一种检测食品中马肉成分的方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测食品中马肉成分的方法。本发明提供了用于检测食品中马肉成分的6对不同目的片段的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6、NO.7、NO.8、NO.9、NO.10、NO.11、NO.12所示。本发明还提供了含有上述引物组的试剂盒。本发明的试剂盒可以快速、准确检测肉制品中是否掺杂马肉，其中对于检测深加工肉制品效果尤为明显。本发明还可为食品检验人员在对比检测其他肉源时提供灵活多变的目的片段，进而提高检测效率，另外本发明提供的引物也可作为实时荧光定量PCR的引物，对食品中掺杂的马肉成分进行定量，更好的应用于食品检测领域。
【专利说明】-种检测食品中马肉成分的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品检测领域和分子生物学【技术领域】，具体来说，涉及一种利用PCR 技术检测食品中马肉成分的方法。
【背景技术】
[0002] 2013年1月中旬英国和爱尔兰发现部分超市出售的牛肉汉堡中掺杂了马肉和其 他肉类，其中在被检测的27种汉堡中，有10种含有马肉。此后，"挂牛头卖马肉"的事件持 续扩大，多个欧洲国家卷入丑闻中，消费者对食品工业的信任遭受了严重的打击，欧盟也为 此对成员国的加工牛肉展开"DNA检测"以消除"马肉风波"忧虑，恢复消费者信心。
[0003] 在我国，近年来食品安全问题群众反映强烈、社会关注度高。一些食品生产商为一 己私利，投机取巧、以次充好、偷工减料，在损害消费者利益的同时，严重危害人们的生命健 康。此外，我国还没有健全统一的熟肉制品快速检测标准。通常对于生肉制品我们可以通 过味道、色泽、肌肉纹理等进行检测，但对于经过加工的熟肉制品我们很难用这种传统的理 化方法进行检测。
[0004] PCR技术（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应）作为一种快速而又灵敏 度高、特异性强的分子生物学检测手段，已广泛应用于诸多检测领域。同时由于线粒体DNA 为核外遗传物质，种内高度保守，同时与核DNA相比，具有分子结构简单、母性遗传方式遗 传、进化速度快等特点，大量存在于组织细胞中，具有抗腐蚀性，使用少量样品即可进行PCR 反应。本发明利用PCR技术，扩增马的线粒体DNA (mtDNA)达到检测目的。检测手段不仅简 便易行，而且时间周期短、效率高、适用于食品快速检测领域。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于，提供一组优选后的检测食品中马肉成分的PCR引物对。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种含有上述引物组，用于检测食品中马肉成分的试 剂盒。
[0007] 本发明的第三个目的是为食品检验人员对比检测其他肉源提供灵活多变的选择， 进而提高检测效率，更好的应用于食品检测领域。
[0008] 本发明的第四个目的是为进行实时荧光定量PCR，检测食品中掺杂马肉成分的含 量提供引物对。
[0009] 本发明的技术方案概述如下：
[0010] 一种检测食品中马肉成分的PCR引物组，由1号引物对、2号引物对、3号引物对、4 号引物对、5号引物对、6号引物对组成，所述1号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1 和2所示，所述2号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 3和4所示，所述3号引物对 的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5和6所不，所述4号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 7和8所示，所述5号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 9和10所示，所述6号引 物对的核苷酸序列分另如SEQ ID NO. 11和12所示。
[0011] 一种检测食品中马肉成分的试剂盒，包括引物组、PCR管、DNA聚合酶、PCR缓冲液、 dNTPs，所述引物组由1号引物对、2号引物对、3号引物对、4号引物对、5号引物对、6号引物 对组成，所述1号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1和2所示，所述2号引物对的核 苷酸序列分别如SEQ ID NO. 3和4所示，所述3号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5 和6所示，所述4号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 7和8所示，所述5号引物对的 核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 9和10所示，所述6号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 11和12所示。
