一种毒三素链霉菌及其在制备利普司他汀中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种毒三素链霉菌(Streptomyces?toxytricini?ST-5423)及其应用，该菌株由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC?M2013312，保藏日期为：2013年07月04日。本发明还公开了一种用此菌株发酵制备奥利司他中间体的方法。本发明提供的发酵工艺经过10吨和30吨发酵罐的生产实践，证明其生产能力稳定，发酵单位高且发酵副产物相对较少，大大地降低了后提取的难度，适宜于工业化大生产且获得的奥利司他产品质量高。
【专利说明】—种毒三素链霉菌及其在制备利普司他汀中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新型微生物及其用途和应用，尤其涉及一种毒三素链霉菌及其在制备利普司他汀中的应用。
【背景技术】
[0002]利普司他汀为发酵产物,通过毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)发酵液培养，得到发酵滤液，再通过提取、浓缩得到利普司他汀浓缩液，经一系列纯化工艺如氢化、结晶、离心等可最终获得奥利司他成品。而奥利司他是一种长效和强效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活而发挥治疗作用，失活的酶不能将食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解为可吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身体吸收，从而达到减少热量摄入，控制体重的目的。服用奥利司他可以降低与肥胖相关的危险因素和与肥胖相关的其它疾病的发病率，包括高胆固醇血症、2型糖尿病等。
[0003]一般的利普司他汀产生菌，生产能力不稳定，产量较低，发酵副产物较多，杂质较多，导致后期提取、氢化、纯化成奥利司他的工艺较为复杂，大大地增加了后序的提纯难度，难以获得高纯度的最终产物，从而无法产业化生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对上述问题，提供一种发酵单位高、能稳定生产、产量高且副产物少的利普司他汀产生菌。
[0005]一种毒三素链霉菌ST-5423，分类命名为毒三素链霉菌ST-5423 (Streptomycestoxytricini ST-5423)，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为:CCTCC M2013312，保藏日期为:2013年07月04日。
[0006]毒三素链霉菌ST-5423的菌株的菌落特征:基内菌丝发育良好，无色，菌丝细长分枝，直径为0.8~0.9 μ m ;气生菌丝生长丰茂、粉状，孢子丝着生在气生菌丝体上，孢子丝直、柔曲,孢子呈椭圆形至柱形,表面光滑,直径为0.65~1.0X 1.0~2.0 μ m,成熟孢子链孢子个数在10个以上。酵母浸出物淀粉琼脂:气丝白色至肉桂粉色。
[0007]根据微生物形态学及国外相关资料的描述，结合毒三素链霉菌ST-5423的菌株的各种培养特征和形态特征，该毒三素链霉菌ST-5423的菌株应属于毒三素链霉菌属，定名为 Streptomyces toxytricini ST-5423。
[0008]本发明的另一个目的是提供该菌株在制备利普司他汀中的应用。
[0009]毒三素链霉菌ST-5423的菌株可应用于发酵制备利普司他汀。 该制备方法包括下列步骤:
[0010]a.发酵菌株米用毒三素链霉菌ST-5423的菌株；
[0011]b.菌株培养:按常规方法制备的斜面，挖取斜面菌苔块，接入摇瓶进行种子培养得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于摇瓶发酵培养基中或种子罐中培养；将种子罐培养液接种于发酵罐培养基培养，收集发酵液；优选在发酵培养过程中无需进行补料，待种子罐菌丝生长良好接入发酵罐后，根据发酵液实际情况从pH、菌浓、搅拌转速、溶氧及菌丝镜检情况等方面来控制发酵过程即可。
[0012]c.发酵产物提取:提取、浓缩、氢化、结晶、制备柱、结晶和干燥。
[0013]其中所述的步骤b为:按常规方法制备的斜面，挖取斜面菌苔块接入摇瓶种子培养基，150~250rpm，培养24~48小时，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.1~2%的接种量接种于种子罐。搅拌速度80~120rpm，培养24~48h ;将种子罐培养液按发酵培养基体积5~15%的量接种于发酵罐培养基，搅拌速度120~200rpm，发酵培养130~240小时，收集发酵液；其中培养温度均为26~28°C。
[0014]本发明还公开了培养基:按重量体积比计，摇瓶、种子罐培养过程中的碳源为
0.2~5.0%，优选0.5~4.5%，最优选为0.5~3.0% ;氮源为0.2~4.0%，优选0.5~
3.5%，最优选为0.5~3.0% ;无机盐为0.02~2.0%，优选0.02~1.5%，最优选0.02~
1.3% ;其余为水；
[0015]其中碳源选自麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片的一种或几种；优选麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种；最优选麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一种或几种。
