一种基于特异引物鉴定5种常见储粮扁谷盗的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定或辅助鉴定5种常见储粮扁谷盗的试剂盒。本发明所提供的试剂盒包括如下5个引物对中的至少一对：引物对1（序列1和序列2）、引物对2（序列3和序列4）、引物对3（序列5和序列6）、引物对4（序列7和序列8）和引物对5（序列9和序列10）。实验证明，利用本发明所提供的试剂盒对储粮扁谷盗进行种的鉴定，与传统形态鉴定方法相比，该方法不需要形态分类学基础且实现了对非成虫态的鉴定；而与其它分子生物学鉴定方法相比，该方法简化了鉴定常见储粮扁谷盗的分子检测步骤，具有操作简便、耗时较短、灵敏度高且较稳定，结果直观等特点，为进一步鉴定扁谷盗属近缘种的研究奠定了基础。
【专利说明】—种基于特异引物鉴定5种常见储粮扁谷盗的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种用于鉴定或辅助鉴定5种常见储粮扁谷盗的试剂盒。
【背景技术】
[0002]扁谷盗隶属于鞘翅目(Coleoptera)、扁谷盗科(Laemophloeidae)、扁谷盗属(Cryptolestes)，该属国内外共记述有20余种，其中危害储粮的扁谷盗约为10种，在世界范围内分布较为广泛的为锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗等5种。
[0003]鞘翅目昆虫在储粮害虫中数量最大、种类最多、检疫意义最突出，扁谷盗即是鞘翅目储粮害虫中具有重要经济意义的一个类群，其幼虫和成虫可危害谷物、豆类、油料等多种农产品与其加工产品，大量发生时能造成较为严重的经济损失，主要通过农副产品的贸易进行跨境传播。近年来，我国进出境检验检疫部门截获的扁谷盗批次明显增多。明确口岸截获和粮库发生的储粮扁谷盗种类，对检疫决策制定和有害生物治理具有十分重要的意义。由于扁谷盗个体微小(体长2_左右)且种间外部形态极为相似等原因，传统的形态学鉴定技术仅能鉴定具有明显特征形态的成虫，对鉴定人员的形态分类学技术要求较高，并不能满足快速、准确鉴定扁谷盗种类的需求。
[0004]近几年发展起来的分子生物学鉴定方法主要包括同工酶电泳技术、限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术、随机扩增DNA多态性分析(RAPD)技术、核酸序列分析技术及特异引物PCR技术。限制性片段长度多态性PCR技术结果较为准确，但筛选所需限制性内切酶种类的工作量较大。截至目前，未见针对锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、微扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗这5种世界常见储粮扁谷盗的分子鉴定技术的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的试剂盒。
[0006]本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的试剂盒，可包括如下5个引物对中的至少一对:
[0007](1)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对I ;
[0008](2)由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2 ；
[0009](3)由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3 ；
[0010](4)由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4 ；
[0011](5)由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的引物对5。
[0012]其中，序列I由21个核苷酸组成；序列2由20个核苷酸组成；序列3由21个核苷酸组成；序列4由23个核苷酸组成；序列5由22个核苷酸组成；序列6由22个核苷酸组成；序列7由21个核苷酸组成；序列8由22个核苷酸组成；序列9由19个核苷酸组成?’序列10由22个核苷酸组成。
[0013]在所述试剂盒中，组成每个引物对的两条单链DNA的摩尔数相等。[0014]所述储粮扁谷盗可为如下中的至少一种:锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、微扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗。
[0015]在所述试剂盒中，所述引物对I特异于锈赤扁谷盗；所述引物对2特异于长角扁谷盗；所述引物对3特异于微扁谷盗；所述引物对4特异于土耳其扁谷盗；所述引物对5特异于开普扁谷盗。
[0016]本发明的再一个目的是提供所述试剂盒的制备方法。
[0017]所述试剂盒的制备方法，具体可包括如下步骤:将组成所述试剂盒中各引物对的各单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内:PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
[0018]本发明的还一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的方法。
[0019]本发明所提供的鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的方法，可为如下(a)_ (e)中的任一种:
[0020](a)鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为锈赤扁谷盗的方法，包括如下(al)和(a2)的步骤:
[0021](al)以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对I进行PCR扩增；
[0022](a2)检测步骤(al)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为锈赤扁谷盗:若所述PCR产物中含有158bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为锈赤扁谷盗；反之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为锈赤扁谷盗；
[0023](b)鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为长角扁谷盗的方法，包括如下(bl)和(b2)的步骤:
[0024](bl)以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2进行PCR扩增；
