一种鉴定子鼠基因型的pcr方法
【专利摘要】本发明涉及一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，包括：（1）通过Blast两种品系小鼠的线粒体序列，找到4个SNP位点，选取其中一个位点以子代小鼠线粒体DNA为模板进行PCR扩增；（2）PCR结束后对PCR产物凝胶电泳检测，若出现阳性条带，则进行LDR反应；其中，LDR反应中，每一个SNP位点设计三条探针；（3）LDR结束后，对LDR产物进行凝胶电泳检测，电泳结束后，利用软件提取泳道数据，即可。本发明通过鉴定子代小鼠母本，比较子代表型差异，将母体效应和基因类型联系起来，补充了以往研究中通过改变孕鼠的营养状况或药物激素暴露等方式，从环境因素揭示母体效应的不足，扩展了人们对母体效应的遗传学机制的认识。
【专利说明】—种鉴定子鼠基因型的PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明属于小鼠遗传学领域，特别涉及一种鉴定子鼠基因型的PCR方法。
【背景技术】
[0002]性发育是指个体性成熟并获得生殖能力的过程。下丘脑-垂体-性腺轴系统的重新激活对哺乳动物性发育的启动起着决定性的作用。该性状是一个复杂性状，在个体水平上受多种遗传因素和环境因素的影响。性发育的启动除了受个体本身的基因型影响外，还受到母体效应的影响。母体效应主要包含两方面的因素，胚胎发育的子宫环境以及由于父本及母本来源的不同所产生的基因印迹的影响。
[0003]流行病学调查发现，母亲的身高能直接影响胎儿的大小，同母异父的同胞出生体重的相似性小于同父异母的同胞的出生体重(Gluckman PD, Hanson MA (2004), Maternalconstraint of fetal growth and its consequences.，Semin Fetal NeonatalMed9:419 - 425);另外，试管婴儿的出生体重只与受体母亲的体重有关而与供卵母亲的体重无关(Brooks AA, Johnson MR, Steer PJ, Pawson ME, Abdalla HI (1995), Birthweight:nature or nurture?Early Hum Dev42:29 - 35)。大鼠实验显不，在妊娠过程中给予母鼠低蛋白饮食，会导致雌性后代阴门开启时间延迟；而以6-不饱和脂肪酸喂饲妊娠期雌鼠，其雌性后代的阴门开启时间提前；而给妊娠期雌鼠注射雌激素，会导致其雌性后代的性发育时间提前并增加患乳腺癌的风险(Hilakiv1-Clarke L, Clarke R, Onojafe I, RaygadaM, CHO E, Lippman M, (1997)A maternal diet high in n26polyunsaturated fats altersmammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female ratoffspring Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.94:9372 - 9377)。
[0004]早期胚胎中基因的表达还受到基因印迹的调控，基因印记对个体出生前后的发育，行为和疾病都发挥作用。有.研究表明，小鼠的父源性印迹基因Pgel表现出很强的方向性和亲源效应，父系为Pgel (中胚层特异性转录的)突变的小鼠表现出发育迟缓，而且雌性多为不育，而这种表型与其本身的基因型无关(Lefebvre, L., S.Viville, S.C.Barton, F.1shino,E.B.Keverne et al., (1998), Abnormal maternal behaviour andgrowth retardation associated with loss of the imprinted gene Mest.Nat.Genet.20:163 - 169)。与此相似的是小鼠父源性基因3的突变会影响子代的胚胎发育和出生后的生长(Curley, J.P.，S.Barton, A.Surani and E.B.Keverne, (2004), Coadaptationin mother and infant regulated by a paternally expressed imprinted gene.Proc.R.Soc.Lond.Ser.B271:1303 - 1309)。
[0005]目前，研究性发育调控的母体因素多从营养学角度来进行，一般采用对孕期母本的营养摄入改变或激素药物暴露来研究胚胎发育环境对子代出生后性状的影响，没有涉及母本基因背景的影响研究。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，该方法通过鉴定子代小鼠母本，比较子代表型差异，将母体效应和基因类型联系起来，补充了以往研究中通过改变孕鼠的营养状况或药物激素暴露等方式，从环境因素揭示母体效应的不足，扩展了人们对母体效应的遗传学机制的认识。
[0007]本发明的一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，包括:
[0008](I)通过Blast两种品系小鼠的线粒体序列，找到4个SNP位点，选取其中一个位点以子代小鼠线粒体DNA为模板进行PCR扩增；其中，PCR引物为:
[0009]上游引物:5，-CATTCTTCATGGCTACTGGATTC-3，；
[0010]下游引物:5，-TGCTCATGGTAGTGGAAGTAGAA-3，；
[0011](2) PCR结束后对PCR产物凝胶电泳检测，若出现阳性条带，则进行LDR反应；其中，LDR反应中，每一个SNP位点设计三条探针,一条为位点通用探针(Allele-universalprobe)可以与模板完全配对，其5’端磷酸化，3’端用FAM荧光标记；另外两条位点特异性探针(Allele-specific probes)分别对应该多态性位点的两种等位基因,位点特异性探针的长度相差若干碱基，从而导致其连接产物长度亦有同样的差异，在377测序系统上，两种不同长度的连接产物将表现为不同位置的峰，从而得到鉴别；本发明采用的特异性探针是:
[0012]mtDNA_G: TTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAC ；
[0013]mtDNA_A: TTTTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAT ；
[0014](3 )LDR结束后，对LDR产物进行凝胶电泳检测，电泳结束后，利用软件提取泳道数据，即可。