[0012] 本发明的引物组扩增的目的片段大小如下，1号引物对：183bp ;2号引物对： 202bp ;3号引物对：231bp ;4号引物对：266bp ;5号引物对：268bp ;6号引物对：300bp。
[0013] 本发明的试剂盒可以快速、准确、灵敏的检测肉制品中的马肉成分。特别是针对线 粒体DNA降解严重的深加工肉制品，因提供引物的目的片段均为小片段，可以很好的进行 检测，进而克服了目的片段过大，在实际检测中无法针对熟肉制品进行检测的情况。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1-图6分别为本发明中涉及的6对引物，S卩1号引物对、2号引物对、3号引物 对、4号引物对、5号引物对、6号引物对，分别对8个物种的肉制品基因组DNA进行PCR扩增 的结果，M 为 DL2000DNA Ma rker (从下往上，100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp); 1-8分别为猪、牛、羊、鸡、鸭、马、鹿、狗的基因组DNA。
[0015] 图7为本发明中涉及的6对引物对经深加工的市售马肉制品基因组DNA的PCR扩 增结果，]?为01^20000嫩1&^1?51'(从下往上，10(^口、25(^口、50(^口、75(^口、100(^口、200(^口） ； 1、2、3、4、5、6分别为1号引物对、2号引物对、3号引物对、4号引物对、5号引物对、6号引物 对。
【具体实施方式】
[0016] 以下通过具体实施例对本发明进一步说明。
[0017] 实施例1
[0018] 本发明所提供的6对引物，经PCR反应扩增的目的片段长度如下，1号引物对： 183bp ;2号引物对：202bp ;3号引物对：231bp ;4号引物对：266bp ;5号引物对：268bp ;6号 引物对：300bp。
[0019] 1.肉制品的基因组DNA提取
[0020] 将样品处理成肉末状，取30mg加入1.5mlEP管中；加入500μ 1裂解液（1M tris-Hcl ΡΗ8. 0 ;0· 5Μ EDTA ΡΗ8. 0 ;5M Nacl ;0· 5 % N-Lanroyl SarcOsine ;蛋白酶 K ; RNaseA)70°C消化0. 5-lh或50°C过夜消化，离心（12000r/min，5-15min)，取上清；加等体 积的酚、氯仿与异戊醇（25 : 24 : 1)抽提；取400μ1水相，加 ^ylNacLlml冰乙醇， 冰上放置30min ;离心（12000r/min，5min)，弃上清；用lmUO%无水乙醇洗3次，瞭干；力口 70-100μ 1TE，静置 30min。
[0021] 所提基因组DNA放置于-20°C冰箱中保存，为以后实验使用。
[0022] 2.引物设计
[0023] 首先从 NCBI (National Center for Biotechnology Information，美国国家生物 技术信息中心）的Genbank数据库中找到马与牛的线粒体DNA全序列（马Equus caballus 登陆号：NC_001640. 1 ;牛Bos Taurus登陆号：NC_006853. 1)，进行序列比对。再分别将马 的线粒体DNA全序列、马线粒体DNA编码的十三个多肽序列和马线粒体DNA序列分解成3 段、4段、5段、14段后的序列放入Primerf. 0中进行引物设计。在设计引物的同时参考马 (Equus caballus)与牛（Bos Taurus)的序列对比结果，保证设计出的用于扩增马线粒体 基因组片段的引物序列不与牛线粒体基因组任意序列匹配。同时考虑到熟肉制品的基因组 DNA降解明显，因而所设引物范围为100bp-400bp。并且为了增强引物的特异性，所设引物 的TM值均在55°C-62°C之间。根据以上条件，挑选出数十对引物进行合成。以猪、牛、羊、 鸡、鸭、马、鹿、狗全基因组DNA为模板，经PCR扩增检验引物特异性与产物量，挑选最优引物 对，即本发明所提供的6对引物。筛选结果如下，
[0024] 1号引物对：
[0025] F :5' -CCTTCACCACCACATCTCTA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 1 所示）
[0026] R :5' -AGATGATTCGGGTACTGTAGAC-3'（序列表中 SEQ ID NO. 2 所示）
[0027] 2号引物对：
[0028] F :5' -AACCCCACAAAACTAACAACA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 3 所示）
