辅助鉴定棉花曲叶病毒的引物组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种辅助鉴定棉花曲叶病毒的引物组合物及其应用。本发明提供的引物组合物，由DNA片段-Ⅰ、DNA片段-Ⅱ、DNA片段-Ⅲ、DNA片段-Ⅳ、DNA片段-Ⅴ和所述DNA片段-Ⅴ组成，均为单链DNA片段；所述DNA片段-Ⅰ如序列表的序列1所示，所述DNA片段-Ⅱ如序列表的序列2所示，所述DNA片段-Ⅲ如序列表的序列3所示，所述DNA片段-Ⅳ如序列表的序列4所示，所述DNA片段-Ⅴ如序列表的序列5所示。本发明为动态监测棉花曲叶病毒在我国的情况、控制其在我国境内大规模爆发、避免我国棉花产业的经济损失提供有力的保障。同时也可在国内的植保植检站、科研院所、进出口棉花生产企业及农户中大范围推广应用。
【专利说明】辅助鉴定棉花曲叶病毒的弓I物组合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种辅助鉴定棉花曲叶病毒的引物组合物及其应用。
【背景技术】
[0002]棉花曲叶病毒属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，为单链环状DNA植物病毒，具有典型的双联体颗粒形态，其基因组由单一组分组成。棉花曲叶病毒无性繁殖可以诱导产生轻微的非典型症状。侵染性分析表明，CLCuV DNAβ与CLCuV共同接种棉花后可诱导产生叶片卷缩、叶脉膨大、增厚、暗化、曲叶及耳突等CLCuV的田间典型症状。棉花曲叶病毒主要危害棉花、扶桑、菜豆、番茄和烟草等，在棉区普遍发生，疫区田间病株率在80%以上(甚至100%)，棉花病株生长严重衰退，造成减产，甚至绝收，危害十分严重。棉花曲叶病毒可经粉虱(Bemisia tabaci)以持久性方式传播，也可以通过嫁接传播。
[0003]目前，棉花曲叶病毒的检测较常用的方法有两种。一种是血清学检测方法，常见的有DAS-ELISA，血清学检测方法除了在灵敏度上存在不足外，其检测的特异性也受到限制(同属成员间的检测往往有交叉反应)。另一种是分子生物学检测方法，其中以RT-PCR最为常见，但是PCR需要特殊的仪器(PCR仪)。同时以上两种方法均需要较长的时间，血清学方法大约需要2天，分子生物学方法大约需要5小时，无法满足口岸快速检疫的要求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种辅助鉴定棉花曲叶病毒的引物组合物及其应用。
[0005]本发明首先保护引物组合物甲，由DNA片段-1、DNA片段-1I ,DNA片段-1I1、DNA片段-1V和DNA片段-V组成；所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1I1、所述DNA片段-1V和所述DNA片段-V均为单链DNA片段；所述DNA片段-1如序列表的序列I所示，所述DNA片段-1I如序列表的序列2所示，所述DNA片段-1II如序列表的序列3所示，所述DNA片段-1V如序列表的序列4所示，所述DNA片段-V如序列表的序列5所
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[0006]本发明还保护引物组合物乙，由DNA片段-V1、DNA片段-VI1、DNA片段-珊、DNA片段-1X和DNA片段-X组成；所述DNA片段-VKDNA片段-VI1、所述DNA片段-珊、所述DNA片段-1X和所述DNA片段-X均为单链DNA片段；所述DNA片段-VI如序列表的序列I的反向互补序列所示，所述DNA片段-VII如序列表的序列2的反向互补序列所示，所述DNA片段-珊如序列表的序列3的反向互补序列所示，所述DNA片段-1X如序列表的序列4的反向互补序列所示，所述DNA片段-X如序列表的序列5的反向互补序列所示。
[0007]本发明还保护所述引物组合物甲或所述引物组合物乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b):(a)辅助鉴定棉花曲叶病毒；(b)辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。所述植物具体可为扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、番爺(Lycopersicon esculentum)、本生烟(Nicotiana benthamiana)或丰帛花(Chenopodiumquinoa)。所述植物材料具体可为植物叶片
