棉花品种‘中棉所49号’的dna指纹检测方法
【专利摘要】本发明提供一种棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法，该方法利用SSR标记技术，使用选自CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154中的至少一种特征引物进行PCR检测，该方法包括如下步骤：DNA提取、SSR-PCR扩增、电泳和银染检测。本发明方法简单快速、准确稳定，仅需2d即可完成1份‘中棉所49号’样品的纯度与真伪检测。
【专利说明】棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法。
【背景技术】
[0002]‘中棉所49号’系中国农业科学院棉花研究所选育的常规早中熟陆地棉品种。该品种是西北内陆棉区主栽棉花品种之一。2006~2013年，连续8年被农业部推荐为西北地区棉花主导品种；2008~2013年，连续6年被列为国家西北内陆棉区棉花早中熟组区域试验对照品种；2007~2013年，连续7年被列为自治区棉花早中熟组区域试验对照品种；2005~2012年在南疆和东疆累计推广面积3207.1万亩，年均400万亩，占当地棉花面积30%左右。并因原棉品质稳定而优异，被选为国家原棉实物标样。
[0003]然而，随着棉花品种数量的日益增加和遗传基础的日益狭窄，使得完全根据形态性状进行棉花品种的辨别越来越困难，给种子生产、经营、管理、维权等诸环节带来不同程度的困难，造成诸如品种多、乱、杂的现象。近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能揭示更多的多态性，具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，是品种鉴定技术的发展趋势。与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的简单重复序列(SSR)标记在DNA指纹鉴定上显示了独特的优越性:SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高，以孟德尔方式遗传，呈共显性。SSR标记已成为品种鉴定首选技术之一，并已在玉米，水稻等作物上初步应用。
[0004]目前，我国棉种的真实性与品种纯度鉴定仍依靠田间小区种植鉴定方法，需投入大量的人力、物力，成本高、耗时长，时效性差。武耀廷，张天真，郭旺珍等进行了陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究；马轩，杜雄明，孙君灵等进行了 18个彩色棉品系的SSR指纹分析；殷剑美，陈旭升，狄佳春等进行了杂交棉苏杂118的SSR指纹图谱构建研究。研究者普遍认为，利用分子标记进行棉花品种鉴定是可行的。但利用现有的分子标记技术进行品种鉴定缺乏系统性研究，存在鉴别能力不够高、操作步骤较多、耗费时间较长、实验成本较高等问题，不能完全适应实践检测的需要。因此，有必要针对限制棉花DNA指纹鉴定实用化的因素，迅速开展我国棉花品种DNA指纹鉴定的研究工作，建立高效准确、经济简便的以SSR技术为基础的DNA指纹鉴定体系，在此基础上开发棉花品种纯度和真伪DNA指纹检测专用试剂盒，为棉花品种质量监控及品种权保护提供有利的工具。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供棉花常规种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法。
[0006]为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测棉花品种‘中棉所49号’的特异性 PCR 引物，所述 PCR 引物选自 CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Ghl32 和 BNLl 154 中的至少一对引物(表 I)。
[0007] 表1特异性PCR引物
【权利要求】
1.用于检测棉花品种‘中棉所49号’的特异性PCR引物，其特征在于，所述PCR引物选自 CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPLO176, NAU3424、Gh132 和BNLl 154中的至少一对引物；
2.棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于检测棉花品种‘中棉所49号’的特异性PCR引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，包括CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Ghl32 和 BNL1154 的引物组合。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
5.棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取待测棉花的基因组DNA； 2)以待测棉花的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增； 3)检测PCR扩增产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，20μ L PCR反应体系中包括:添加Mg2+的IOX 反应缓冲液2.0 μ L，2.5mM dNTPsl.6 μ L，20 μ M上、下游引物各0.15μ L，2.5U/y L TaqDNA 聚合酶 0.4 μ L，20ng/ μ L 基因组 DNA2.0yL,余量为 ddH20。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为:94°C预变性4min；94°C变性45s，55°C退火45s，72。。延伸45s，32个循环；72°C延伸12min，4°C保存。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用银染法检测PCR扩增产物。
9.权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测棉花品种‘中棉所49号’中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103937873SQ201310380280
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】匡猛, 杨伟华, 严根土, 王延琴, 周大云, 方丹, 马磊, 许红霞, 冯新爱 申请人:中国农业科学院棉花研究所