[0025](b2)检测步骤(bl)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为长角扁谷盗:若所述PCR产物中含有371bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为长角扁谷盗；反之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为长角扁谷盗；
[0026](C)鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为微扁谷盗的方法，包括如下(Cl)和(c2)的步骤:
[0027](Cl)以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3进行PCR扩增；
[0028](c2)检测步骤(Cl)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为微扁谷盗:若所述PCR产物中含有585bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为微扁谷盗；反之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为微扁谷盗；
[0029](d)鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为土耳其扁谷盗的方法，包括如下(dl)和(d2)的步骤:
[0030](dl)以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4进行PCR扩增；[0031](d2)检测步骤(dl)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为土耳其扁谷盗:若所述PCR产物中含有355bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为土耳其扁谷盗；反之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为土耳其扁谷盗；
[0032](e)鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为开普扁谷盗的方法，包括如下(el)和(e2)的步骤:
[0033](el)以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的引物对5进行PCR扩增；
[0034](e2)检测步骤(el)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为开普扁谷盗:若所述PCR产物中含有289bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为开普扁谷盗；反之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为开普扁谷盗。
[0035]在上述方法中，步骤(a)_步骤(e)中，所有的所述进行PCR扩增的退火温度均为50。。。
[0036]在上述方法中，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4和所述引物对5，组成每个引物对的两条单链DNA在各自的PCR反应体系中的摩尔比均为1:1。在本发明中，每个引物对的两条单链DNA在各自的PCR反应体系中的摩尔浓度均为0.2 μ M。
[0037]在上述方法中，步骤(a)中，所述158bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列11 ;步骤(b)中，所 述371bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列12 ;步骤(c)中，所述585bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列13 ;步骤(d)中，所述355bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列14 ;步骤(e)中，所述289bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列15。
[0038]上述任一所述鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的方法中，所述待测储粮扁谷盗属于扁谷盗科(Laemophloeidae)的扁谷盗属(Cryptolestes),具体为锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、微扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗中的至少一种。
[0039]本发明针对锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、微扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗这5种世界常见储粮扁谷盗，基于mtDNA COI基因序列分别设计了特异引物，可直接鉴别以上5种储粮扁谷盗。与传统形态鉴定方法相比，该方法不需要形态分类学基础且实现了对非成虫态的鉴定；而与其它分子生物学鉴定方法(如限制性片段长度多态性PCR、核酸序列分析)相比，该方法简化了鉴定常见储粮扁谷盗的分子检测步骤，具有操作简便、耗时较短、灵敏度高且较稳定，结果直观等特点，为进一步鉴定扁谷盗属近缘种的研究奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1为用于鉴定锈赤扁谷盗的引物对CF84F21/CF222R20的特异性检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(DNA Marker II);其他泳道信息为1:开普扁谷盗(捷克布拉格)；2:土耳其扁谷盗(捷克布拉格)；3:土耳其扁谷盗(河南商丘)；4:锈赤扁谷盗(捷克布拉格)；5:锈赤扁谷盗(美国堪萨斯州)6:锈赤扁谷盗(山东济宁)；7:锈赤扁谷盗(广东湛江);8，9:微扁谷盗(云南泸西)；10:长角扁谷盗(捷克布拉格)；11:长角扁谷盗(美国堪萨斯州)；12，13:长角扁谷盗(湖北武汉)；14，15:长角扁谷盗(海南海口)；16:阴性对照(ddH20)。[0041]图2为用于鉴定长角扁谷盗的引物对CP53F21/CP401R23的特异性检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(DNA Marker II);其他泳道信息为1:开普扁谷盗(捷克布拉格);2:土耳其扁谷盗(捷克布拉格);3:土耳其扁谷盗(河南商丘);4:锈赤扁谷盗(捷克布拉格)；5:锈赤扁谷盗(美国堪萨斯州)6:锈赤扁谷盗(山东济宁)；7:锈赤扁谷盗(广东湛江);8，9:微扁谷盗(云南泸西)；10:长角扁谷盗(捷克布拉格)；11:长角扁谷盗(美国堪萨斯州)；12，13:长角扁谷盗(湖北武汉)；14，15:长角扁谷盗(海南海口)；16:阴性对照(ddH20)。
