重组大肠杆菌高密度发酵的方法
【专利摘要】本发明提供一种重组大肠杆菌高密度发酵的方法。本发明的方法包括：采用三级菌种保藏方法，将构建后的重组大肠杆菌进行保藏，并经过活化、摇瓶培养、种子罐培养后转入发酵罐进行通气搅拌发酵罐培养，在发酵罐培养过程中通过提高搅拌转速及空气流量来保证溶氧水平，并根据pH的变化调整补料速度，当菌体生长至一定阶段后加入诱导剂，并降温发酵至结束。本发明降低了发酵过程中由于菌种退化导致生产异常现象的出现，优化了发酵、补料培养基及补料方法，保证了菌体快速生长代谢所需营养条件及外部环境，大大提高了放罐时菌体含量及产物产量，并且批次间可重复性好，有利于工业化生产控制。
【专利说明】 重组大肠杆菌高密度发酵的方法
[0001]【技术领域】:
本发明涉及一种重组大肠杆菌高密度发酵的方法，属于分子生物学【技术领域】。
[0002]【背景技术】:
随着生物技术特别是分子克隆技术的发展，重组大肠杆菌越来越多的应用到蛋白质药物、酶制剂、氨基酸、生物添加剂等高附加值产品的大规模生产中。但是由于重组大肠杆菌稳定性较差，在长期生产中容易发生菌种衰退，传统菌种保藏方法无法长期保持菌体生长代谢活力，导致生产中容易出现菌体自溶、质粒丢失、产量下降等问题。而且在发酵过程中，传统发酵方法和补料方法无法达到高菌体密度，使得产品产量的提升受到制约。因此开发一种有效的菌种保藏及高密度发酵生产的方法对工业化生产具有十分重要的意义。
[0003]
【发明内容】
:
本发明的目的是针对上述存在的问题提供一种重组大肠杆菌高密度发酵的方法，大大提高长期菌种保藏过程中的菌体稳定性，降低发酵过程中由于菌种退化导致生产异常现象的出现，并且批次间可重复性好，有利于工业化生产控制。
[0004]上述的目的通过以下的技术方案实现:
重组大肠杆菌高密度发酵的方法，该方法包括:采用三级菌种保藏方法，将构建后的重组大肠杆菌进行保藏，并经过活化、摇瓶培养、种子罐培养后转入发酵罐进行通气搅拌发酵罐培养，在发酵罐培养过程中通过提高搅拌转速及空气流量来保证溶氧水平，并根据PH的变化调整补料速度，当菌体生长至一定阶段后加入诱导剂，并降温发酵至结束。
[0005]所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的三级菌种保藏方法包括:
①原始菌种库的建立:将构建好的重组大肠杆菌以1%_2%的接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，然后与灭过菌的等量质量浓度为20%的脱脂奶充分混匀，无菌条件下分装至200ul安瓿管中，真空冷冻干燥后封口，于_80°C冰箱中保存；
②主代菌种库的建立:原始菌种库检验合格后，1ml摇管活化6-8h，然后以1%_2%的接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，再与灭过菌的等量质量浓度为20%的脱脂奶充分混匀，无菌条件下分装至200ul安瓿管中，真空冷冻干燥后封口，于_80°C冰箱中保存；
③工作菌种库的建立:主代菌种库检验合格后，1ml摇管活化6-8h，然后以1%-2%接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，再与灭过菌的70%甘油以7:3的比例混合，无菌条件下分装至Iml EP管中，于_80°C冰箱中保存。
[0006]所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的活化是将工作菌种库中的菌种在斜面培养基中进行划线培养24h，然后接种于50ml液体培养基中摇床活化培养6-8h，所述的斜面培养基包括:蛋白胨1%-1.5%，酵母抽提粉0.5%-1%，NaCl 0.5%_1%，琼脂粉1.5%-2.0%, ρΗ6.8-7.0。
[0007]所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的摇瓶培养是指将摇床活化培养后的菌种转接于500ml液体培养基中摇床培养6-8h,制得摇瓶种子液,所述的培养液包括蛋白胨 1%-1.5%，酵母抽提粉 0.5%-1%，NaCl 0.5%_1%，ρΗ6.8-7.0。
