一种检测生长素类农药或其结构类似物残留的方法
【专利摘要】本发明提供一种检测生长素类农药或其结构类似物残留的方法，其特征在于，该方法包括：（1）摘取苗期大豆叶片，立即把叶柄浸入液体样本中1小时，从液体样本中取出大豆叶片用于总RNA的提取；同时取清水处理大豆叶片作对照；（2）以SKIP16基因为内参，以GH3.6为标志基因，检测GH3基因在步骤1处理过的大豆体内的相对表达量；如果相对表达量大于5以上，则说明液体样本中含有生长素类农药或与生长素农药类似结构的农药残留。利用该方法可以高灵敏度的检测液体样本中的农药残留。
【专利说明】一种检测生长素类农药或其结构类似物残留的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农药残留检测方法，特别属于一种生长素类或结构类似物残留的检测方法。
【背景技术】
[0002]农产品中农药残留问题日益受到人们广泛的关注，而生长素类农药，尤其是二氯喹啉、2，4-D等除草剂在水稻等作物田连年大量使用，造成这类除草剂在农产品中残留超标。加强和建立对这类农药残留的检测方法和监测技术研究对保障人们健康，保护生态环境具有重要意义。
[0003]目前农产品中农药残留检测方法，大体上可分为两类。一类是理化检测法，它利用农药独特理化性质作为指标来确定农药的种类和浓度。如分光光度法、原子吸收光谱法、薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法、同位素标记法、核磁共振波谱法、毛细管电脉仪技术(CZE )，色质联用技术(GC-MS、HPLC-MS )，超临界流体色谱技术(SFC)，直接光谱分析技术等。但是，这些技术方法中最常用的是气相色谱法和液相色谱法，具有灵敏高、重现性好等优点，但是一些缺点使其应用受到限制，如仪器昂贵、检测成本高、仪器操作需专业人员，前处理要求较高，检测同期长等缺点。
[0004]另外一类是生物检测方法，其原理是利用农药独特的生物学效应作为检测农药的指标。首先，在个体或组织水平上，利用农药对敏感生物的独特的生长发育影响、如造成变色、畸形等表观的改变为指标来确定农药的种类和残留量。如用玉米或其它指示植物根长受抑制来检测土壤中磺酰脲类除草剂等。此法不需要仪器和前处理，对各种毒物都可以测定，但敏感生物不易获得且敏感性不易保持，不能精确定量分析。其次蛋白质水平上。如，根据有机磷类农药或氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱碱酯酶(AChE)的抑制效应，开发的速测卡和速测仪，但该方法只能用于有 机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂检测，其灵敏度受温度影响，结果需用标准仪器检验方法进一步确认。再如，利用抗原与抗体的特异性结合的免疫分析法:酶联免疫法(ELISA法)，特异性强，灵敏度高，但抗体制备比较困难，不能肯定试样中的农药品种时，有一定的盲目性，易出现假阴，假阳性现象。
[0005]生物检测方法比理化检测方法更简单环保，所以应该大力发展生物检测方法。
【发明内容】
[0006]本发明小组惊讶的发现,利用植物中GH3 (Gretchen Hagen3)基因可以灵敏的检测植物中生长素类农药或其结构类似物残留。
[0007]本发明选择苗期刚离体的大豆叶片(来自3-5叶期植株)作为检测对象，以离体叶片的叶柄部接触吸收被检样品的水溶液，I小时后，提取大?叶片的总RNA,反转录后用PCR扩增GH3基因，检测处理大豆叶片中GH3表达量变化量。
[0008]一方面，本发明提供一种检测液体样本中是否含有生长素类农药或其结构类似物残留的方法，该方法包括:[0009](I)、摘取苗期大豆叶片，立即把叶柄侵入液体样本中I小时，从药液中取出大豆叶片用于总RNA的提取；同时取清水处理大豆叶片作对照；
[0010](2)、以SKIP16基因为内参，以GH3.6为标志基因；检测GH3基因在步骤I处理过的大豆体内的相对表达量；如果相对表达量大于5以上，则说明书样本中含有生长素类农药或与生长素农药类似的结构。
