Tradd基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成或治疗皮肤疤痕中的应用，并具体公开了TRADD基因过表达慢病毒的制备方法。本发明的TRADD基因过表达慢病毒能同时改善皮肤疤痕的平整度和色泽均匀度。
【专利说明】TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药领域，具体而言涉及TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成中的应用。
【背景技术】
[0002]人TRADD基因含有4个外显子，外显子总长度为939bp，可编码大小为34KD信号蛋白——肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(tumor necrosis factor receptor associateddeath domain protein，TRADD)，该蛋白可通过肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factoralpha, TNF- a )介导的信号通路调控细胞的增殖与凋亡。TNF- a与TNFRl结合后，TNFRl胞内段的死亡结构域(death domain, DD)即可与TRADD蛋白结合,产生2种不同的诱导调节机制(I)TRADD与FADD，caspase-8结合，再激活caspase-3，诱导细胞凋亡；(2) TRADD结合TRAF (TNF recepto r associated factors)或招募 RIP (receptor interacting protein),激活NF-K B，活化的NF-K B可抑制细胞凋亡和促进炎症反应。有学者研究和我们的研究证实TRADD蛋白在HSFb中的表达量明显降低，抑制了其在TNF-a / TNFRl信号通路中介导的细胞凋亡作用，导致HSFb的过度增殖。
[0003]目前皮肤斑痕的治疗有手术疗法和非手术疗法两大类。手术切除是临床治疗皮肤斑痕的常用方法，软组织扩张术、皮片、皮瓣等修复技术的应用，明显改善了病损部位的外观和功能，但复发率较高，很可能因术后创伤愈合失控而导致病理性瘢痕再次形成。非手术疗法包括加压疗法、局部药物注射、激光疗法、冷冻治疗等，任何非手术疗法，均直接或间接作用于抑制成纤维细胞增殖和调节胶原代谢这一重要环节，方法虽多，效果却不尽如人意。加压疗法由于治疗疗程较长，患者不易坚持；皮质类固醇激素仅适用于小面积的病理性瘢痕；激光治疗的局限性主要是其穿透性不足，治疗的深度不够；冷冻治疗的限制因素是疼痛、延迟愈合及感染。
[0004]瘢痕一旦产生就无法完全消除，因此预防HS的形成尤为重要，只有通过寻找瘢痕基因缺陷并从基因水平加以修正，从源头上抑制成纤维细胞增殖及胶原蛋白合成，避免或减轻HS的发生发展，才是预防HS的核心问题。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的问题是提供一种抑制皮肤疤痕形成中的TRADD基因过表达慢病毒，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0006]为解决上述技术问题，本发明提出的方案为一种抑制皮肤疤痕形成中的TRADD基因过表达慢病毒，该TRADD基因过表达慢病毒通过如下方法制备得到:
[0007]1.TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成或治疗皮肤疤痕中的应用，其特征在于所述的TRADD基因过表达慢病毒通过如下方法制备而成:
[0008](I) TRADD基因为模板，采用PCR法扩增目的片段，扩增引物序列为:
[0009]TRADD-F:5，-CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCAGCTGGGCAA AATG-3，；[0010]TRADD-R:5’ -CCATGGTGGCGAATTCGGCCAGGCCGCCATTGG-3’ ；
[0011]PCR产物回收纯化后与EcoR I酶切线性化的表达载体pLVX-EGFP-3FLAG_Puro进行重组连接，37°C孵育15min，再50°C孵育15min，立即转化DH5a感受态细胞，最后将已转化的感受态细胞转移至含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37°C培养16h ；
[0012](2)接种阳性克隆，保种并分装100 μ I进行测序，测序验证无误后，接种抽提质粒;
[0013](3)选择生长状态良好的293FT细胞进行包装:取慢病毒表达载体pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro3 μ 1、virapower packing mix9 μ I 轻柔混合于 1.5ml 无血清 Opt1-MEM I 中，形成溶液 A ;将 36 μ lLipofectamine2000 与 1.5ml 无血清 Opt1-MEMI混合形成溶液B,并室温孵育5min ;再将溶液A和B混合，室温孵育20min,形成DNA-Lipofectamine 2000复合物，直接转染293FT细胞，转染48h后，收集病毒液。
