一种快速区分稻曲病菌交配型的分子检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速区分稻曲病菌（Villosiclavavirens）交配型的分子检测方法，包括收集待检菌丝和组织样品，采用CTAB法提取所需检测样本的基因组DNA，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，PCR扩增，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用标记判断DNA片段的大小，涉及的检测样本为：稻曲病菌分生孢子单孢菌株或子囊孢子单孢菌株或菌核，所述的PCR扩增为多重PCR扩增，在多重PCR扩增体系中涉及的两对扩增引物是Vm1-F/Vm1-R和Vm2-F/Vm2-R，其中，Vm1-F为SEQIDNO.1，Vm1-R为SEQIDNO.2，Vm2-F为SEQIDNO.3，Vm2-R为SEQIDNO.4。
【专利说明】—种快速区分稻曲病菌交配型的分子检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物保护领域,是一种快速区别稻曲病菌(K/77(Osic7ara virens)交配型的分子检测方法。
技术背景
[0002]真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性繁殖的遗传基础，同宗配合的子囊真菌通常具有一个交配型基因座；而大多数异宗配合的丝状子囊真菌有一对高度异源的交配型基因座。在异宗配合子囊真菌中，异源的交配型基因座分别为姻/7-7和姻77-J?，其中MATl-1基因座至少含有一个具有α -结构域的交配型基因-7，而姻77-之交配型基因座则至少含有一个具有高泳动蛋白家族(HMG)结构域的交配型基因通过检测mat 1-1-1取mat 1-2-1交配型基因可确定异宗配合子囊真菌的交配型。
[0003]由稻曲病菌(有性态:virens.,无-.Ustilaginiodea virens、 染引起的水稻稻曲病危害 水稻穗部并产生毒素，严重影响稻米产量和品质。其在侵染后期可产生菌核，在田间越冬后于次年侵染适期可萌发进行有性繁殖产生子囊孢子，成为稻曲病的主要初侵染源。最新研究显示，稻曲病菌是异宗配合真菌，具有姻/7-7和姻77-J?两种交配型，含有姻/7-7和姻77-J?交配型稻曲病菌的菌核越冬后可萌发并产生子囊孢子；而仅含韦MATl-1交配型稻曲病菌的菌核不能萌发产生子座及子囊孢子。因此，田间可育菌核是稻曲病流行的关键因子之一，田间可育菌核数量的统计是建立病害流行预警体系的关键基础。
[0004] 申请人:在前期研究中根据Yokoyama等扩增到的稻曲病菌基因部分序列(Genbank登录号:AB124632)和使用简并引物扩增到的稻曲病菌交配型基因? ?7-7-7部分DNA序列(Genbank登录号..JQ844754)，设计了两对特异性引物可用于检测稻曲病菌的交配型(植物病理学报，2012，42 (6):561-568)，缩短了稻曲病菌交配型检测的周期，但该方法需要将一个稻曲病菌DNA样本进行两次PCR扩增和凝胶电泳，在检测大批量样本时操作较为繁琐。
[0005]通过多重PCR扩增体系对稻曲病菌DNA样本进行交配型检测，目前未见报道。该方法可快速检测稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和菌核的交配型，适用于稻曲病流行预测及植物病理学领域的科学研究。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于:针对目前对稻曲病菌交配型检测方法中必须通过两次PCR扩增，检测步骤相对繁琐的缺陷，本发明提供一种更快速、且易于操作的检测稻曲病菌交配型的分子检测方法。
[0007]本发明的目的是这样实现的:一种快速区分稻曲病菌(Villosiclava virens)交配型的分子检测方法，包括收集待检菌丝和组织样品，采用CTAB法提取所需检测样本的基因组DNA，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，多重PCR扩增，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用标记判断DNA片段的大小，其特征在于，检测样本为:稻曲病菌分生孢子单孢菌株或子囊孢子单孢菌株或含有稻曲病菌的菌核，多重PCR扩增体系中涉及的两对扩增引物是 Vml-F/Vml-R和 Vm2-F/Vm2-R，其中，Vml-F 为 SEQ ID N0.1，Vml-R 为 SEQ ID N0.2,Vm2-F为 SEQ ID N0.3，Vm2-R 为 SEQ ID N0.4。
[0008]在本发明中，多重PCR扩增体系为:取5uL不含Mg2+的10XPCR Buffer稀释10倍；浓度为 25mM 的 MgCl2，3y L ;dNTP Mixture (2.5mM each), 4 μ L ;取浓度为 l_5ng/μ L模板DNA I μ L ;引物Vml-F和Vml-R以及引物Vm2_F和Vm2_R各I μ L ；Taq DNA聚合酶，