[0042]图3为用于鉴定微扁谷盗的引物对C038F22/C0601R22的特异性检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(DNA Marker II);其他泳道信息为1:开普扁谷盗(捷克布拉格)；2:土耳其扁谷盗(捷克布拉格)；3:土耳其扁谷盗(河南商丘)；4:锈赤扁谷盗(捷克布拉格)；5:锈赤扁谷盗(美国堪萨斯州)6:锈赤扁谷盗(山东济宁)；7:锈赤扁谷盗(广东湛江)；8,9:微扁谷盗(云南泸西)；10:长角扁谷盗(捷克布拉格)；11:长角扁谷盗(美国堪萨斯州)；12，13:长角扁谷盗(湖北武汉)；14，15:长角扁谷盗(海南海口)；16:阴性对照(ddH20)。
[0043]图4为用于鉴定土耳其扁谷盗的引物对CT81F21/CT414R22的特异性检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(DNA Marker II);其他泳道信息为1:开普扁谷盗(捷克布拉格)；2:土耳其扁谷盗(捷克布拉格)；3:土耳其扁谷盗(河南商丘)；4:锈赤扁谷盗(捷克布拉格)；5:锈赤扁谷盗(美国堪萨斯州)6:锈赤扁谷盗(山东济宁)；7:锈赤扁谷盗(广东湛江);8，9:微扁谷盗(云南泸西)；10:长角扁谷盗(捷克布拉格)；11:长角扁谷盗(美国堪萨斯州)；12，13:长角扁谷盗(湖北武汉)；14，15:长角扁谷盗(海南海口)；16:阴性对照(ddH20)。
[0044]图5为用于鉴定开普扁谷盗的引物对CC82F19/CC349R22的特异性检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(DNA Marker II);其他泳道信息为1:开普扁谷盗(捷克布拉格);2:土耳其扁谷盗(捷克布拉格);3:土耳其扁谷盗(河南商丘);4:锈赤扁谷盗(捷克布拉格)； 5:锈赤扁谷盗(美国堪萨斯州)6:锈赤扁谷盗(山东济宁)；7:锈赤扁谷盗(广东湛江);8，9:微扁谷盗(云南泸西)；10:长角扁谷盗(捷克布拉格)；11:长角扁谷盗(美国堪萨斯州)；12，13:长角扁谷盗(湖北武汉)；14，15:长角扁谷盗(海南海口)；16:阴性对照(ddH20)。
[0045]图6为用于鉴定锈赤扁谷盗的引物对CF84F21/CF222R20的灵敏度检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(DNA Marker I);其他泳道信息为1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6 =DNA模板用量0.05ng ;7，8:阴性对照(ddH20)。
[0046]图7为用于鉴定长角扁谷盗的引物对CP53F21/CP401R23的灵敏度检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(DNA Marker I);其他泳道信息为1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6 =DNA模板用量0.05ng ;7，8:阴性对照(ddH20)。
[0047]图8为用于鉴定微扁谷盗的引物对C038F22/C0601R22的灵敏度检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(DNA Marker I);其他泳道信息为1:DNA模板用量IOng ；2:DNA模板用量5ng ；3:DNA模板用量Ing ；4:DNA模板用量0.5ng ；5:DNA模板用量0.1ng ；6:DNA模板用量0.05ng ;7，8:阴性对照(ddH20)。
[0048]图9为用于鉴定土耳其扁谷盗的引物对CT81F21/CT414R22的灵敏度检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(DNA Marker I);其他泳道信息为1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6:DNA模板用量0.05ng ;7，8:阴性对照(ddH20)。
[0049]图10为用于鉴定开普扁谷盗的引物对CC82F19/CC349R22的灵敏度检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(DNA Marker I);其他泳道信息为1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6 =DNA模板用量0.05ng ;7，8:阴性对照(ddH20)。
【具体实施方式】
[0050]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0051]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052]5种储粮扁谷盗:锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、微扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗。其中，锈赤扁谷盗涉及如下地理种群:捷克布拉格种群、美国堪萨斯州种群、山东济宁种群、广东湛江种群；长角扁谷盗涉及如下地理种群:捷克布拉格种群、美国堪萨斯州种群、湖北武汉种群、海南海口种群；微扁谷盗涉及如下地理种群:云南泸西种群；土耳其扁谷盗涉及如下地理种群:捷克布拉格种群、河南商丘种群；开普扁谷盗涉及如下地理种群:捷克布拉格种群。以上5种储粮扁谷盗记载在“谢更祥，唐易，张连中等.海南地区扁谷盗抗药性和实仓防治研究.粮食储藏 ，2013 (I):9-12”、“祝长清等.河南昆虫志鞘翅目(一).河南科学技术出版社，1999-12出版”、“蒋庆慈，黄辅元，姜武峰等.几种主要储粮害虫对磷化氢的抗性抽测报告.粮油仓储科技通讯，1992 (6):46-52”、uZuzana Kucerova, Vaclav Stejskal.Comparative egg morphology of silvanid andalaemophloeid beetles (Coleptera)pccurring in stored products.Journal of StoredProducts Research，2002(38):219-227”、“RENNIE ROESLI, BHADRIRAJU SUBRAMANYAM, etal.Stored-Product Insects Associated with a Retail Pet Store Chain in Kansas.JOURNAL OF E⑶NOMIC ENTOMOLOGY, 1958-1966”、“David W.Hagstrum.1mmigration ofinsects into bins storing newly harvested wheat onl2Kansas farms.Journal ofStored Products Research, 2001 (37): 221-229”、“张永富.防治锈赤扁谷盗值得关注的问题.粮油仓储科技通讯，2002 (1):33-40”、“刘永平，张生芳.我国微扁谷盗的发现及初步调查研究.植物检疫，1984 (3):1-4”、“商永辉，杜明华.探索书虱、锈赤扁谷盗综合防治的措施.137-143” 中。