[0029] R :5' -GGGCTGGTAGGTCAATAAAA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 4 所示）
[0030] 3号引物对：
[0031] F :5' -ACCAAACCCACGCTTACCAC-3'（序列表中 SEQ ID NO. 5 所示）
[0032] R :5' -GGAGTCCCTTTTGAACGATTGA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 6 所示）
[0033] 4号引物对：
[0034] F :5' -AGACCCCAACAAGCAACGAT-3'（序列表中 SEQ ID NO. 7 所示）
[0035] R :5' -GCAGTATCCTGAGGTATGGGTG-3'（序列表中 SEQ ID NO. 8 所示）
[0036] 5号引物对：
[0037] F :5' -CAAGACGCAACATCCCCTATT-3'（序列表中 SEQ ID NO. 9 所示）
[0038] R :5' -TTTTGACTGTGAGGGACGGA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 10 所示）
[0039] 6号引物对：
[0040] F :5-ACCACAAAGACATCGGCACT-3 (序列表中 SEQ ID NO. 11 所示）
[0041] R :5-GTAGGAATGATGGGGGAAGTAA-3 (序列表中 SEQ ID NO. 12 所示）
[0042] 3.弓丨物特异性验证
[0043] 提取猪、牛、羊、鸡、鸭、马、鹿、狗8个物种的肉制品中基因组DNA，以此为模板进行 PCR反应。
[0044] 反应体系：20μ 1 (模板：1μ I ;dNTP0· 4μ I ;10XPCR buffer2y 1 ;上下游引物分 别 0· 8 μ I ;rTaq0. 4 μ I ;ddH2014. 6 μ I)。
[0045] 反应条件：
[0046] 第一步：94°C 5min ;
[0047] 第二步：94°C 30s，62°C 30s，72°C 30s30 个循环
[0048] 第三步：72°C 5min。
[0049] PCR产物-20°C保存，备用。
[0050] 4.琼脂糖凝胶电泳验证
[0051] 首先配制I %琼脂糖凝胶，在微波炉中加热致透亮，取出稍微冷却后加 EB，充分混 匀倒入已插好梳子的板上，静置30min后即可使用。
[0052] 凝胶后将板取出，放入电泳槽中，每个点样孔上样2μ 1产物+1μ 16Xlodding buffer,上样后邻近孔点3 μ IDNA marker。
[0053] 最后，电压120V，25min进行凝胶电泳。PCR扩增结果用凝胶成相系统分析，结果如 图1-图5所示。其中，图1为1号引物对扩增结果；图2为2号引物对扩增结果；图3为3 号引物对扩增结果；图4为4号引物对扩增结果；图5为5号引物对扩增结果；图6为6号 引物对扩增结果；M 为 DL2000DNA Marker (从下往上，IOObp、250bp、500bp、750bp、IOOObp、 2000bp) ;1-8分别为猪、牛、羊、鸡、鸭、马、鹿、狗的基因组DNA。
[0054] 实施例2
[0055] 对市售经深加工的马肉制品进行验证
[0056] 1.提取马肉的基因组DNA :方法同实施例1中提肉制品的基因组DNA。
[0057] 2. PCR 验证：
[0058] 以上述所提的基因组DNA为模板，用本发明中提供的6对引物分别进行PCR。
[0059] 反应体系：20μ 1 (模板：1μ 1 ;(1ΝΤΡ0·4μ I ;10XPCR buffer21y 1 ;上下游引物分 别 0· 8 μ I ;rTaqO. 4 μ I ;ddH2014. 6 μ 1)。
[0060] 反应条件：
[0061] 第一步：94°C 5min ;
[0062] 第二步：94°C 30s，62°C 30s，72°C 30s30 个循环
[0063] 第三步：72°C 5min。
[0064] 3.琼脂糖凝胶电泳验证
[0065] 配制2%琼脂糖凝胶，制胶过程同实施例I中所述。电压50V，电泳lh，PCR扩增结 果用凝胶成相系统进行分析，结果如图6所示。其中，M为DL2000DNA Marker (从下往上， IOObp、250bp、500bp、750bp、IOOObp、2000bp) ; 1、2、3、4、5、6 分别为 1 号引物对、2 号引物对、 3号引物对、4号引物对、5号引物对、6号引物对。
【权利要求】
