发酵培养基及制备方法和应用、乳酸菌葡聚糖的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵培养基及制备方法和应用、乳酸菌葡聚糖的制备方法。所述的发酵培养基的制备方法为：将番茄汁水溶液与蔗糖混合至溶解，用碱调节pH，灭菌，即可；所述的番茄汁蔗糖培养基的pH为5.0～10.0。所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法为：（1）将肠膜明串珠菌（Leuconostoc?mesenteroides）发酵菌种接种于发酵培养基中，好氧培养，得发酵液；（2）将所述的发酵液加热，冷却，稀释，离心，取上清液直接加入乙醇，静置，收集沉淀物并溶于水，直接干燥，即可。本发明提供的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，采用该发酵培养基制备的葡聚糖产量比采用传统化学合成培养基制备的葡聚糖的产量更高。
【专利说明】发酵培养基及制备方法和应用、乳酸菌葡聚糖的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种发酵培养基及制备方法和应用、乳酸菌葡聚糖的制备方法。
【背景技术】
[0002]以微生物为来源的多糖尤其是胞外多糖，是某些特定微生物(如乳酸菌、土壤杆菌、根瘤菌等)在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类由单一或多种单糖以糖苷键聚合而成的高分子化合物。其中，依附于微生物细胞壁外的多糖被称为荚膜多糖，而粘液多糖则以渗透于生长环境中的形式存在。
[0003]大量研究证实，乳酸菌胞外多糖不但可以赋予发酵乳制品特殊的风味、改善产品质地与稳定性，还具有一定的降血脂、调节免疫和抗肿瘤等保健功能。因此，在食品添加剂(如增稠剂、乳化剂、稳定剂等)的安全性受到广泛关注的情况下，乳酸菌胞外多糖因为其良好的安全性和卓越的生理与加工性能，在医药、日用化妆品和食品行业得到广泛的应用。
[0004]众所周知，明串珠菌是一类高产胞外多糖的乳酸菌，其中，肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)可以合成多种类型的葡聚糖(一种以葡萄糖为单糖组成单位，由α-1，3、α-1，4或α _1，6糖苷键键合而成的葡萄糖高分子聚合物)，其中，右旋糖苷(一种主要由葡萄糖以α-1，6糖苷键聚合而成的高分子葡聚糖)因具有良好的膨胀性而作为代血衆在医药工业上得到广泛应用。由肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)产生的各种葡聚糖的应用相当广泛，不仅可作为食品中低热量食品添加剂来使用，而且在医药领域还具有调节免疫、抗癌等临床功效。
[0005]然而在目前由明串珠菌制备葡聚糖的工艺中，发酵基料的组成复杂、部分成分来源紧缺，导致发酵基料成本高昂；采用这些基料发酵后，在提取制备多糖的过程中，通常为了去除蛋白质等干扰物质而加入氯仿、正丁醇、三氟三氯乙烷、三氯乙酸等有机溶剂，这些因素对商业化生产的成本、多糖的品质以及多糖在食品、医疗领域应用的安全性均存在不良影响。
[0006]因此，寻找一种来源广泛、价格低廉的明串珠菌产糖介质，同时提高明串珠菌发酵广生的匍聚糖的提取效率和品质，是明串珠菌多糖制备方法的关键。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题在于克服了现有技术中的葡聚糖制备工艺的发酵培养基成本闻、存在有机溶剂残留等缺陷，提供了一种生广成本低、工艺简洁、制备效率闻并能广泛工业应用的发酵培养基及制备方法和应用、乳酸菌葡聚糖的制备方法。
[0008]本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的:
[0009]本发明提供一种发酵培养基，所述的发酵培养基为番茄汁蔗糖培养基，其包括蔗糖和番茄汁水溶液。
[0010]所述的番茄汁蔗糖培养基中，所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积比较佳地为lg: 20mL~lg: 5mL,更佳地为lg:1OmL~lg: 5mL,尤其更佳地为3g:20mL。所述的番茄汁水溶液中番茄汁的浓度较佳地为20%~100%，更佳地为100%，所述的百分比为体积百分比。
[0011]本发明还提供所述的番茄汁蔗糖培养基的制备方法。该制备方法包括下述步骤:将番茄汁水溶液与蔗糖混合至溶解，用碱调节pH，灭菌，即可；所述的番茄汁蔗糖培养基的pH 为 5.0 ~10.0。
[0012]所述的番茄汁蔗糖培养基的pH较佳地为6.0~10.0，更佳地为7.0。用碱调节前，番茄汁水溶液与蔗糖的混合液的PH —般为4.3~4.5。所述的溶解为本领域常规操作，较佳地为先加热后冷却。
[0013]其中，所述的番茄汁水溶液中的番茄汁采用本领域常规制备方法制得，一般包括如下步骤:将成熟番茄洗净、去皮后，进行机械破碎，分离，取上清液，即可。