[0016]其中氮源选自黄豆饼粉、生豆粉、豆柏粉、玉米浆、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、肉胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物一种或几种；优选黄豆饼粉、生豆粉、豆柏粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、酵母浸出物、酵母抽提物中的一种或几种；更优选生豆粉、豆柏粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、植物性蛋白胨、酵母浸出物中的一种或几种。
[0017]其中无机盐选自K2HPO4、NaCl、NaNO3、ZnSO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4 中的一种或几种；优选 K2HPO4, ZnSO4^MgSO4, FeSO4, KH2PO4 中的一种或几种；最优选 ZnSO4,MgSO4, FeSO4, KH2PO4中的一种或几种。
[0018]其中，发酵培养过程中，按重量体积比计，碳源为1.5~15%，优选2.5~13%，最优选5~11%;氮源为0.5~7.0%，优选0.7~5%，最优选I~3%;无机盐为0.02~2.0%，优选0.02~1.6%，最优选0.04~1.0% ;其余为水；
[0019]发酵培养过程中的培养基物料选择如下:
[0020]碳源选自麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、糊精、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种；优选麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种，最优选淀粉、可溶性淀粉、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖中的一种或几种。
[0021]氮源选自黄豆饼粉、生豆粉、豆柏粉、玉米浆、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、肉胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中的一种或几种；优选黄豆饼粉、生豆粉、豆柏粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中一种或几种；更优选为生豆粉、豆柏粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、植物性蛋白胨、酵母浸出物中一种或几种。
[0022]无机盐选自K2HPO4、NaCl、NaNO3、ZnSO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4 中的一种或几种；优选K2HPO4,ZnSO4,MgSO4,FeSO4,KH2PO4 中的一种或几种；最优选 ZnSO4,MgSO4,FeSO4,KH2PO4 中的一种或几种。
[0023]经发酵完成放罐后，对发酵产物进行提取，通过氢化、结晶，再进行制备柱纯化后可以获得纯度达98%以上的奥利司他。
[0024]本发明所公开的毒三素链霉菌ST-5423是目前用于生产的一种高单位的利普司他汀产生菌，发酵性能优良，可用于大规模生产。发酵过程是利普司他汀(奥利司他)生产的重要环节，其发酵水平与工艺优劣直接相关。本发明提供的发酵工艺经过摇瓶、小试、中试及10吨、30吨生产发酵罐进行试验及生产，其生产能力稳定。经检测，用本发明提供的菌株及发酵培养方法制备的利普司他汀单位可高达900(^g/ml或以上，从而为后续的工业化生产提供了良好的基础。同时本发明的发酵副产物相对较少，并降低了后提取的难度，提取和纯化的工艺相对简单，大大提高了收率和纯度，在工业化生产上更具优势。
[0025]菌株保藏情况:保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为 CCTCC M2013312，分类命名为毒三素链霉菌 ST-5423 (Streptomyces toxytriciniST-5423)，保藏H期为2013年07月04日。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但不能将方案中所涉及的方法及技术参数理解为对本发明的限制。
[0027]实施例1:毒三素链霉菌ST-5423的培养特征
[0028]将毒三素链霉菌ST-5423的菌株接种于甘油天冬酰氨琼脂、酵母膏麦芽浸出液琼脂等用于观察形态特征的培养基。28°C培养一定的时间5、8、10天，观察并进行描述，结果见表1。
[0029]表1、毒三素链霉菌ST-5423的菌株在各种培养基上的菌落特征
[0030]
培养基I生长情况I气生菌丝I可溶性色素
酵母膏麦芽浸出液琼脂~S白至肉桂粉色 ImE
无机盐淀粉琼脂S白至肉桂粉色 ?Ε
燕麦粉琼脂S白至肉桂粉色 ?Ε
甘油天门冬素琼脂白至肉桂粉色 ImE
蛋白胨酵母膏培养基 tl?Κ
酪氨酸琼脂中度白色无色
高氏一号琼脂S白至粉红色?Ε
葡萄糖天门冬素琼脂 tS白至粉红色浅黄色
蔗糖察式琼脂￥1?Κ
【权利要求】
1.一种菌株，分类命名为毒三素链霉菌ST-5423 (Streptomyces toxytriciniST-5423)，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M2013312，保藏日期为:2013年07月04日。
2.如权利要求1所述的保藏号为CCTCCM2013312的毒三素链霉菌株在发酵制备利普司他汀中的应用。
