一种筛选细菌新菌种的方法
【专利摘要】本发明提供了一种筛选细菌新菌种的方法，其步骤如下：（1）富集培养样品中的细菌并对其进行分离纯化；（2）PCR纯化产物的16S?rDNA、克隆、测序；（3）筛出与NCBI数据库中16SrDNA序列同源性低于97%的序列；（4）PCR含有目标菌种16S?rDNA序列克隆子16S?rDNA可变区；（5）再次纯化含目标菌种的菌液，PCR其16S?rDNA可变区；（6）对步骤（5）中16S?rDNA可变区样品进行变性梯度凝胶电泳，以步骤（4）中PCR产物为标记物，筛出含有目标菌种且电泳条带最少的纯化产物；（7）以步骤（6）中筛选出的纯化产物为基础，重复步骤（5）、（6）的操作，直到获得纯化的新菌种。
【专利说明】一种筛选细菌新菌种的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，特别涉及一种将传统微生物分离技术与现代分子生物技术结合来筛选细菌新菌种的方法。
【背景技术】
[0002]传统的微生物筛选方法主要是通过观察微生物的个体形态、菌落形态以及一些生理生化特征对筛选所得微生物进行初步分门归属，该方法对于筛选一些常见微生物较为实用，但往往只能将微生物的分类学地位确定到属。对于分离纯化尚未被培养的新菌种而言，由于环境中存在的微生物类别复杂，一些微生物的菌落形态特征以及个体形态差别甚微，特别是同一个属下不同种的微生物，新菌种的个体形态特征、菌落形态可能与已知菌种十分接近，并且筛选者并非对所有微生物的形态都了然，在筛选过程中极易出现漏筛和错筛新菌种的情况，因而通过观察的方法来指导筛选新菌种的准确性不高、难度大。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种筛选细菌新菌种的方法，该方法准确、快速，可避免传统筛选方法的盲目性及随机性。
[0004]一种筛选细菌新菌种的方法，步骤如下:
[0005](I)富集培养样品中的细菌并对其进行分离纯化，得到第一代纯化产物；
[0006](2)提取、纯化步骤(I)中每一个第一代纯化产物的总DNA，然后PCR扩增其16SrDNA，将所得总16S rDNA插入到原核载体中构建原核重组质粒，然后将原核重组质粒转化至感受态细胞中培养，筛选出阳性克隆子，提取阳性克隆子质粒，并对其进行酶切分析，将酶切图谱相同的归为同一个 分类操作单位，从每个分类操作单位中取I~2个克隆子的质粒进行测序；
[0007](3)分别将步骤(2)中测得的16S rDNA序列与NCBI数据库中的16S rDNA序列进行比对，筛选出与NCBI数据库中的16S rDNA序列同源性低于97%的序列，即目标菌种16SrDNA 序列；
[0008](4)取含有目标菌种16S rDNA序列的克隆子，提取其质粒，PCR扩增质粒中的16SrDNA可变区，并将PCR扩增产物保存备用；
[0009](5)将含目标菌种的第一代纯化产物进一步分离纯化，得第二代纯化产物，PCR扩增每一个第二代纯化产物的16S rDNA可变区；
[0010](6)分别对步骤(5)获得的16S rDNA可变区样品进行变性梯度凝胶电泳，以步骤
(4)所得PCR扩增产物为标记物，筛选出含有目标菌种且电泳条带最少的第二代纯化产物；
[0011](7)以步骤(6)中筛选出的纯化产物为基础，重复步骤(5)、(6)的操作对所述纯化产物进行进一步的分离纯化，直到16S rDNA可变区样品的电泳条带中只含有与标记物的电泳条带位置一致的电泳条带，即筛选得到纯化的新菌种。
[0012]上述方法中，细菌的培养条件及培养基的组成参照样品细菌群落中的优势菌种的相似菌中的培养条件及培养基的组成来确定；所述优势菌种的相似菌种可由下述方法确定:通过细菌样品的16S rDNA的分子克隆文库获知细菌样品中占优势的16S rDNA序列，将优势16S rDNA序列与NCBI数据库中的16S rDNA序列进行比对，筛选获得与优势16S rDNA序列同源性最高的菌种，即为相似菌种。
[0013]上述方法中，细菌的培养条件及培养基的组成也可根据目标菌种的功能特点来确定。