[0008]本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物组合物甲或所述引物组合物乙；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b): (a)辅助鉴定棉花曲叶病毒；(b)辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。所述植物具体可为扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、番爺(Lycopersiconesculentum)、本生烟(Nicotiana benthamiana)或棉花(Chenopodium quinoa)。所述植物材料具体可为植物叶片。
[0009]本发明还保护所述引物组合物甲或所述引物组合物乙的应用，为如下(a)或(b):Ca)辅助鉴定棉花曲叶病毒；(b)辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。所述植物具体可为扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、番爺(Lycopersicon esculentum)、本生烟(Nicotiana benthamiana)或棉花(Chenopodium quinoa)。所述植物材料具体可为植物叶片
[0010]本发明还保护一种辅助鉴定棉花曲叶病毒的方法，包括如下步骤:(1)以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述引物组合物甲或所述引物组合物乙进行环介导等温扩增；
(2)通过检测步骤(I)的扩增产物辅助鉴定待测病毒是否为棉花曲叶病毒。
[0011]本发明还保护一种辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒的方法，包括如下步骤:(I)以待测植物材料的总DNA为模板，用所述引物组合物甲或所述引物组合物乙进行环介导等温扩增；(2)通过检测步骤(I)的扩增产物辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。
[0012]基于浊度或沉淀判断结果的原理如下:DNA复制过程中，当一个dNTP分子结合到DNA链上的同时会解离下一个焦磷酸根离子(PPi )，PPi与反应液中的镁离子结合产生白色沉淀Mg2P2O7,由于DNA产物量巨大，随之而来`的副产物Mg2P2O7量很大，因此反应体系会发生浊度变化并可观察到白色沉淀。基于该原理，可在环介导等温扩增的过程中通过实时浊度仪进行结果判断，如果观察到典型的扩增曲线、待测样本为候选的棉花曲叶病毒或被棉花曲叶病毒侵染的植物组织，如果没有观察到典型的扩增曲线、待测样本为候选的非棉花曲叶病毒或没有被棉花曲叶病毒侵染的植物组织。基于该原理，可以根据是否产生白色沉淀进行结果判断，自然光下，如果反应液生成白色浑浊/白色沉淀、待测样本为候选的棉花曲叶病毒或被棉花曲叶病毒侵染的植物组织，如果反应液没有生成白色浑浊/白色沉淀、待测样本为候选的非棉花曲叶病毒或没有被棉花曲叶病毒侵染的植物组织。
[0013]基于荧光染料的颜色变化判断结果的原理如下:钙黄绿素(鳌合剂)与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。基于该原理，可以根据反应液的颜色变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列。自然光下，如果反应液由透明橙色变为微浊的黄绿色、待测样本为候选的棉花曲叶病毒或被棉花曲叶病毒侵染的植物组织，如果没有发生上述颜色变化、待测样本为候选的非棉花曲叶病毒或没有被棉花曲叶病毒侵染的植物组织。
[0014]以上任一所述的环介导等温扩增的反应体系中，F3和B3的浓度具体可为
0.2pmol/y L, FIP和BIP的浓度具体可为1.6pmol/y L, LF的浓度具体可为为0.8pmol/μ L0
[0015]以上任一所述的环介导等温扩增的反应程序具体可为:63°C反应60min。
[0016]环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP),是由Notomi T等在2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法，它是一种高灵敏的链置换技术。LAMP特点是针对靶基因的6个区域设计4-6条特异引物，利用链置换DNA聚合酶-BstDNA polymerase在恒温(60°C _65°C )的条件下反应0.5-1小时即可完成核酸扩增反应,通过目测或浊度仪就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR仪等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。