[0014]本发明另一方面还涉及上述TRADD基因过表达慢病毒及其改善皮肤疤痕的平整度和/或色泽均匀度中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1TRADD基因PCR扩增电泳结果，其中:M:标准；1 =TRADD ；
[0016]图2 重组质粒菌落 PCR 鉴定，其中 1:ddH20 ；2:pLVX-EGFP-3FLAG_Puro ；M:标准；3-10:pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro ；
[0017]图3慢病毒感染293FT细胞48h后绿色荧光蛋白的表达(X 100)，其中a:荧光显微镜观察；b:光镜观察；
[0018]图4EFb、HSFb中TRADD蛋白表达情况，其中a:EFb中TRADD蛋白表达；b:HSFb中TRADD蛋白表达；
[0019]图5HSFb和EFb中TRADD蛋白表达水平的变化，HSFb组和EFb组比较，aP < 0.05 ；
[0020]图6Western blot检测慢病毒转染EFb后融合蛋白的表达，其中1:EFb ；2:转染pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro 的 EFb.；
[0021]图7Western blot检测慢病毒转染HSFb后融合蛋白的表达，其中1:HSFb ；2:转染pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro 的 HSFb ；
[0022]图8TRADD慢病毒、TNF- α对EFb增殖的影响；
[0023]图9TRADD慢病毒、TNF- α对HSFb增殖的影响；
[0024]图10TRADD慢病毒、TNF-α对EFb细胞周期和凋亡的影响，其中a:空白组；b:空白组+TNF- a ；c:实验组；d:实验组+TNF- α ；
[0025]图1ITRADD慢病毒、TNF-α对HSFb细胞周期和凋亡的影响，其中a:空白组；b:空白组+TNF- a ；c:实验组；d:实验组+TNF- α ；
[0026]图12不同部位TRADD表达情况，其中A:皮肤成纤维细胞内TRADD蛋白表达b.皮下成纤维细胞内TRADD蛋白表达；
[0027]图13经方法不同处理后皮肤愈合情况。
【具体实施方式】:
[0028]I材料与方法[0029]1.1质粒和细胞
[0030]TRADD基因模板购自OPEN公司，慢病毒表达载pLV X-EGFP-3FLAG_Puro购自上海生博公司，ViraPower? Lent1-viral Packaging Mix 购自 Invitrogen 公司，DH5a 感受态细胞、293FT细胞、EFb及HSFb均为本领域常见的细胞类型。
[0031]1.2主要试剂
[0032]DL2000DNA Marker、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、Taq酶和dNTP购自TaKaRa公司，EcoR I 购自 NEB 公司，BCA Protein Assay kit 购自 HyClone-Perce 公司、Prestainedprotein marker 购自 Ferments 公司，Rabbit Ant1-TRADD 购自 Abcam 公司，GoatAnt1-rabbit IgG 购自 Santa Cruz 公司，ECL-plus/kit 购自 Amersham 公司，I 型胶原(Collagen I)ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，阳性克隆测序由华大基因完成。
[0033]1.3TRADD目的基因获得与慢病毒表达载体构建
[0034]以购买的TRADD基 因为模板，采用PCR法扩增目的片段。引物序列:
[0035]TRADD-F5，-CTCAAGCTTCGAATTC GCCACC ATGGCAGCTGGGCAA AATG-3，，含同源重组序列、EcoR I酶切位点(下划线)、Kozak序列(双下划线)；
[0036]TRADD-R5’ -CCATGGTGGCGAATTCGGCCAGGCCGCCATTGG-3，,含同源重组序列、EcoR I酶切位点(下划线)。
[0037]PCR产物回收纯化后与EcoR I酶切线性化的表达载体pLVX-EGFP-3FLAG_Puro进行重组连接，37°C孵育15min，再50°C孵育15min，立即转化DH5a感受态细胞。最后将已转化的感受态细胞转移至含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37°C培养16h。
[0038]1.4阳性克隆鉴定
[0039]挑取平板上长出的转化子重悬于10 μ I LB培养液中，从中取1μ I做模板进行菌落PCR鉴定。
[0040]阳性克隆鉴定引物:CMV-F 5’ -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’，该引物位于目的基因上游的CMV启动子中；
