一种恩拉霉素的发酵方法
【专利摘要】本发明涉及一种恩拉霉素发酵方法，该方法通过在一定的发酵周期内，向恩拉霉素发酵液中添加包括诸如精氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、赖氨酸等一种或多种氨基酸或其盐来实现。本发明方法能大幅提高恩拉霉素产量，并且方便适合工业化生产。
【专利说明】一种恩拉霉素的发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明微生物发酵【技术领域】，尤其涉及一种恩拉霉素的发酵方法。
【背景技术】
[0002] 抗生素自首次以低浓度添加到动物饲料中用于促生长至今已有近60年的历史。 由于药物残留和耐药性问题，许多传统抗生素被限制使用。恩拉霉素作为一种新型肽类抗 生素，以其具有稳定、广谱、无残留、不产生耐药性等优点；以其在公共方面的安全性，作为 专用的抗生素类饲料添加剂，其应用正日益受到关注。
[0003] 恩拉霉素（Enramycin)是由杀真菌链霉菌（Streptomyces fungicidicus)发酵 而得，又名安来霉素、持久霉素等，由包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分 子所组成。是以不同的氨基酸为底物，由非核糖体聚肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)催化合成的聚肽类抗生素，其脂环骨架包含天冬氨酸、苏氨酸、鸟氨 酸、瓜氨酸、甘氨酸等多种氨基酸。恩拉霉素根据其末端脂肪酸种类不同，分为恩拉霉素 A(C107H138C12N26031)和恩拉霉素 B(C108H140C12N26031)两个组分，恩拉霉素则是由这 两种成分组成的混合物。
[0004] 恩拉霉素于1966年由日本武田药品工业株式会社研发，其后在许多国家被注册 和广泛使用。1993年，我国农业部批准该药在我国注册。2005年，国内生产企业与国外公 司开始合作生产恩拉霉素预混剂。随着其他饲用抗生素逐步淘汰，恩拉霉素的使用势必会 越来越广泛，但是恩拉霉素的工业生产一直面临产能产量低的问题。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中恩拉霉素的发酵产量低的技术问题，本发明提出一种提高恩 拉霉素发酵产量的方法。
[0006] 本发明涉及一种提高恩拉霉素发酵产量的方法，包括在发酵中前期向恒温发酵培 养的恩拉霉素发酵液中添加一种或多种氨基酸和/或其盐。
[0007] 其中，所述的氨基酸和/或其盐选自精氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、赖氨酸 和/或其盐。
[0008] 其中，添加量以质量百分比计分别为：精氨酸/或其盐0.01-0. 1 %、苯丙氨酸/ 或其盐0.01-0. 1%、天冬氨酸/或其盐0.005-0. 05%、苏氨酸/或其盐0.005-0. 05%、赖 氨酸/或其盐0.01-0. 3%。
[0009] 其中，所述的恒温发酵培养的培养温度为25-30°C ;培养基pH为6. 5-7. 5。
[0010] 其中，所述向培养基中添加氨基酸和/或氨基酸盐的时间为开始发酵0-120小时 内，优选为0-64小时内，更优选为0-24小时内。
[0011] 其中，所述恩拉霉素发酵使用的培养基以质量百分比计为玉米粉7-12%、麦芽糊 精8-16%、麸质粉3-6%、玉米浆(λ 5-2. 0%、豆油1-3%、碳酸钙(λ 5-L 0%。
[0012] 其中，所述方法包括以下步骤：斜面孢子培养：将杀真菌链霉菌无菌接入斜面孢 子培养基，温度25-30°C、相对湿度40-60 %恒温培养8-12天；种子与发酵培养：将孢子 悬浮液接入种子培养基，25-30°C培养40-60小时，然后无菌接入发酵培养基，接种量以 体积百分比计为5-15%，25-30°C培养180-240小时；在发酵周期内使用氨水调节发酵 ρΗ6· 5-7. 5〇
[0013] 本发明通过在一定的发酵周期，添加一种或者几种氨基酸（或氨基酸盐），使恩拉 霉素的生物合成具有更丰富、更均衡的底物组合，从而大幅提高恩拉霉素的发酵产量。本发 明适合工业化生产，具有很高的实用价值和意义。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0015] 以下实施例中孢子培养和种子培养均米用统一培养方式，温度误差< 〇. 5°C、相对 湿度误差彡10%、pH误差彡0. 5。
[0016] 斜面孢子培养：将杀真菌链霉菌（Streptomyces fungicidicus)(郑州但开生物 工程技术有限公司，恩拉霉素产生菌系杀真菌素链霉菌突变菌株，商品号：BKSFJ06)无菌 接入斜面孢子培养基，温度28°C、相对湿度40-60%恒温培养10天；斜面孢子培养基包括成 分：玉米淀粉50g / L、麦芽糊精30g / L、蛋白胨8g / L、鱼胨6g / L、琼脂20g / L。
[0017] 种子发酵培养：将含有约3X101(I个孢子的孢子悬浮液无菌接入IOL种子培养基， 28°C培养48小时；种子培养基包括成分：玉米淀粉50g / L、麦芽糊精30g / L、玉米浆 15g / L、麸质粉 IOg / L、碳酸钙 6g / L、pH7.2。
[0018] 各实施例的其它参数：
[0019] 实施例1 :将培养好的种子液无菌接入60L发酵培养基，接种量6L，25°C培养180 小时，发酵过程用氨水调节PH6. 5;发酵培养基包含的成分以质量百分比计玉米粉7%、麦 芽糊精12%、麸质粉4%、玉米浆1.0%、豆油1 %、碳酸钙1.0%、氨水调节pH7. 5。