[0017]本发明采用环介导恒温核酸扩增技术鉴定棉花曲叶病毒或鉴定待测植物样本是否侵染了棉花曲叶病毒，具有反应时间短、无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高及特异性好的优点，很好的克服了当前所用DAS-ELISA及RT-PCR两类方法的不足，非常适用于进出境检验检疫。本发明为动态监测棉花曲叶病毒在我国的情况、控制其在我国境内大规模爆发、避免我国棉花产业的经济损失提供有力的保障。同时也可在国内的植保植检站、科研院所、进出口棉花生产企业及农户中大范围推广应用。
【专利附图】
【附图说明】[0018]
[0019]
[0020][0021][0022][0023]
图1为实施例2中LAMP反应体系甲的结果。
图2为实施例2中LAMP反应体系乙的结果。
图3为实施例3的结果。
图4为实施例4的结果。
图5为实施例5中LAMP反应的灵敏度的结果。图6为实施例5中PCR反应的灵敏度的结果。
【具体实施方式】
[0024]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0025]植物基因组DNA提取试剂盒:天根生化有限公司，产品目录号:DP305_03。Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒:日本荣研公司，CodeNo:LMP204。Fluorescent DetectionReagent:日本荣研公司，CodeNo: slp221。
[0026]棉花曲叶病毒(Cottonleaf curl virus, CLCuV):参考文献:R.W.Briddon, S.Mansoor, et al.1dentification of DNA Components Required for Induction of CottonLeaf Curl Disease.Virology285, 234±243 (2001)。
[0027]花椰菜花叶病毒(CaMV):参考文献:孙敏、梁成珠等，花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子LAMP检测方法的建立。食品科技，2010.04。
[0028]马铃薯卷叶病毒(PLRV):参考文献:张磊，董家红，张仲凯，马铃薯卷叶病毒RT-PCR-RFLP的检测分析，云南大学学报(自然科学版)，2008年SI期。
[0029]烟草花叶病毒(TMV):参考文献:黄金光；邓丛良；范在丰；田国忠；李怀方；烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定，植物病理学报，2004年03期。
[0030]烟粉風(genusBegomovirus):参考文献:Shahid Mansoor, Rob ff.Briddon, etal.Geminivirus dis ease complexes:an emerging threat.TRENDS in Plant ScienceVol.8N0.3March2003。
[0031 ] 感染了棉花曲叶病毒的番茄叶片:是通过烟粉虱将棉花曲叶病毒接种番茄植株后得到的。感染了棉花曲叶病毒的本生烟叶片:是通过烟粉虱将棉花曲叶病毒接种本生烟植株后得到的。感染了棉花曲叶病毒的棉花叶片:是通过烟粉虱将棉花曲叶病毒接种棉花植株后得到的。感染了棉花曲叶病毒的扶桑叶片:是通过烟粉虱将棉花曲叶病毒接种扶桑植株后得到的。
[0032]实施例1、引物组合物的制备
[0033]设计并分别合成以下五条引物:
[0034]F3 (序列表的序列 I):5’ -TGGATGGATGAAAATATAAAGACC-3’ ；
[0035]B3 (序列表的序列 2):5’ -ACTCGCATATTGACCACC-3’ ；
[0036]FIP (序列表的序列 3):5’ -AGGITTGTCAACAGGTCGTCGGGAATCACACGAATTCGGT-3’ ；
[0037]BIP (序列表的序列 4):5’ -ACGAACCCAGTACAGCAACTTAACGGTTGCATGCCATT-3’ ；
[0038]LB (序列表的序列 5):5’ -AGTCATAGGGACCGTTATCAGG-3’。
[0039]实施例2、引物组合物的应用
[0040]1、采用植物基因组DNA提取试剂盒提取感染了棉花曲叶病毒的扶桑叶片的总DNA,得到总DNA溶液(DNA浓度约为300.9ng/ μ L)。
[0041]2、以步骤I提取的总DNA为模板，用实施例1设计的引物组合物进行LAMP。
[0042]LAMP 反应体系甲(25 μ L):步骤一获得的总 DNA 溶液 2 μ L，F30.5 μ L，Β30.5 μ L，FIPl μ L，BIPl μ L，LFl μ L，2 X 反应缓冲液(RM) 12.5 μ L，酶溶液(EM) I μ L，去离子水(DW)5.5 μ L ;即反应体系中，F3和Β3的初始浓度均为0.2pmol/μ L，FIP和BIP的初始浓度均为
1.6pmol/ μ L, LF 的初始浓度为 0.8pmol/ μ L。