[0041]pEGFP-N-R 5’-CGTCGCCGT CCAGCTCGACC AG_3’，该引物位于多克隆位点的下游序列中。
[0042]反应体系为:TemplateI μ I, CMV-F (10 μ mo I / L)0.8 μ I, pEGFP-N-R (IOtmo I /L)0.8μ 1，dNTP (各 2.5mmol / L) 1.6μ I, IOXBuffer (with Mg2+) 2 μ 1，Taq 酶 0.1 μ 1，加 dH20 至 20 μ I。PCR 反应条件:94 °C 5min ；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 1.5min，30 循环；72°C IOmin0接种阳性克隆，保种并分装100 μ I进行测序。测序验证无误后，接种抽提质粒。
[0043]1.5慢病毒的包装
[0044]选择生长状态良好的293FT细胞进行包装。取慢病毒表达载体pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro3 μ 1、virapower packing mix9 μ I 轻柔混合于 1.5ml无血清Opt1-MEM I中，形成溶液A ;将36 μ I Lipofectamine2000与1.5ml无血清Opt1-MEM I混合形成溶液B，并室温孵育5min ;再将溶液A和B混合，室温孵育20min，形成DNA-Lipofectamine2000复合物，直接转染293FT细胞。转染48h后，收集病毒液。
[0045]1.6滴度测定[0046]用Real-time 定量 PCR 法检测病毒滴度，引物序列:BAC_F5’ -TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’，BAC-R5’-CAGCG GAACCGCTCATTGCCAATGG-3’，BAC-P5’-FAM-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-TAMRA-3’ ；WPRE_F5’-CCTTTCCGGGACT TTCGCTTT-3 ’，WPRE-R5 ’ -GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3，，WPRE-P5’ -FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3，。检测的前 ld，将长势良好的293FT细胞按IXlO5 /孔接种于24孔板中，次日分别用10、1、0.1 μ I病毒原液感染293FT细胞。48h后，荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光的分布。72h后抽提每组细胞基因组DNA，在AB17500荧光定量PCR仪上进行Real-time PCR反应检测病毒滴度。
[0047]1.7验证TRADD基因在HSFb、EFb中的表达
[0048]1.7.1细胞免疫荧光法
[0049]将HSFb、EFb接种至盖玻片上，当融合率达到80%时终止培养，PBS漂洗3次，每次3-5min ;4%多聚甲醛室温固定20分钟，PBS漂洗3次，每次3_5min ；0.5% Triton xlOO细胞穿孔15min，PBS漂洗3次，每次3_5min ；5% BSA室温封闭30min ;加入1% BSA稀释的一抗，稀释比1:100，4°C 孵育过夜，PBS漂洗3次，每次3-5min ;加入I % BSA稀释的二抗，稀释比1:50，37°C避光孵育lh，PBS漂洗3次，每次3-5min ；5ug/ml DAPI染色3min，PBS漂洗3次，每次3-5min ;95%甘油封片,避光保存,于激光共聚焦显微镜下观察结果。
[0050]1.7.2ffestern blot 法
[0051]收集HSFb、EFb并转移到EP管中，冰上裂解10-15min，超声破碎仪破碎细胞，离心后取上清液。BCA法测定蛋白浓度后，每个样品蛋白终浓度均调整为2 μ g/μ I。常规蛋白变性、上样电泳、湿转至PVDF膜后，5%脱脂奶粉室温封闭Ih ;4°C—抗孵育过夜(RabbitAnti TRADD:1:200) ；TBST 洗膜 3 次，每次 IOmin ;室温下二抗孵育 PVDF 膜 2h(Goat Antirabbit IgG:1:3000) ;TBST 洗膜 3 次，每次 IOmin ;最后 ECL-plus / kit 显色、X 光片曝光、显影、定影后进行分析。应用quantity one4.6.2图像处理软件测定电泳条带的累积光密度IOD值，计算目的蛋白与内参蛋白光密度的比值，并以此比值作为目的蛋白的相对表达量。
[0052]1.8ffestern blot检测HSFb、EFb转染慢病毒后TRADD-GFP-FLag融合蛋白的表达
[0053]根据预实验结果:PLVX-TRADD-EGFP感染HSFb、EFb的效率达到80 %，MOI应为100，对上述细胞分别做如下处理:空白组(未转染)、实验组(转染PLVX-TRADD-EGFP)。细胞收集，蛋白提取及Western blot方法同上。
