述免疫原多点免疫小鼠，经细胞融合和筛选获得单克隆抗体。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的肽片段是长度为10个氨基酸、 高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区并且位于无序区域的肽。
7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的接头具有弱免疫原性。
8. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的串联多肽免疫原的氨基酸序 列如SEQ ID NO 2所示。
9. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所使用的佐剂选自：弗氏完全佐剂、 铝、CpG、或其任意组合。
10. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述多位点免疫在以下位点中至少 2个位点进行：颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟、前腿腋窝、后腿肌肉。
11. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的筛选包括利用有限稀释法亚 克隆和ELISA检测。
12. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的筛选包括通过Western blot 和细胞免疫荧光进行特异性验证所得抗体。
13. 权利要求1-3中任意一种抗人PRRT2单克隆抗体的应用，其特征在于，所述的抗人 PRRT2单克隆抗体能够特异性识别PRRT2蛋白。
【文档编号】C12R1/91GK104292333SQ201310294241
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月15日 优先权日:2013年7月15日
【发明者】吴志英, 刘功禄, 李宏福 申请人:复旦大学附属华山医院