[0011]在一些优选的方式中，内参SKIP16基因的序列为⑶397253 ；GH3基因的序列为XM_003543231.1 ;检测内参基因的引物序列为GAGCCCAAGACATTGCGAGAG和CGGAAGCGGAAGAACTGAACC ;检测 GH3 基因的引物序列为:CTCCACCAAAGACTATGTTCTTGAAGA 和CTCTTGAAGGTGTCAGGGTCGA。
[0012]在一些优选的方式中，相对表达量大于10-15。优选的,相对表达量为10或15.[0013]在另一些优选的方式中，所述的生长素农药为苯氧羧酸类，二氯喹啉酸或多菌灵中的一种或几种。在另一些优选的方式中，所述的生长素农药为二氯喹啉酸。
[0014]在一些优选的方式中，相对表达量的检测采用Real-Time PCR，其条件如下:
[0015]内参基因的反应体系如下:总体积为25ul，其中ddH20:10.5ul ;SYBR Premixex TaqTM(2X):12.5ul ;PCR_F(IOuM):0.5ul ；PCR-R(IOuM):0.5ul ；模板 cDNA:1.0ul ；标志基因的反应体系如下:总体积为25ul，其中ddH20:10.5ul ；SYBR Premix exTaqTM(2 X):12.5ul ；PCR-FI (IOuM):0.5ul ；PCR-R1 (IOuM):0.5ul ;模板 cDNA:1.0ul ;反应条件:95°C，lmin ;45个循环:95°C，IOsec ；62°C，在25sec收集荧光熔点曲线分析，55°Cto95°C。
[0016]在另一些优选的方式中，所述的液体样本来自植物组织的提取液，或者环境土壤、水、或者其他组织的提取液体。
[0017]在另一方面，本发明提供一种GH3基因的新用途，一种把GH3基因作为检测生长素类农药或其结构类似物残留的用途。
[0018]优选的方式中，根据所述的用途，其中，检测GH3基因的表达量来检测液体样本中是否含有生长素类农药或其结构类似物残留，其中检测方法如下:
[0019](I)、摘取苗期大豆叶片，立即把叶柄浸入液体样本中I小时，从液体样本中取出大豆叶片用于总RNA的提取；同时取清水处理大豆叶片作对照；
[0020](2)、以SKIP16基因为内参，以GH3.6为标志基因，检测GH3基因在步骤I处理过的大豆体内的相对表达量；如果相对表达量大于5以上，则说明书液体样本中含有生长素类农药或与生长素农药类似结构的农药残留。
[0021]有益效果
[0022]标志基因法检测农产品中残留农药具有一定的优势，首先它可实现大规模、高通量的样品量检测，检测周期短、出结果快，只需要几个小时便可得结果。本发明的方法可迅速排除绝大多数非生长素类农药，确定被测样品中是否含有生长素类农药，可大幅度缩小盲样的检测范围，基本上可定性决断存在生长素类农药，因而可以作为仪器检测前的补充方法。可减少仪器检测的盲目性。另外，本发明的方法可以极大的提高检测的灵敏度，那些依靠液相色谱仪器不能检测的农药残留，通过本发明的方法也可以检测得出来。
【专利附图】
【附图说明】[0023]图1为标志基因只被激素类农药或其结构类似物诱导10倍以上的比较图，其中1.清水对照；2.草甘膦；3.2甲4氯；4.乙草胺；5.二甲戊灵；6.甲磺隆；7.莠去津；8.盖草能；9.百草枯；10.二氯喹啉酸；11.氟虫腈；12.毒死蜱；13.阿维菌素；14.吡虫啉；15.氯氟氰菊酯；16代森锰锌；17.戊唑醇；18.多抗霉素；19.井网霉素；20.百菌清；21.多菌灵。
[0024]图2为标志基因GH3的相对表达量与目标农药二氯喹啉酸浓度之间的关系。浓度O为清水对照，浓度I为最高浓度(常规浓度0.5g/L)，8为最低渡，6为二氯喹啉酸的HPLC的检出限。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
[0026]此部分的材料与方法用于证明，GH3基因只受生长素类农药或其类似物的诱导表达量达10倍以上。证明GH3基因表达与生长素类农药或其类似物的定性关系，也就是要证明GH3基因可以作为检测生长素类农药或其类似物的标志基因。
[0027]1.1 材料
