棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及一种棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法，具体提供了用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的CAPS标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和3所示。本发明采用CAPS标记对棉花细胞质雄性不育恢复系材料进行了分子水平的多态性检测，该方法鉴定速度快、准确率高、操作简单，非常适用于棉花细胞质雄性不育恢复系材料纯度的室内鉴定和新恢复系材料的分子标记辅助选育。
【专利说明】棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的分子标记，扩 增其的引物以及分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 杂种优势的研究和利用在提高棉花产量、改进品质、提高抗性等方面已经发挥了 显著效果。目前，杂交棉已经在我国长江流域等育苗移栽地区广泛栽种；在黄河流域棉区， 甚至新疆等直播棉区也正在大力发展杂交棉。然而，人工去雄辅助授粉杂交制种法是杂交 棉种子的主要生产方式（占90%以上)。随着国家城镇化发展的需求，棉花主产区及其周边 地区的劳动力成本逐年提高，从而导致种子生产成本越来越高，许多从事杂交棉制种的相 关种子企业难以为继，最终大大限制了杂交棉的进一步大规模推广利用。利用"三系法"制 种已经在多种作物中得到成功应用和推广，与人工去雄辅助授粉方式相比，该方法具有程 序简便，成本仅为人工去雄杂交的30-40%，适合大面积制种等独特优势。因而，三系杂交棉 花的大面积推广，对于提高植棉效益，增加棉农收益，稳定杂交棉种植面积等都具有重要意 义。虽然，三系杂交种（以哈克尼西棉细胞质雄性不育三系材料为主）的审定已经取得了一 定进展，但是受制于具有强恢复力的优良恢复系亲本资源匮乏的限制，目前，仍然没有实现 三系杂交棉的大面积推广。因此，在三系杂交棉选育过程中，具有强恢复力的优良恢复系选 育和改良是育种工作者长期研究的重点和难点。
[0003] 采用常规育种技术可以实现恢复系改良的目的，但是利用该方法需要年限长，而 且转育后每年都需要进行大量的田间测交和鉴定来确保恢复基因的存在，从而需要耗费大 量的棉田、人力和财力。另一方面，三系杂交种制种过程中，恢复系的纯度至关重要，一旦混 杂，将直接导致杂交种后代出现不育株的情况，严重影响棉花产量。常规育种过程中棉花细 胞质雄性不育恢复系选育田间鉴定检测方法所需时间长、消耗大、准确性差，因此，迫切需 要一种稳定可靠又快速的鉴定恢复系纯度和选育改良的方法。
[0004] 分子标记直接从DNA水平反映出核苷酸序列的差异，不受发育阶段、环境因素以 及基因是否表达的影响，具有遗传稳定等特点。目前，随着分子生物学的飞速发展，分子 标记检测技术已经发展出几十种技术可用于分子标记的筛选，比较常用的有RFLP、RAPD、 polymorphicsequence)标记技术是一种具有共显性、位点特异性、操作简单、成本低的简 单、经济、可靠的技术。与SSR等需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)和银染的分子标记 技术相比，该技术仅需通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，因此已经在种质鉴定、辅助育种、基 因鉴定和图谱构建等领域得到相当广泛的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是解决常规育种过程中棉花细胞质雄性不育恢复系选育田间鉴定 检测方法所需时间长、消耗大、准确性差等的问题，提供一种棉花细胞质雄性不育恢复系的 快速分子鉴定方法，从而可以加快棉花恢复系选育和改良进程，同时保证恢复系种子纯度。
[0006] 为了实现上述的目的，本发明利用前期筛选到的与恢复基因紧密连锁的SSR标
【权利要求】
1. 用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的分子标记，其特征在于，其含有一段特异的 片段，该特异片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，由核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和3所示 的引物经PCR扩增得到。
3. 权利要求1或2所述的分子标记在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。
4. 权利要求1或2所述的分子标记在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用。
5. 用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的CAPS标记引物，其特征在于，其为核苷酸序 列如SEQ ID NO. 2和3所示的引物。
6. 权利要求5所述的引物在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。
7. 权利要求5所述的引物在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用。
8. -种棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 用权利要求5所述的引物扩增待测棉花样品的基因组DNA，回收扩增产物； (2) 扩增产物经限制性内切酶酶切后，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳条带出 现184bp和124bp两个特异性条带，而没有出现317bp的扩增片段的待测样品为不含恢复 基因位点的棉花材料；若电泳条带出现317bp的同时，还出现184bp和124bp两个特异性 条带，则待测样品为恢复基因位点杂合的棉花材料；若电泳条带仅有317bp条带，没有出现 184bp和124bp这两个特异性条带，则待测样品为恢复基因位点纯合的棉花材料。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2)的内切酶为Dra I。
10. 如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，酶切时间为30min。
【文档编号】C12N15/11GK104342434SQ201310322542
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月29日 优先权日:2013年7月29日
【发明者】吴建勇, 邢朝柱, 郭立平, 戚廷香 申请人:中国农业科学院棉花研究所