[0020] 实施例2 :将培养好的种子液无菌接入50L发酵培养基，接种量7L，25°C培养180 小时，发酵过程用氨水调节PH6. 5 ;发酵培养基包含的成分以质量百分比计玉米粉10%、麦 芽糊精8 %、麸质粉4%、玉米浆1. 5 %、豆油2 %、碳酸钙1. 0 %、氨水调节pH7. 2。
[0021] 实施例3 :将培养好的种子液无菌接入50L发酵培养基，接种量4L，28°C培养200 小时，发酵过程用氨水调节PH6. 8 ;发酵培养基包含的成分以质量百分比计玉米粉10%、麦 芽糊精12 %、麸质粉6 %、玉米浆1. 2 %、豆油3 %、碳酸钙0. 8 %、氨水调节pH7. 0。
[0022] 实施例4 :将培养好的种子液无菌接入60L发酵培养基，接种量7L，28°C培养220 小时，发酵过程用氨水调节PH7. 0 ;发酵培养基包含的成分以质量百分比计玉米粉12%、麦 芽糊精12 %、麸质粉4%、玉米浆0. 5 %、豆油2 %、碳酸钙1. 0 %、氨水调节pH6. 8。
[0023] 实施例5 :将培养好的种子液无菌接入80L发酵培养基，接种量4L，28°C培养220 小时，发酵过程用氨水调节PH7. 0 ;发酵培养基包含的成分以质量百分比计玉米粉10%、麦 芽糊精14%、麸质粉5 %、玉米浆2. 0 %、豆油2 %、碳酸钙1. 0 %、氨水调节pH6. 5。
[0024] 实施例6 :将培养好的种子液无菌接入60L发酵培养基，接种量6L，30°C培养240 小时，发酵过程用氨水调节PH7. 5;发酵培养基包含的成分以质量百分比计玉米粉8%、麦 芽糊精16 %、麸质粉3 %、玉米浆1. 5 %、豆油2 %、碳酸钙1. 0 %、氨水调节pH6. 5。
[0025] 本发明对发酵液最终恩拉霉素含量的检测采用HPLC外标法：取60g恩拉霉素发 酵液，加入120ml甲醇，用IM盐酸调节pH至3. 0-4. 5,放置摇床上振摇2-4小时，摇床转速 220-230rpm，2000转离心20分钟取上清进样检测。采用HPLC法，使用安捷伦公司HPLC设 备，米用66111；[11丨（]18柱（4.61150_，5_;?11611〇11161161)，以乙臆（色谱级）：5〇1111憐酸二氢 钠缓冲液=30 :70,流速ImL / min，在267nm处检测，柱温35°C，定量分析样品中恩拉霉素 含量，进样量10 μ L。
[0026] 实施例1
[0027] 在发酵第0小时、24小时、64小时、120小时分别添加为0. 01 %、0. 05%、0. 1 %的 精氨酸或其盐（占总发酵液质量百分比计，下同），对照组不添加任何氨基酸，发酵完成时 分别测各组发酵液的恩拉霉素含量，结果如表1所示：
[0028] 表1不同时间添加不同浓度的精氨酸或其盐后发酵液的恩拉霉素含量（g / L)
[0029]
【权利要求】
1. 一种恩拉霉素发酵方法，其特征在于，向恒温发酵培养的恩拉霉素培养基中添加一 种或多种氨基酸和/或其盐。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氨基酸和/或其盐为：精氨酸、苯丙 氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、赖氨酸和/或其盐。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的以质量百分比计，所添加的量分 别为精氨酸/或其盐0.01-0. 1%、苯丙氨酸/或其盐0.01-0. 1%、天冬氨酸/或其盐 0? 005-0. 05%、苏氨酸/或其盐0? 005-0. 05%、赖氨酸/或其盐0? 01-0. 3%。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的恒温发酵的培养温度为25-30°C，培 养基 pH 为 6. 5-7. 5。
5. 如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述向培养基中添加氨基酸和/ 或其盐的时间为开始发酵0-120小时内。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述向培养基中添加氨基酸和/或其盐的 时间为开始发酵0-64小时内。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述向培养基中添加氨基酸和/或其盐的 时间为开始发酵0-24小时内。
8. 如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述恩拉霉素发酵使用的培养基 以质量百分比计为玉米粉7-12 %、麦芽糊精8-16 %、麸质粉3-6 %、玉米浆0. 5-2. 0 %、豆油 1-3%、碳酸钙 0. 5-1. 0%。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于包括以下步骤：斜面孢子培养：将杀真菌链霉 菌无菌接入斜面孢子培养基，温度25-30°C、相对湿度40-60%恒温培养8-12天； 种子与发酵培养：将孢子悬浮液接入种子培养基，25-30°C培养40-60小时，然后无菌 接入发酵培养基，接种量以体积百分比计为5-15%，25-30°C培养180-240小时； 在发酵周期0-120小时内，补入氨基酸和/或其盐，使用氨水调节发酵pH6. 5-7. 5。
【文档编号】C12R1/465GK104419740SQ201310395254
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】刘俭国, 焦龙, 唐慧慧, 张翠勤, 王玉梅, 孔卫红, 刘新凯, 王勤波, 王鑫, 鲍金庆, 张锐, 张增辉, 李磊, 董易凡, 李翠平 申请人:河南天方药业股份有限公司