[0028]植物:3-5叶期大豆植株(浙春3号)。
[0029]农药:根据作用机理不同，市购20种生产上常用农药。其中包括9种除草剂、5种杀虫剂和6种杀菌剂(表1)。
[0030]表1本实验中使用的农药
[0031]
【权利要求】
1.一种检测生长素类农药或其结构类似物残留的方法，其特征在于，该方法包括: (1)、摘取苗期大豆叶片，立即把叶柄浸入液体样本中I小时，从液体样本中取出大豆叶片用于总RNA的提取；同时取清水处理大豆叶片作对照； (2)、以SKIP16基因为内参，以GH3.6为标志基因，检测GH3基因在步骤I处理后的大豆体内的相对表达量； 如果相对表达量大于5以上，则说明书液体样本中含有生长素类农药或与生长素农药类似结构的农药残留。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内参SKIP16基因的序列为在基因库中编号为⑶397253所示的序列；GH3基因的序列为在基因库中编号为XM_003543231.1所示的序列；内参基因的引物序列为GAGCCCAAGACATTGCGAGAG和CGGAAGCGGAAGAACTGAACC ；GH3 基因的引物序列为:CTCCACCAAAGACTATGTTCTTGAAGA 和 CTCTTGAAGGTGTCAGGGTCGA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，相对表达量为10-15。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，相对表达量为10或15。
5.根据权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，所述的生长素农药为苯氧羧酸类，二氯喹啉酸或多菌灵中的一种或几种。
6.根据权利要求5之一所述的方法，其特征在于，所述的生长素农药为二氯喹啉酸。
7.根据权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，相对表达量的检测采用Real-TimePCR，其中，内参基因的反应体系如下:总体积为25ul，其中ddH20: 10.5ul ；SYBR Premix exTaqTM (2X): 12.5ul ；PCR-F (IOuM): 0.5 ul ；PCR-R (IOuM): 0.5 ul ;模板 cDNA:1.0ul ;标志基因的反应体系如下:总体积为25ul，其中ddH20: 10.5ul ；SYBR Premix ex TaqTM(2X): 12.5ul ；PCR-FI (IOuM): 0.5 ul ；PCR-R1 (IOuM): 0.5 ul ;模板cDNA:1.0 ul ;反应条件:95°C，Imin ;45 个循环:95°C，IOsec ;62°C 25sec,在 55°C to 95°C 内收集荧光熔点曲线进行分析。
8.根据权利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，所述的液体样本来自植物组织的提取液，或者环境土壤、水。
9.一种把GH3基因作为检测生长素类农药或其结构类似物残留的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，检测GH3基因的表达量来检测液体样本中是否含有生长素类农药或其结构类似物残留，其中检测方法如下: (1)、摘取苗期大豆叶片，立即把叶柄浸入液体样本中I小时，从液体样本中取出大豆叶片用于总RNA的提取；同时取清水处理大豆叶片作对照； (2)、以SKIP16基因为内参，以GH3.6为标志基因，检测GH3基因在步骤I处理过的大豆体内的相对表达量；如果相对表达量大于5以上，则说明书液体样本中含有生长素类农药或与生长素农药类似结构的农药残留。
【文档编号】C12Q1/68GK103468795SQ201310340704
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】李岗, 王强, 蔡磊明, 吴声敢, 赵学平, 吴长兴 申请人:浙江省农业科学院