[0053]实施例1、针对5种世界常见储粮扁谷盗的特异引物的设计与合成
[0054]一、5种世界常见储粮扁谷盗mtDNA COI序列的获得
[0055]实验材料:涉及5种储粮扁谷盗，具体为锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、微扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗。其中，锈赤扁谷盗涉及如下地理种群:捷克布拉格种群、美国堪萨斯州种群、山东济宁种群、广东湛江种群；长角扁谷盗涉及如下地理种群:捷克布拉格种群、美国堪萨斯州种群、湖北武汉种群、海南海口种群；微扁谷盗涉及如下地理种群:云南泸西种群；土耳其扁谷盗涉及如下地理种群:捷克布拉格种群、河南商丘种群；开普扁谷盗涉及如下地理种群:捷克布拉格种群。
[0056](I)扁谷盗基因组DNA的提取
[0057]采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作，提取单头扁谷盗成虫去除腹部后虫体或单头非成虫态整个虫体的总DNA，根据提取效果做适当的调整，保证提取DNA质量良好，可用于下一步实验。具体提取程序如下:
[0058]①取待测的成虫样品在双目解剖镜下去除其腹部，将无腹部的扁谷盗成虫样品或整头非成虫样品用双蒸水清洗1-3次，然后置于滤纸上自然干燥。
[0059]②取上述干燥后的单头扁谷盗于1.5ml体积离心管中，加入液氮，迅速用烧溶封口后的枪头将样品彻底研磨碎。
[0060]③加入200 μ L缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。
[0061]④加入10 μ L蛋白酶K混匀，在56°C水浴条件下放置至少3小时，直至组织溶解，每小时颠倒混匀样品2-3次。离心30秒以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
[0062]⑤加入200 μ L缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，离心30秒以去除管盖内壁的水珠。
[0063]⑥加入200 μ L无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0064]⑦将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将CB3吸附柱放回收集管中。
[0065]⑧向吸附柱CB3中加入500 μ L缓冲液⑶，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0066]⑨向吸附柱CB3中加入700 μ L缓冲液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0067]⑩向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。
[0068](11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置15分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0069](12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加20ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0070](13)扁谷盗的基因组DNA被洗脱到离心管中，_20°C保存备用。
[0071 ] (2) mtDNA COI 序列 PCR 扩增
[0072]以步骤(1)提取得到的扁谷盗基因组DNA为模板，利用通用引物对:LC01490和HC02198扩增扁谷盗的mtDNA COI序列，不同种扩增产物长度约为700bp。反应体系:PCR反应总体积为50yL，其中2XTaq PCR MasterMix25 μ L (上海生工生物工程有限公司)，ddH2021 μ L,模板2μ L,上游引物IyL,下游引物IyL,引物浓度均为10 μ Μ。热循环程序为:94°C预变性 3min，接着进行 35 个循环(94°C lmin,50°C lmin，72°C lmin)，最后在 72°C反应10min后结束。
[0073]LC01490:5， -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，；
[0074]HC02198: 5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。
[0075](3) mtDNA COI 序列的获得
[0076]采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量，将扩增条带明亮且背景干净的样品委托北京奥科生物技术公司进行纯化并双向测序，测序采用以上通用引物对(LC01490/HC02198)。测序反应均在AB1-3730测序仪上进行。将测得序列用DNAMAN6.0软件进行比对拼接，切除引物段后获得最终长为658bp的序列片段。[0077]二、针对5种储粮扁谷盗特异引物的设计
[0078](I)引物设计
[0079]将步骤一获得的5种扁谷盗(每种包含I至多个地理种群)的mtDNA COI序列进行DNAMAN比对分析后，采用Primer Premier5.0软件分别设计针对5种扁谷盗的特异引物。
[0080](2)引物评估
[0081]采用01igo7软件对引物对各项指标进行评估，评估内容及评估标准如下:
[0082]上下游引物的Delta G值绝对值不超过9 ;可形成引物二聚体或发夹结构的结合碱基对不要超过3个；GC%含量控制在30%-60%之间，且上下游之间不要相差太大；错误引发效率不超过100 ;最后，结合01 igo7软件给出不同引物对最适退火温度，将退火温度统一设定为50°C。
[0083]根据以上所述，设计并合成得到针对5种储粮扁谷盗的特异引物如下(表1):
[0084]表1世界常见5种储粮扁谷盗的特异引物一览表
[0085]
【权利要求】