1. 用于检测食品中马肉成分的引物组，其特征在于，由1号引物对、2号引物对、3号引 物对、4号引物对、5号引物对、6号引物对组成，所述1号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1和2所示，所述2号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 3和4所示，所述3号 引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5和6所示，所述4号引物对的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO. 7和8所示，所述5号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 9和10所示，所述 6号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 11和12所示。
2. 用于检测食品中马肉成分的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述引物组，还 包括PCR管、DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，含有1号引物对可扩增183bp，其核苷 酸序列为： 上游引物：5' -CCTTCACCACCACATCTCTA-3'（SEQ ID NO. 1) 下游引物：5' -AGATGATTCGGGTACTGTAGAC-3'（SEQ ID N0.2)。
4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，含有2号引物对可扩增202bp，其核苷 酸序列为： 上游引物：5'-AACCCCACAAAACTAACAACA-3'（SEQ ID NO. 3) 下游引物：5'-GGGCTGGTAGGTCAATAAAA-3'（SEQ ID N0.4)。
5. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，含有3号引物对可扩增231bp，其核苷 酸序列为： 上游引物：5' -ACCAAACCCACGCTTACCAC-3'（SEQ ID N0.5) 下游引物：5' -GGAGTCCCTTTTGAACGATTGA-3'（SEQ ID N0.6)。
6. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，含有4号引物对可扩增266bp，其核苷 酸序列为： 上游引物：5' -AGACCCCAACAAGCAACGAT-3'（SEQ ID N0.7) 下游引物：5' -GCAGTATCCTGAGGTATGGGTG-3'（SEQ ID NO·8)。
7. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，含有5号引物对可扩增268bp，其核苷 酸序列为： 上游引物：5'-CAAGACGCACATCCCCTATT-3'（SEQ ID N0.9) 下游引物：5' -TTTTGACTGTGAGGGACGGA-3'（SEQ ID NO. 10)。
8. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，含有6号引物对可扩增300bp，其核苷 酸序列为： 上游引物：5' -ACCACAAAGACATCGGCACT-3'（SEQ ID NO. 11) 下游引物：5' -GTAGGAATGATGGGGGAAGTAA-3'（SEQ ID NO. 12)。
9. 根据权利要求1所述的6个引物对，其特征在于，扩增目的片段183bp、202bp、 231bp、266bp、268bp、300bp可用于实时荧光定量，对食品中的马肉成分进行定量。
10. -种检测食品中马肉成分的方法，其特征在于，包括步骤如下： 1)提取肉制品中的基因组DNA: 将样品处理成肉末状，取30mg加入1. 5mlEP管中；加入500μ 1裂解液（1M tris-Hcl PH8. 0 ;0· 5M EDTA PH8. 0 ;5M Nacl ;0· 5%N-Lanroyl Sarcosine ;蛋白酶K ;RNaseA)7(TC消 化0. 5-lh或5(TC过夜消化；离心（12000r/min，5-15min)，取上清；加等体积的酚、氯仿与 异戊醇（25 : 24 : 1)抽提；取400μ1水相，加40ylNacl，lml冰乙醇，冰上放置30min; 离心（12000r/min，5min)，弃上清；用lml70%无水乙醇洗3次，晾干；加 70-100μlTE，静置 30min〇 2) 以所提基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增； 3) 对PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳进行检验，并使用凝胶成相系统分析。
【文档编号】C12Q1/68GK104293899SQ201310304040
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2013年7月19日
【发明者】聂凌云, 魏迪, 程东庆, 池振奋, 高敬, 张莹莹, 赵永良, 聂凌虎 申请人:聂凌云