[0008]所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的种子罐培养是将摇瓶种子液以1%-2%的比例接种于灭过菌的种子罐中，通气搅拌培养4-6h，培养条件:转速200-400rpm，通气量0.5-1.5vvm，温度35-37°C，罐压0.03-0.07MPa，所述的种子罐培养的培养基包括:蛋白胨 1%-1.5%，酵母抽提粉 1.5%-2.0%, NaCl 0.5%_1%，葡萄糖 1%_2%，KH2PO4 0.05%-0.1%，K2HPO4 0.l%-0.3%, pH6.8-7.0。
[0009]所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的发酵罐培养是将种子罐中种子液以1%_2%的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养，初始培养条件:转速100-120rpm,通气量 0.5-1.0vvm,温度 35_37°C，罐压 0.03-0.07MPa,当溶氧低于 20% 后，逐步提高转速至400rpm，通气量至2.0vvm,控制pH7.0-7.1，根据pH调整补料，发酵0D600至30以上时，加入诱导剂，降温并继续培养10-16h，初始培养基包括:蛋白胨1%_2%，酵母抽提粉 1.5%-2.5%, NaCl 0.5%_1%，葡萄糖 0.5%_1%，KH2PO4 0.15%-0.25%, K2HPO4 0.3%-0.4%,MgSO4 0.05%-0.1%，pH 6.8-7.0 ;补料培养基包括:蛋白胨3%_5%，酵母抽提粉6%_8%，甘油10%-20%，ZnSO4 0.4%-0.8%, CaCl2 0.3%-0.5%, CoCl2 0.1%_0.3%, MgSO4 1%_3%，ρΗ5.0-5.2。
[0010]所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的当菌体生长至一定阶段后加入诱导剂，并降温发酵至结束是指发酵0D_至30以上时加入诱导剂，加入诱导剂后将发酵罐温度由35-37°C降为25-27°C，所述的诱导剂为0.2% L-阿拉伯糖和/或ImM异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷。
[0011]有益效果:
1、本发明采取三级菌种保藏方法，大大提高了长期菌种保藏过程中的菌体稳定性，将现有菌种保藏工艺的有效保藏期由半年提高至5年，大大降低了发酵过程中由于菌种退化导致生产异常现象的出现。
[0012]2、本发明优化了发酵、补料培养基及补料方法，保证了菌体快速生长代谢所需营养条件及外部环境，大大提高了放罐时菌体含量及产物产量，菌体光密度0D_由现有的60提高至100以上。
[0013]3、本发明提供了一种重组大肠杆菌的稳定生产的方法，批次间可重复性好，有利于工业化生产控制。
[0014]【具体实施方式】:
实施例1:
重组大肠杆菌高密度发酵的方法，该方法包括:采用三级菌种保藏方法，将构建后的重组大肠杆菌进行保藏，并经过活化、摇瓶培养、种子罐培养后转入发酵罐进行通气搅拌发酵罐培养，在发酵罐培养过程中通过提高搅拌转速及空气流量来保证溶氧水平，并根据PH的变化调整补料速度，当菌体生长至一定阶段后加入诱导剂，并降温发酵至结束。
[0015]实施例2:
实施例1所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的三级菌种保藏方法包括:
①原始菌种库的建立:将构建好的重组大肠杆菌以1%_2%的接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，然后与灭过菌的等量质量浓度为20%的脱脂奶充分混匀，无菌条件下分装至200ul安瓿管中，真空冷冻干燥后封口，于_80°C冰箱中保存；
②主代菌种库的建立:原始菌种库检验合格后，1ml摇管活化6-8h，然后以1%_2%的接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，再与灭过菌的等量质量浓度为20%的脱脂奶充分混匀，无菌条件下分装至200ul安瓿管中，真空冷冻干燥后封口，于_80°C冰箱中保存； ③工作菌种库的建立:主代菌种库检验合格后，1ml摇管活化6-8h，然后以1%-2%接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，再与灭过菌的70%甘油以7:3的比例混合，无菌条件下分装至Iml EP管中，于_80°C冰箱中保存。