[0015]所述步骤(I)中的两.种品系小鼠分别为B6C3HF1和C3HB6F1。
[0016]所述步骤(I)中作为模板的SNP位点为G9349A。
[0017]所述步骤(I)中的PCR 扩增反应条件为:95°C 15min,94°C 30s, 55 °C lmin,72°C lmin，72°C lOmin，共 35 个循环。
[0018]所述步骤(2)中的凝胶电泳检测为2%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0019]所述步骤(2)中的LDR反应体系为:ddH205.95 μ L，10XLDR Bufferl μ L，探针总体积I μ L, Taq DNA连接酶0.05 μ L, PCR产物2 μ L，总体积10 μ L。
[0020]所述步骤(2)中的LDR反应条件为:94°C 2min，94°C 30s, 50°C 2min，共35个循环。[0021 ] 所述步骤(3 )中的凝胶电泳检测为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
[0022]有益.效果
[0023]本发明通过鉴定子代小鼠母本，比较子代表型差异，将母体效应和基因类型联系起来，补充了以往研究中通过改变孕鼠的营养状况或药物激素暴露等方式，从环境因素揭示母体效应的不足，扩展了人们对母体效应的遗传学机制的认识。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为B6C3HF1的小鼠LDR分型结果图，分子片段大小为82bp ；
[0025]图2为C3HB6F1的小鼠LDR分型结果图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0027]实施例1
[0028]通过Blast两种品系小鼠(B6C3HF1和C3HB6F1)的线粒体序列，找到4个SNP位点，选取其中一个位点(G9349A)以子代小鼠线粒体DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增反应条件为:95°C 15min，94°C 30s, 55 °C lmin, 72 °C lmin, 72 °C lOmin，共 35 个循环；其中，PCR引物为:上游引物:5’ - CATTCTTCATGGCTACTGGATTC-3’ ；下游引物:5， -TGCTCATGGTAGTGGAAGTAGAA-3，；
[0029]PCR结束后，取8μ I PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现阳性条带，则进行LDR反应。
[0030]LDR反应中，每一个多态性位点需设计三段探针。其中一条位点通用探针(Allele-universalprobe)可以与模板完全配对,其5’端磷酸化,3’端用FAM突光标记；另外两条位点特异性探针(Allele-specific probes)分别对应该多态性位点的两种等位基因。位点特异性探针的长度相差若干碱基，从而导 致其连接产物长度亦有同样的差异。在377测序系统上，两种不同长度的连接产物将表现为不同位置的峰，从而得到鉴别。
[0031 ] 本实施例使用的LDR探针:
【权利要求】
1.一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，包括: (1)通过Blast两种品系小鼠的线粒体序列，找到4个SNP位点，选取其中一个位点以子代小鼠线粒体DNA为模板进行PCR扩增；其中，PCR引物为: 上游引物:5 ’ -CATTCTTCATGGCTACTGGATTC-3，； 下游引物:5’ -TGCTCATGGTAGTGGAAGTAGAA-3’ ； (2)PCR结束后对PCR产物凝胶电泳检测，若出现阳性条带，则进行LDR反应；其中，LDR反应中，每一个SNP位点设计三条探针，一条为位点通用探针，另外两条位点特异性探针分别为:
mtDNA_G: TTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAC ；
mtDNA_A: TTTTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAT ； (3)LDR结束后，对LDR产物进行凝胶电泳检测，电泳结束后，利用软件提取泳道数据，即可。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步骤(I)中的两种品系小鼠分别为B6C3HF1和C3HB6F1。
3.根据权利要求1所述的一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步骤(I)中作为模板的SNP位点为G9349A。
4.根据权利要求1所述的一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步骤(I)中的 PCR扩增反应条件为:95V 15min,94°C 30s,55°C lmin,72°C lmin,72°C lOmin，共 35 个循环。
5.根据权利要求1所述的一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步骤(2)中的凝胶电泳检测为2%琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求1所述的一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步骤(2)中的LDR反应体系为:ddH205.95 μ L, IOXLDR Bufferl μ L，探针总体积I μ L，Taq DNA连接SI 0.05 μ L, PCR 产物 2 μ L，总体积 10 μ L0
7.根据权利要求1所述的一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步骤(2)中的LDR反应条件为:94°C 2min,94°C 30s, 50°C 2min，共35个循环。
8.根据权利要求1所述的一种鉴定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步骤(3)中的凝胶电泳检测为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
【文档编号】C12Q1/68GK103436603SQ201310296488
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月15日 优先权日:2013年7月15日
【发明者】周宇荀, 管清华, 肖君华, 李凯 申请人:东华大学