[0043]LAMP 反应体系乙(25 μ L):步骤一获得的总 DNA 溶液 2 μ L，F30.5 μ L，Β30.5 μ L，FIPl μ L, BIPl μ L, LFl μ L, Fluorecent Detection Reagentl μ I (含I丐黄绿素和 Mn2+), 2 X反应缓冲液(RM) 12.5 μ L，酶溶液(EM) I μ L，去离子水(DW)4.5 μ L ;即反应体系中，F3和Β3的初始浓度均为0.2pmol/μ L，FIP和BIP的初始浓度均为1.6pmol/μ L，LF的初始浓度为
0.8pmol/μ L0
[0044]2 X反应缓冲液(RM) 12.5 μ L，酶溶液(EM) I μ L，去离子水(DW)均为Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒的组分。2X反应缓冲液(RM)中含有Mg2+。
[0045]LAMP 反应程序:63°C 反应 60min。
[0046]设置未感染棉花曲叶病毒的扶桑叶片作为阴性对照，设置水作为空白对照。
[0047]LAMP反应体系甲63°C反应60min后的照片见图la。Ib和Ic分别为空白对照和阴性对照，反应后溶液仍然透明，判定为阴性。反应过程中，持续目测观察，第ISmin时反应管内有白色浑浊开始出现，60min时白色沉淀更加明显。
[0048]LAMP反应体系乙63 V反应60min后的照片见图2a。2b和2c分别为空白对照和阴性对照，反应后溶液仍然为透明橙色，判定为阴性。加入感染了棉花曲叶病毒的扶桑叶片的总DNA并反应60min后，溶液变为微浊的黄绿色。
[0049]实施例3、特异性分析
[0050]病毒样本分别为:棉花曲叶病毒、花椰菜花叶病毒、马铃薯卷叶病毒和烟草花叶病毒。[0051]1、分别提取各个病毒样本的基因组DNA。
[0052]2、以步骤I提取的总DNA为模板，用实施例1设计的引物组合物进行LAMP。
[0053]LAMP 反应体系(25 μ L):步骤 I 获得的基因组 DNA2 μ L，F30.5 μ L, Β30.5 μ L,FIPl μ L，BIPl μ L，LFl μ L，2 X 反应缓冲液(RM) 12.5 μ L，酶溶液(EM) I μ L，去离子水(DW)
5.5μ L ;即反应体系中，即反应体系中，F3和Β3的初始浓度均为0.2pmol/yL, FIP和BIP的初始浓度均为1.6pmol/ μ L，LF的初始浓度为0.8pmol/ μ L。
[0054]将LAMP反应体系置于LA320C实时浊度仪，63°C反应60min。
[0055]实时浊度仪扩增曲线见图3。结果表明，只有棉花曲叶病毒出现扩增曲线，其它病毒均未出现扩增曲线，即实施例1设计的引物组合物具有良好的特异性。
[0056]实施例4、普适性分析
[0057]待测植物叶片分别为:感染了棉花曲叶病毒的番茄叶片、感染了棉花曲叶病毒的本生烟叶片、感染了棉花曲叶病毒的棉花叶片和感染了棉花曲叶病毒的扶桑叶片、未感染棉花曲叶病毒的番茄叶片、未感染棉花曲叶病毒的本生烟叶片、未感染棉花曲叶病毒的棉花叶片和未感染棉花曲叶病毒的扶桑叶片。
[0058]1、采用植物基因组DNA提取试剂盒提取感染了待测的总DNA，得到总DNA溶液。
[0059]2、以步骤I提取的总DNA为模板，用实施例1设计的引物组合物进行LAMP。
[0060]LAMP反应体系同实施例2的LAMP反应体系甲。
[0061]将LAMP反应体系置于LA320C实`时浊度仪，63°C反应60min。
[0062]实时浊度仪扩增曲线见图4。感染了棉花曲叶病毒的番茄叶片、感染了棉花曲叶病毒的本生烟叶片、感染了棉花曲叶病毒的棉花叶片和感染了棉花曲叶病毒的扶桑叶片均显示扩增曲线。未感染棉花曲叶病毒的番茄叶片、未感染棉花曲叶病毒的本生烟叶片、未感染棉花曲叶病毒的棉花叶片和未感染棉花曲叶病毒的扶桑叶片均未显示扩增曲线。
[0063]实施例5、灵敏度分析
[0064]1、将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入克隆载体PMD-18T (TAKARA)，得到
重组质粒。
[0065]2、用无菌水作为溶剂，得到步骤I得到的重组质粒的浓度为128.7ng/ μ L的质粒溶液(PO溶液)；用无菌水10倍梯度稀释PO溶液，依次得到Pl溶液、Ρ2溶液、Ρ3溶液、Ρ4溶液、Ρ5溶液、Ρ6溶液、Ρ7溶液、Ρ8溶液、Ρ9溶液和PlO溶液。
[0066]3、LAMP反应的灵敏度
[0067]LAMP反应体系(25 μ L):质粒溶液(PO溶液、Pl溶液、Ρ2溶液、Ρ3溶液、Ρ4溶液、Ρ5溶液、Ρ6 溶液、Ρ7 溶液、Ρ8 溶液、Ρ9 溶液或 PlO 溶液)I μ L，F30.5 μ L，Β30.5 μ L，FIPl μ L，BIPl μ L，LF1 μ L，2X 反应缓冲液(RM)12.5 μ L，酶溶液(EM)I μ L，去离子水(DW)6.5 μ L ;即反应体系中，F3和Β3的初始浓度均为0.2pmol/μ L，FIP和BIP的初始浓度均为1.6pmol/μ L, LF的初始浓度为0.8pmol/ μ L。