[0016]实施例3:
实施例1或实施例2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的活化是将工作菌种库中的菌种在斜面培养基中进行划线培养24h，然后接种于50ml液体培养基中摇床活化培养6-8h，所述的斜面培养基包括:蛋白胨1%_1.5%，酵母抽提粉0.5%-1%，NaCl 0.5%_1%，琼脂粉 1.5%-2.0%, ρΗ6.8-7.0。
[0017]实施例4:
上述实施例所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的摇瓶培养是指将摇床活化培养后的菌种转接于500ml液体培养基中摇床培养6-8h,制得摇瓶种子液,所述的培养液包括蛋白胨 1%-1.5%，酵母抽提粉 0.5%-1%，NaCl 0.5%_1%，ρΗ6.8-7.0。
[0018]实施例5:
上述实施例所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的种子罐培养是将摇瓶种子液以1%_2%的比例接种于灭过菌的种子罐中，通气搅拌培养4-6h，培养条件:转速200-400rpm，通气量0.5-1.5vvm，温度35_37°C，罐压0.03-0.07MPa，所述的种子罐培养的培养基包括:蛋白胨1%_1.5%，酵母抽提粉1.5%-2.0%，NaCl 0.5%_1%，葡萄糖1%_2%，KH2PO40.05%-0.1%，K2HPO4 0.l%-0.3%, pH6.8-7.0。
[0019]实施例6:
上述实施例所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的发酵罐培养是将种子罐中种子液以1%_2%的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养，初始培养条件:转速100-120rpm，通气量 0.5-1.0vvm，温度 35_37°C，罐压 0.03-0.07MPa,当溶氧低于 20% 后，逐步提高转速至400rpm，通气量至2.0vvm,控制pH7.0-7.1，根据pH调整补料，发酵0D600至30以上时，加入诱导剂，降温并继续培养10-16h，初始培养基包括:蛋白胨1%_2%，酵母抽提粉 1.5%-2.5%, NaCl 0.5%_1%，葡萄糖 0.5%_1%，KH2PO4 0.15%-0.25%, K2HPO4 0.3%-0.4%,MgSO4 0.05%-0.1%，pH 6.8-7.0 ;补料培养基包括:蛋白胨3%_5%，酵母抽提粉6%_8%，甘油10%-20%，ZnSO4 0.4%-0.8%, CaCl2 0.3%-0.5%, CoCl2 0.1%_0.3%, MgSO4 1%_3%，ρΗ5.0-5.2。
[0020]实施例7:
上述实施例所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，所述的当菌体生长至一定阶段后加入诱导剂，并降温发酵至结束是指发酵OD6tltl至30以上时加入诱导剂，加入诱导剂后将发酵罐温度由35-37°C降为25-27°C，所述的诱导剂为0.2% L-阿拉伯糖和/或ImM异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷。
[0021]以上仅是本发明的最佳实施例，本发明的方法包括但不限于上述实施例，本发明的未尽事宜，属于本领域技术人员的公知常识。
【权利要求】
1.一种重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是:该方法包括:采用三级菌种保藏方法，将构建后的重组大肠杆菌进行保藏，并经过活化、摇瓶培养、种子罐培养后转入发酵罐进行通气搅拌发酵罐培养，在发酵罐培养过程中通过提高搅拌转速及空气流量来保证溶氧水平，并根据pH的变化调整补料速度，当菌体生长至一定阶段后加入诱导剂，并降温发酵至结束。