[0054]I.9MTT法检测HSFb、EFb增殖情况
[0055]HSFb (空白组与实验组)分别配成1.11 X IO4Cells / ml细胞悬液，铺5块96孔板，每孔90 μ 1，即1.0X IO3Cells / well，待细胞贴壁后，在相应孔分别加入IOOng / mlTNF- α，IOul /孔，终浓度为10ng/ml，每组设6个复孔；将EFb (空白组与实验组)分别配成2.22X IO4Cells / ml细胞悬液，每孔铺90 μ 1，即2.0X 103cells / well，待细胞贴壁后，在相应孔分别加入IOOng / ml TNF- a , IOul /孔，终浓度为IOng / ml，每组设6个复孔。490nm波长测OD值。
[0056]1.10流式细胞仪检测HSFb、EFb细胞周期与细胞凋亡
[0057]PLVX-TRADD-EGFP 感染 HSFb、EFb，3d 后加入终浓度为 IOng / ml 的 TNF- α，实验分为空白组、空白组+TNF-α、实验组、实验组+TNF-α。72h后收集生长状态良好的各组细胞，细胞计数后，每个样品准备IO6Cells,制成细胞悬液后，预冷的70%乙醇4°C固定两小时。300目的筛网过滤后，将细胞悬液转移到流式上机管中，上机检测。[0058]1.11 ELISA检测HSFb、EFb胶原蛋白合成
[0059]PLVX-TRADD-EGFP 感染 HSFb、EFb, 3d 后加入终浓度为 10ng/ml 的 TNF- α 继续培养，实验分为空白组、空白组+TNF-α、实验组、实验组+TNF-α。24h、48h、72h分别收取各组细胞培养液，使用人I型胶原(Collagen I) ELISA试剂盒，在450nm波长测OD值。以标准品的浓度为纵坐标(对数坐标)，OD值为横坐标(对数坐标)，作标准曲线。根据样品OD值，由标准曲线得到样品中Collagen I浓度。
[0060]1.12皮肤疤痕模型的建立
[0061]将2头巴马小型猪常规两侧背部清洗、备皮并分栏适应性喂养24小时。用3%戊巴比妥钠注射液按25ml / kg体重静脉注射至深昏迷。将恒温电烙铁温度调为200°C，在猪两侧背部各作9个直径约2cm的圆形灼伤点，每次灼烧时间为0.5s，使皮肤表面形成焦痂。无菌纱布包扎创面。隔日去除包扎暴露创面，术后肌注青霉素一周预防抗炎并密切观察局部情况。
[0062]1.13局部注射TRADD基因过表达慢病毒对皮肤疤痕的影响
[0063]于烧灼后第3天分别在烧灼点基底部及灶内注射不同量的慢病毒及rmhTNF(上海赛达生物药业股份有限公司生产)。A组:对照慢病毒(PLVX-EGFP)0.2 X IO8TU病毒液；B组:目的基因慢病毒(PLVX-TRADD-EGFP) 0.2 X IO8TU病毒液；
[0064]C 组:目的基因慢病毒(PLVX-TRADD-EGFP)0.2X IO8TU 病毒液 +rmhTNF50IU ；35d时，同样在麻醉条件切取瘢痕组织标本，测定慢病毒转染及瘢痕增生情况。
[0065]2 结果
`[0066]2.1PCR扩增目的基因
[0067]PCR扩增目的基因后，产物经琼脂糖凝胶电泳，可见在IOOObp与750bp间出现一条特异性阳性条带，大小与预期的974bp相符(图1)。
[0068]2.2阳性克隆PCR鉴定
[0069]重组质粒转化DH5a感受态细胞，经氨苄抗性培养基筛选后，采用菌落PCR法鉴定，
5、7、9泳道可见大小约1200bp的阳性克隆条带，2、3、6、8泳道可见大小约252bp的阴性克隆条带(图2)。阳性克隆送华大基因测序，结果显示重组质粒中插入的序列与GenBank中序列完全一致，说明慢病毒质粒载体构建成功。
[0070]2.3慢病毒包装与滴度测定
[0071]质粒共转染至293FT包装细胞中，成功包装出慢病毒颗粒。病毒原液感染293FT细胞48h后，荧光显微镜下可见大量绿色荧光(图3)。感染72h后抽提每组细胞基因组DNA，Real-time PCR法检测病毒滴度。按病毒滴度公式进行数据分析:IUml-l=(CXNXDX1000) / V，其中:C=平均每基因组整合的病毒拷贝数，N=感染时细胞的数目(约为2X 105)，D=病毒载体的稀释倍数，V=加入的稀释病毒的体积数(μ I)。本次检测出的病毒滴度为3.22X 108IU / ml ο
[0072]2.4验证TRADD基因在HSFb、EFb细胞中的表达
[0073]2.4.1细胞免疫荧光法:
[0074]利用共聚焦显微镜观察细胞爬片，可观察到HSFb、EFb中绿色荧光标记的TRADD蛋白散在分布于整个细胞胞浆中，这说明TRADD蛋白在细胞中得到了有效表达，同时定位了TRADD蛋白在细胞中的表达部位。共聚焦显微镜扫描后直接测量荧光强度，结果显示，TRADD蛋白在HSFb中的表达量明显低于在EFb中的表达量(图4)。
[0075]2.4.2ffestern blot 法:
[0076]以TRADD目的蛋白与β-Actin内参蛋白累积光密度的比值作为TRADD蛋白的相对表达量，实验结果与细胞免疫荧光检测结果相一致，两组比较有显著统计学意义(P< 0.05)(图 5)
[0077]2.5ffestern blot检测HSFb、EFb细胞转染慢病毒后融合蛋白表达