3.应用如权利要求1所述的保藏号为CCTCCM2013312的菌株发酵制备利普司他汀的方法，其特征在于包括下列步骤: a.发酵菌株采用保藏号为CCTCCM2013312的毒三素链霉菌株； b、菌株培养: 按常规方法制备斜面，挖取斜面菌苔块，接入摇瓶种子培养基，150~250rpm，培养24~48小时，得摇瓶种子液； 将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.1~2%的接种量接种于种子罐，搅拌转速80~120rpm，培养 24 ~48h ； 将种子罐培养液按发酵培养基体积5~15%的量接种于发酵罐培养基，搅拌转速120~200rpm，发酵培养130~240小时，收集发酵液； 其中培养温度均为26~28°C。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是按重量体积比计， 摇瓶种子、种子罐培养基各组分在培养基中的比例为:碳源为0.2~5.0%，氮源为 0.2~4.0%，无机盐为0.02~2.0%，其余为水； 其中碳源选自麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种；氮源选自黄豆饼粉、生豆粉、豆柏粉、玉米浆、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、肉胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中的一种或几种；无机盐选自 K2HP04、NaCl、NaNO3> ZnSO4, MgSO4, FeSO4, KH2PO4 中的一种或几种； 发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为:碳源为1.5~15%，氮源为0.5~7.0%，无机盐为0.02~2.0%，其余为水； 其中碳源选自麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、糊精、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种；所述的氮源选自黄豆饼粉、生豆粉、豆柏粉、玉米浆、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、肉胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中的一种或几种；无机盐选自K2HP04、NaCl, FeS04、ZnSO4, NaN03、MgSO4, CaCO3中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是按重量体积比计，摇瓶种子、种子罐培养基各组分在培养基中的比例为:碳源为0.5~4.5%，优选为0.5~3.0% ;氮源为0.5~3.5%，优选为0.5~3.0% ;无机盐为0.02~1.5%，优选为0.02~1.3% ;其余为水。
6.如权利要求4-5任一权利要求所述的方法，其特征是所述摇瓶种子、种子罐培养基中碳源为麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种；优选为麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一种或几种； 氮源为黄豆饼粉、生豆粉、豆柏粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、酵母浸出物、酵母抽提物中一种或几种；优选为黄豆饼粉、生豆粉、豆柏粉、酵母抽提物、植物性蛋白胨、酵母浸出物中的一种或几种；无机盐为 K2HP04、ZnSO4, MgSO4, FeSO4, KH2PO4 中的一种或几种；优选为 ZnS04、MgSO4,FeSO4, KH2PO4中的一种或几种。
7.如权利要求4所述的方法，其特征是按重量体积比计，发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为:碳源为2.5~13%，优选为5~11% ;氮源为0.7~5%，优选为I~3% ;无机盐为0.02~1.6%，优选为0.04~1.0% ;其余为水。
8.如权利要求4、7任一权利要求所述的方法，其特征是所述的发酵罐培养基中的碳源为麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片、大豆卵磷脂中的一种或几种；优选为淀粉、可溶性淀粉、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、葡萄糖、大豆卵磷脂中的一种或几种。
9.如权利要求4、7任一权利要求所述的方法，其特征是所述的发酵罐培养基中的氮源为黄豆饼粉、生豆粉、豆柏粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中的一种或几种；优选为生豆粉、豆柏粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、植物性蛋白胨、酵母浸出物中的一种或几种。
10.如权利要求4、7任一权利要求所述的方法，其特征是所述的发酵罐培养基中的无机盐为 K2HP04、ZnSO4, MgSO4, FeSO4, KH2PO4 中的一种或几种，优选为 ZnS04、MgSO4, FeSO4,KH2PO4中的一种或几 种 。
【文档编号】C12R1/465GK103468603SQ201310302148
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月17日 优先权日:2013年7月17日
【发明者】李立似, 方军, 蒋彩霞, 金利琴, 何金芳, 刘金国 申请人:杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司, 杭州中美华东制药有限公司