[0014]上述方法中，对细菌进行分离纯化时，采用亨盖特严格厌氧技术对严格厌氧细菌进行分离纯化。
[0015]上述方法中，步骤(2)所述原核载体为pUCm-T，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5a感受态细胞。
[0016]上述方法中，对细菌进行分离纯化时，应挑取所有菌落形态不同的单菌落进行培养。
[0017]上述方法中，所述挑取所有菌落形态不同的单菌落进行培养时，最好从每个单菌落中挑取2~3个样品进行培养。
[0018]上述方法中，所述进行变性梯度凝胶电泳时，若16S rDNA可变区样品的电泳条带中含有与所述标记物电泳条带位置一致的条带，则该16S rDNA可变区样品对应的菌液中含有目标菌种，16S rDNA可变区样品的电泳条带越少，表明该16S rDNA可变区样品对应的菌液中目标菌种的纯化程度越 高，下一步纯化时便以该菌液为基础；若16S rDNA可变区样品的电泳条带中只含有与标记物的电泳条带位置一致的电泳条带时，表明该16S rDNA可变区样品对应的菌液中只含有目标菌种，纯化完成。
[0019]上述方法中，在步骤(7)获得纯化的新菌种后，对所得纯化的新菌种进行16S rDNA测序，并将测得的16S rDNA序列与NCBI数据库中的16S rDNA序列进行比对，以确保纯化的菌种为新菌种。
[0020]本发明具有以下优点及有益的技术效果:
[0021]1.本发明为细菌新菌种的筛选提供了一种新方法，该方法采用聚合酶链式反应、16S rDNA克隆、酶切分析、分子测序等技术获得细菌的16S rDNA序列，根据16S rDNA序列可准确、快速地判断样品中是否含有新菌种，即目标菌种，从而有针对性地对含有新菌种的样品进行后续的分离纯化操作，可避免筛选的盲目性，减少不必要的筛选过程。
[0022]2.本发明所述方法，在确定样品中含有新菌种后，在分离纯化新菌种的过程中结合了变性梯度凝胶电泳技术，根据变性梯度凝胶电泳的条带位置及数量来判断目标新菌种在筛选过程中是否被漏筛以及被纯化的程度，从而保证分离纯化过程的准确及快速，避免筛选过程的随机性，显著降低筛选过程中新菌种损失的概率。
[0023]3.本发明所述方法与传统方法相比较，在获得相同筛选准确度的情况下，能节约筛选新菌种的时间和成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明所述方法的筛选过程示意图，图中N为> 2的正整数；
[0025]图2是实施例1筛选获得的纯的菌液的变性梯度凝胶电泳图谱，其中I为标记物的16S rDNA V7-V8区电泳条带，2为纯化的新菌种的16S rDNA V7-V8区电泳条带；[0026]图3是实施例1筛选获得的新菌种的电子显微镜图片。
【具体实施方式】
[0027]以下结合实施例，对本发明所述筛选细菌新菌种的方法作进一步说明，其中未作详细阐述的具体实验条件的，均按照本领域技术人员熟知的常规操作进行，或参照厂商所建议的条件。
[0028]实施例1
[0029]本实施例以窖泥中严格厌氧细菌新菌种Aminobacterium shui jingfangii的筛选为例，其保藏单位为中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC10731T，具体说明本发明所述筛选细菌新菌种的方法，具体步骤如下:
[0030]窖泥来源于水井坊股份有限公司窖龄为20年的窖池。
[0031]图1是本发明所述方法的筛选过程示意图。 [0032]1、样品中细菌的富集培养及分离纯化
[0033]通过细菌16S rDNA克隆文库分析所述窖泥样品中细菌的群落结构组成，得知NCBI登陆号为AB699891的16S rDNA序列是窖泥样品中的优势序列，以该序列与NCBI数据库Blast同源性比对，结果显示该优势序列与Petrimonas sulfuriphila BN3的同源性最高，其同源性为99%,所以Petrimonas sulfuriphila BN3的培养条件选择培养基组成及培养条件，参见文献-1nternational Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(2005), 55, 1113 - 1121:Petrimonas sulfuriphila gen.nov., sp.nov., amesophilic fermentative bacterium isolated from a biodegraded oil reservoir。