0.25μ L ;PCR 扩增程序为:94。C，5min;35X (94。C,30s ；65.4° C，30s;72。C，30s);72。C，5min;4。C 保存。
[0009]在本发明中，MATl-1交配型的稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和含有姻77-7交配型菌丝的菌核的可得到180bp左右的DNA条带；而姻/7-J?交配型的稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和含有姻交配型菌丝的菌核的可得到280bp左右的DNA条带；据此获得被测稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和菌核的交配型。姻77-7和姻/7-J?交配型稻曲病菌菌株可有性繁殖产生子囊孢子，同时含有姻77-7和姻77-J?交配型菌丝的菌核可萌发产生子座及子囊孢子，仅含有.77-7交配型稻曲病菌菌核的分生孢子单孢菌株不能萌发产生子座及子囊孢子。
[0010]本发明的优点:使用多重PCR方法将姻77-7和姻77-J?检测特异性引物置于同一个PCR反应体系中，使用一次PCR和凝胶电泳即可检测判断稻曲病菌样品的交配型，减少了检测步骤并节约检测成本，适用于大批量的稻曲病菌样本交配型的快速检测，为稻曲病菌可育菌核的检测以及植物保护领域研究中菌株交配型的测定提供了更便捷更快速的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1本发明对稻曲病菌分生孢子单孢菌株交配型的检测的电泳图。
[0012]图2本发明对稻曲病菌子囊孢子单孢菌株交配型的检测的电泳图。
[0013]图3本发明对稻曲病菌菌核的交配型检测的电泳图。
【具体实施方式】
[0014]实施例1
克隆获取?部分DNA序列:
根据Yokoyama等扩增到的稻曲病菌基因210bp DNA序列(Genbank登录号:AB124632)，设计特异性巢式引物，它们是:
【权利要求】
1.一种快速区分稻曲病菌(KiJJo1SicJaFa rireas)交配型的分子检测方法,包括收集待检菌丝和组织样品，采用CTAB法提取所需检测样本的基因组DNA，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，PCR扩增，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用标记判断DNA片段的大小，其特征在于，检测样本为:稻曲病菌分生孢子单孢菌株或子囊孢子单孢菌株或菌核，所述的PCR扩增为多重PCR扩增，在多重PCR扩增体系中涉及的两对扩增引物是Vml-F/Vml-R和Vm2_F/Vm2-R，其中，Vml-F 为 SEQ ID N0.1，Vml-R 为 SEQ ID N0.2, Vm2_F 为 SEQ ID N0.3，Vm2_R 为SEQ ID N0.4。
2.根据权利要求1所述的一种快速区分稻曲病菌交配型的分子检测方法，其特征在于，多重PCR扩增体系为:不含Mg2+的IOXPCR Buffer，5uL;浓度为25mM的MgCl2，3yL;dNTP Mixture (2.5mM each)，4 μ L ;浓度为 l_5ng/ μ L 的模板 DNA，I μ L ;浓度为 IOmM 的引物 Vml-F 和 Vml-R 以及引物 Vm2_F 和 Vm2_R，各 I μ L ；Taq DNA 聚合酶，0.25 μ L ；d2H20 补足至50 μ L ;PCR扩增程序为:94° C，5min ;然后依序循环进行94° C，30s;65.4° C，30s;72° C，30s，循环次数为35次；再72° C，5min;4° C保存。
3.根据权利要求1或2所述的一种快速区分稻曲病菌交配型的分子检测方法，其特征在于，姻77-7交配型稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和含有姻/7-7交配型菌丝的菌核可得到ISObp左右的DNA条带，MAT1-2交配型稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和含有姻/7-J?交配型菌丝的菌核可得到280bp左右的DNA条带，据此获得被测稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株或菌核的交配型； 稻曲病菌姻/7-7和姻/7-J?交配型单孢菌株可配合进行有性繁殖；同时含有姻77-7和姻/7-J?交配型菌丝的稻曲病菌菌核可萌发形成子座并产生子囊孢子，为可育菌核；仅含有MATl-1交配型菌丝的菌核·不能萌发产生子座，为不可育菌核。
【文档编号】C12Q1/68GK103436605SQ201310306977
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月22日 优先权日:2013年7月22日
【发明者】于俊杰, 刘永锋, 尹小乐, 俞咪娜 申请人:江苏省农业科学院