1.一种用于鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的试剂盒，包括如下5个引物对中的至少一对: (O由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对I ; (2)由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2； (3)由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3； (4)由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4； (5)由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的引物对5。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中组成每个引物对的两条单链DNA的摩尔数相等。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述储粮扁谷盗为如下中的至少一种:锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、微扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗。
4.权利要求1-3中任一所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤:将组成所述试剂盒中各引物对的各单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内:PCR反应缓冲液、DNA 聚合酶和4种dNTP。
5.鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的方法，为如下(a)- (e)中的任一种: (a)鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为锈赤扁谷盗的方法，包括如下(al)和(a2)的步骤: (al)以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对I进行PCR扩增； (a2)检测步骤(al)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为锈赤扁谷盗:若所述PCR产物中含有158bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为锈赤扁谷盗；反之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为锈赤扁谷盗； (b)鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为长角扁谷盗的方法，包括如下(bl)和(b2)的步骤: (bl)以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2进行PCR扩增； (b2)检测步骤(bl)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为长角扁谷盗:若所述PCR产物中含有371bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为长角扁谷盗；反之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为长角扁谷盗； (c)鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为微扁谷盗的方法，包括如下(Cl)和(c2)的步骤: (Cl)以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3进行PCR扩增； (c2)检测步骤(Cl)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为微扁谷盗:若所述PCR产物中含有585bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为微扁谷盗；反之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为微扁谷盗； (d)鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为土耳其扁谷盗的方法，包括如下(dl)和(d2)的步骤: (dl)以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4进行PCR扩增； (d2)检测步骤(dl)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为土耳其扁谷盗:若所述PCR产物中含有355bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为土耳其扁谷盗；反 之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为土耳其扁谷盗； (e)鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为开普扁谷盗的方法，包括如下(el)和(e2)的步骤: (el)以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的引物对5进行PCR扩增； (e2)检测步骤(el)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为开普扁谷盗:若所述PCR产物中含有289bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为开普扁谷盗；反之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为开普扁谷盗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:步骤(a)_步骤(e)中，所有的所述进行PCR扩增的退火温度均为50°C。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4和所述引物对5，组成每个引物对的两条单链DNA在各自的PCR反应体系中的摩尔比均为1:1。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于:步骤(a)中，所述158bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列11 ;步骤(b)中，所述371bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列12 ;步骤(c)中，所述585bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列13 ;步骤(d)中，所述355bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列14 ;步骤(e)中，所述289bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列15。
【文档编号】C12Q1/68GK103952463SQ201310298148
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】李志红, 王一椒 申请人:中国农业大学