[0078]目的基因TRADD融合GFP与FLag，共同表达的融合蛋白TRADD-GFP-Flag理论大小为64X 103。用β-actin作内参,通过Western blot检测，可以观察到实验组55-72X IO3处有阳性条带，其大小与融合蛋白理论值相吻合，空白对照组无阳性条带表达。因此判断TRADD过表达慢病毒在HSFb、EFb细胞中获得了有效表达(图6、图7)。
[0079]2.6MTT法测定细胞增殖能力
[0080]TRADD慢病毒对EFb增殖有轻度促进作用，10ng/ml TNF- α、TRADD慢病毒联合IOng / ml TNF-α对EFb增殖均无明显影响(图8)。TRADD慢病毒、IOng / ml TNF-α、TRADD慢病毒联合10ng/ml TNF-α对HSFb增殖均有抑制作用，TRADD慢病毒联合IOng /ml TNF-α的抑制作用更为明显(图9)。
[0081]2.7流式细胞仪检测细胞周期与凋亡
[0082]TRADD 慢病毒、10ng/ml TNF- α、TRADD 慢病毒联合 10ng/mlTNF- α 对 EFb 细胞周期及凋亡均无明显影响(图10)。TRADD慢病毒引起HSFb G2 / M期阻滞，10ng/ml TNF-α可促进TRADD慢病毒引起的G2 / M期阻滞作用的发生，TRADD慢病毒联合10ng/ml TNF-α引起HSFb亚Gl期凋亡峰的出现，说明HSFb细胞分裂受到抑制，有凋亡现象发生(图11)。
[0083]2.8ELISA检测胶原蛋白合成
[0084](I) EFb胶原蛋白:与空白组、空白组+TNF- α组比较，实验组在24h分泌I型胶原蛋白的含量增多，P < 0.05(表一)。
[0085]⑵HSFb胶原蛋白:与空白组比较，空白组+TNF- α组在72h分泌的I型胶原蛋白含量减少，P < 0.01，实验组与实验组+TNF- α在24h、48h、72h分泌的I型胶原蛋白含量减少，P < 0.01，实验组+TNF-α组减少尤为明显(表二)。
[0086]表一:EFb I型胶原蛋白表达量的校正值:(1 土s)
组别24h4 Sh72h
空白组0.083士0.005 0.201士0.010 0.236士0.008
[0087]2 白组+INF-Ct0.082±0.005 0.1 卯士 0.0140.224士 0.010
实验组0.09S±0.008ab 0.185±0,0110.224±0.019
实验组+TNF-α0.0S8±0.011 0.194±0_0100.216±0.014
[0088]注:与同一时点上空白组比较，aP< 0.05，与同一时间点上空白组+TNF-α比较，bP < 0.05
[0089]表二:HSFb I型胶原蛋白表达量的校正值土s)
【权利要求】
1.TRADD基因过表达慢病毒在抑制皮肤疤痕形成或治疗皮肤疤痕中的应用，其特征在于所述的TRADD基因过表达慢病毒通过如下方法制备而成: (1)TRADD基因为模板，采用PCR法扩增目的片段，扩增引物序列为:
TRADD-F:5’ -CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCAGCTGGGCAA AATG-3’ ；
TRADD-R:5’ -CCATGGTGGCGAATTCGGCCAGGCCGCCATTGG-3’: PCR产物回收纯化后与EcoR I酶切线性化的表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro进行重组连接，37°C孵育15min，再50°C孵育15min，立即转化DH5a感受态细胞，最后将已转化的感受态细胞转移至含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37°C培养16h ； (2)接种阳性克隆，保种并分装100μ I进行测序，测序验证无误后，接种抽提质粒: (3)选择生长状态良好的293FT细胞进行包装:取慢病毒表达载体pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro3 μ 1、virapower packing mix9 μ I 轻柔混合于 1.5ml 无血清 Opt1-MEM I 中，形成溶液 A ;将 36 μ lLipofectamine2000 与 1.5ml 无血清 Opt1-MEMI混合形成溶液B,并室温孵育5min ;再将溶液A和B混合，室温孵育20min,形成DNA-Lipofectamine2000复合物，直接转染293FT细胞，转染48h后，收集病毒液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于改善皮肤疤痕的平整度和/或色泽均匀度，优选为同时改善平整度和色泽均匀度。
3.权利要求1所述的 TRADD基因过表达慢病毒。
【文档编号】C12N7/01GK103446188SQ201310391083
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】彭贵勇, 袁月, 康秀峰, 刘云杰, 代剑华 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院