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是:所述的三级菌种保藏方法包括: ①原始菌种库的建立:将构建好的重组大肠杆菌以1%_2%的接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，然后与灭过菌的等量质量浓度为20%的脱脂奶充分混匀，无菌条件下分装至200ul安瓿管中，真空冷冻干燥后封口，于_80°C冰箱中保存； ②主代菌种库的建立:原始菌种库检验合格后，1ml摇管活化6-8h，然后以1%_2%的接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，再与灭过菌的等量质量浓度为20%的脱脂奶充分混匀，无菌条件下分装至200ul安瓿管中，真空冷冻干燥后封口，于_80°C冰箱中保存； ③工作菌种库的建立:主代菌种库检验合格后，1ml摇管活化6-8h，然后以1%-2%接种量接种于50ml液体培养基中培养6-8h，再与灭过菌的70%甘油以7:3的比例混合，无菌条件下分装至Iml EP管中，于_80°C冰箱中保存。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是:所述的活化是将工作菌种库中的菌种在斜面培养基中进行划线培养24h，然后接种于50ml液体培养基中摇床活化培养6-8h，所述的斜面培养基包括:蛋白胨1%_1.5%，酵母抽提粉0.5%-1%，NaCl 0.5%-1%，琼脂粉 1.5%-2.0%, ρΗ6.8-7.0。
4.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是:所述的摇瓶培养是指将摇床活化培养后的菌种转接于500ml液体培养基中摇床培养6-8h，制得摇瓶种子液，所述的培养液包括蛋白胨1%_1.5%，酵母抽提粉0.5%-1%，NaCl 0.5%_1%，pH6.8-7.00
5.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是:所述的种子罐培养是将摇瓶种子液以1%_2%的比例接种于灭过菌的种子罐中，通气搅拌培养4-6h，培养条件:转速200-400rpm，通气量0.5-1.5vvm，温度35_37°C，罐压0.03-0.07MPa，所述的种子罐培养的培养基包括:蛋白胨1%_1.5%，酵母抽提粉1.5%-2.0%，NaCl 0.5%_1%，葡萄糖1%-2%，KH2PO4 0.05%-0.1%，K2HPO4 0.l%-0.3%, pH6.8-7.0。
6.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是:所述的发酵罐培养是将种子罐中种子液以1%_2%的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养，初始培养条件:转速100_120rpm，通气量0.5-1.0vvm,温度35-37 °C，罐压0.03-0.07MPa,当溶氧低于20%后，逐步提高转速至400rpm,通气量至2.0vvm,控制pH7.0-7.1，根据pH调整补料，发酵0D600至30以上时，加入诱导剂，降温并继续培养10-16h,初始培养基包括:蛋白胨1%_2%，酵母抽提粉1.5%-2.5%，NaCl 0.5%_1%，葡萄糖 0.5%-1%，KH2PO4 0.15%-0.25%, K2HPO4 0.3%-0.4%, MgSO4 0.05%-0.1%，pH 6.8-7.0 ;补料培养基包括:蛋白胨3%-5%，酵母抽提粉6%-8%，甘油10%-20%，ZnSO4 0.4%-0.8%, CaCl20.3%-0.5%, CoCl2 0.l%-0.3%, MgSO4 1%_3%，ρΗ5.0-5.2。
7.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌高密度发酵的方法，其特征是:所述的当菌体生长至一定阶段后加入诱导剂，并降温发酵至结束是指发酵0D_至30以上时加入诱导剂，加入诱导剂后将发酵罐温度由35-37°C降为25-27°C，所述的诱导剂为0.2% L-阿拉伯糖和/或ImM异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷。
【文档编号】C12N1/04GK104293668SQ201310299951
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月17日 优先权日:2013年7月17日
【发明者】陈令伟 申请人:南京朗恩生物科技有限公司