[0034]下述培养过程中采用的培养基均为严格厌氧菌培养基，其组成如下:
[0035](I)液体培养基:氯化铵NH4Cl0.33g、磷酸二氢钾KH2PO40.33g、氯化钾KC10.33g、酵母提取物0.5g、胰蛋白胨3g、半胱氨酸盐酸盐0.5g、l.0mL微量元素溶液SL_10、10mL维生素溶液141、乳酸钠1.68g、质量分数为1%的氯化钙溶液33mL、质量分数为2%的氯化镁溶液16.5mL、刃天青lmL、蒸馏水IOOOmL,煮沸半小时，分装时通入N2与CO2的混合气体，N2与CO2的体积比为4:1;
[0036]所述维生素溶液141的配方如下:
[0037]
【权利要求】
1.一种筛选细菌新菌种的方法，其特征在于步骤如下: (1)富集培养样品中的细菌并对其进行分离纯化，得到第一代纯化产物； (2)提取、纯化步骤(I)中每一个第一代纯化产物的总DNA，然后PCR扩增其16SrDNA，将所得总16S rDNA插入到原核载体中构建原核重组质粒，然后将原核重组质粒转化至感受态细胞中培养，筛选出阳性克隆子，提取阳性克隆子质粒，并对其进行酶切分析，将酶切图谱相同的归为同一个分类操作单位，从每个分类操作单位中取I~2个克隆子的质粒进行测序； (3)分别将步骤(2)中测得的16SrDNA序列与NCBI数据库中的16S rDNA序列进行比对，筛选出与NCBI数据库中的16S rDNA序列同源性低于97%的序列，即目标菌种16SrDNA序列； (4)取含有目标菌种16SrDNA序列的克隆子，提取其质粒，PCR扩增质粒中的16S rDNA可变区，并将PCR扩增产物保存备用； (5)将含目标菌种的第一代纯化产物进一步分离纯化，得第二代纯化产物，PCR扩增每一个第二代纯化产物的16S rDNA可变区； (6)分别对步骤(5)获得的16SrDNA可变区样品进行变性梯度凝胶电泳，以步骤(4)所得PCR扩增产物为标记物，筛选出含有目标菌种且电泳条带最少的第二代纯化产物； (7)以步骤(6)中筛选出的纯化产物为基础，重复步骤(5),(6)的操作对所述纯化产物进行进一步的分离纯化，直到16S rDNA可变区样品的电泳条带中只含有与标记物的电泳条带位置一致的电泳条带，即筛选得到纯化的新菌种。
2.根据权利要求1所述筛选细菌新菌种的方法，其特征在于细菌的培养条件及培养基的组成参照样品细菌群落中的优势菌种的相似菌种的培养条件及培养基的组成来确定，或者根据目标菌种的功能特点来确定。
3.根据权利要求1所述筛选细菌新菌种的方法，其特征在于对细菌进行分离纯化时，采用亨盖特严格厌氧技术对严格厌氧细菌进行分离纯化。
4.根据权利要求2所述筛选细菌新菌种的方法，其特征在于对细菌进行分离纯化时，采用亨盖特严格厌氧技术对严格厌氧细菌进行分离纯化。
5.根据权利要求1至4中任一项所述筛选细菌新菌种的方法，其特征在于步骤(2)所述原核载体为pUCm-T，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5 α感受态细胞。
6.根据权利要求1至4中任一项所述筛选细菌新菌种的方法，其特征在于对细菌进行分离纯化时，应挑取所有菌落形态不同的单菌落进行培养。
7.根据权利要求6所述筛选细菌新菌种的方法，其特征在于所述挑取所有菌落形态不同的单菌落进行培养时，从每个单菌落中挑取2~3个样品进行培养。
【文档编号】C12N1/20GK103468802SQ201310392561
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】张文学, 黄丹, 刘超兰, 吴正云, 李文芳, 张劲, 罗青春 申请人:四川大学