[0068]实时浊度仪扩增曲线见图5。PO溶液、Pl溶液、P2溶液、P3溶液、P4溶液、P5溶液、P6溶液和P7溶液均显示扩增曲线。
[0069]4、PCR反应的灵敏度
[0070]PCR鉴定引物如下:
[0071]CLCuV-2F: 5’ -GTCGCAGGATTATTCACCG-3 ’ ；[0072]CLCuV-2R: 5，-TTGCTAGCGTGGGTACAA-3，。
[0073]PCR 反应体系(25μ I):2.5μ 110XPCR 缓冲液(含 Mg2+)，2y I dNTP Mix(IOmM)，
0.5μ I CLCuV F(10yM),0.5μ I CLCuV R(10 μ Μ)，0.5 μ I Taq DNA 酶(TAKARA, 5U/L)，18 μ I ddH20，Ι.Ομ I质粒溶液(PO溶液、PI溶液、Ρ2溶液、Ρ3溶液、Ρ4溶液、Ρ5溶液、Ρ6溶液、Ρ7溶液、Ρ8溶液、Ρ9溶液或PlO溶液)。
[0074]PCR反应程序:94°C5min ；30X (94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 40sec) ；72°C IOmin0
[0075]PCR扩增产物的电泳图见图6。PO溶液、Pl溶液、P2溶液、P3溶液、P4溶液和P5
溶液均显示目的条带。.
【权利要求】
1.引物组合物甲，由DNA片段-1、DNA片段-1I,DNA片段-1I1、DNA片段-1V和DNA片段-V组成；所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1I1、所述DNA片段-1V和所述DNA片段-V均为单链DNA片段；所述DNA片段-1如序列表的序列I所示，所述DNA片段-1I如序列表的序列2所示，所述DNA片段-1II如序列表的序列3所示，所述DNA片段-1V如序列表的序列4所示，所述DNA片段-V如序列表的序列5所示。
2.引物组合物乙，由DNA片段-V1、DNA片段-VI1、DNA片段-珊、DNA片段-1X和DNA片段-X组成；所述DNA片段-VKDNA片段-VI1、所述DNA片段-珊、所述DNA片段-1X和所述DNA片段-X均为单链DNA片段；所述DNA片段-VI如序列表的序列I的反向互补序列所示，所述DNA片段-VII如序列表的序列2的反向互补序列所示，所述DNA片段-珊如序列表的序列3的反向互补序列所示，所述DNA片段-1X如序列表的序列4的反向互补序列所示，所述DNA片段-X如序列表的序列5的反向互补序列所示。
3.权利要求1所述引物组合物甲或权利要求2所述引物组合物乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b): (a)辅助鉴定棉花曲叶病毒；(b)辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。
4.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物组合物甲或权利要求2所述引物组合物乙；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b):(a)辅助鉴定棉花曲叶病毒；(b)辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。
5.权利要求1所述引物组合物甲或权利要求2所述引物组合物乙的应用，为如下(a)或(b): (a)辅助鉴定棉花曲叶病毒；(b)辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。
6.一种辅助鉴定棉花曲叶病毒的方法，包括如下步骤:(1)以待测病毒的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物组合物甲或权利要求2所述引物组合物乙进行环介导等温扩增；(2)通过检测步骤(I)的扩增产物辅助鉴定待测病毒是否为棉花曲叶病毒。
7.一种辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒的方法，包括如下步骤:(1)以待测植物材料的总DNA为模板，用权利要求1所述引物组合物甲或权利要求2所述引物组合物乙进行环介导等温扩增；(2)通过检测步骤(I)的扩增产物辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。
【文档编号】C12Q1/70GK103436532SQ201310367183
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月21日 优先权日:2013年8月21日
【发明者】赵竹, 李明福, 张永江, 宋云, 许瑾, 丁小兰, 何增磊 申请人:中国检验检疫科学研究院