[0014]所述的分离为本领域常规分离技术，较佳地为过滤、抽滤和离心中的一种或多种；其中，所述的过滤的介质为本领域常规，较佳地为多层纱布或无纺布；所述的离心为本领域常规操作，较佳地为2000g~3000g，IOmin~20min离心。
[0015]所述的碱为本领域常规，较佳地为食品级碱，更佳地为Na2C03、NaHC03和NaOH中的一种或多种。所述的灭菌为本领域常规操作，所述的灭菌的温度较佳地为95°C~125°C;所述的灭菌的时间较佳地为5min~30min。
[0016]按照上述方法制得的番茄汁的主要理化指标为:固形物含量3.28g/100mL~
4.04g/100mL，灰分 0.46g/100mL ~0.59g/100mL，蛋白质 0.39g/100mL ~0.52g/100mL，月旨肪 0.014g/100mL ~0.020g/100mL，碳水化合物 2.42g/100mL ~2.88g/100mL。
[0017]本发明还提供所述的番茄汁蔗糖培养基在制备乳酸菌葡聚糖中的应用。
[0018]本发明还提供了一种乳酸菌葡聚糖的制备方法，其包括如下步骤:
[0019](I)将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)发酵菌种接种于前述番爺汁蔗糖培养基中，好氧培养，得发酵液；
[0020](2)将所述的发酵液加热，冷却，稀释，离心，取上清液直接加入乙醇，静置，收集沉淀物并溶于水，直接干燥，即可。
[0021]步骤(I)中,所述的发酵菌种为常规肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌种，较佳地为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LM57、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LM79、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LD106和保藏号为 CGMCC N0.6432 的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) BD1710中的一种或多种，更佳地为保藏号为CGMCC N0.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD1710。
[0022]步骤(I)中，在所述的接种时，所述的发酵菌种一般以种子液的形式接种，其中活菌数一般为 1.0XlO9 ~3.0X 109CFU/mL。
[0023]步骤(I)中，所述的接种为本领域常规操作，所述的发酵菌种的接种量较佳地为0.5%~4.0%，更佳地为2.0%~4.0%，尤其更佳地为2.0%，所述的百分比为种子液占番茄汁蔗糖培养基的体积百分比。
[0024]步骤(I)中，所述的好氧培养为本领域常规操作。所述的好氧培养的温度较佳地为25°C~34°C，更佳地为25°C~31 °C，尤其更佳地为28°C。所述的好氧培养的时间较佳地为24h~54h，更佳地为30h~54h，尤其更佳地为48h。所述的好氧培养的方式较佳地为摇床培养或发酵罐通气培养。
[0025]步骤(2)中，所述的加热和冷却为本领域常规操作，所述的加热的温度较佳地为95°C~100°C ;所述的加热的时间较佳地为IOmin~30min ;所述的冷却的终温较佳地为15?~25?。 [0026]步骤(2)中，所述的稀释的稀释剂为本领域常规使用的稀释剂，较佳地为无菌水。所述的无菌水与所述的发酵液的体积比较佳地为3:1~5:1。所述的离心为本领域常规操作，较佳地为7000g~13000g, IOmin~20min离心。
[0027]步骤(2)中，所述的乙醇的浓度较佳地为80%~100%，所述的百分比为体积百分t匕。所述的乙醇与所述的上清液的体积比较佳地为2:1~4:1。所述的静置为本领域常规操作，所述的静置的时间较佳地为4h~24h。所述的干燥为本领域常规技术，较佳地为直接冷冻干燥、在温度不超过115°C下干燥或真空冷冻干燥。
[0028]按照本发明的制备方法制得的乳酸菌葡聚糖，其主要理化指标为:水分
0.89g/100g ~2.19g/100g,灰分 0.19g/100g ~0.26g/100g,蛋白质 0.68g/100g ~
0.79g/100g，碳水化合物 96.87g/100g ~98.13g/100g。
[0029]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0030]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0031]本发明的积极进步效果在于:本发明提供的番茄汁蔗糖培养基的来源广泛、成本低廉、天然安全，而且经肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)发酵菌种发酵后获得的葡聚糖产量比采用传统化学合成培养基制备的葡聚糖的产量更高。本发明的制备方法克服了传统葡聚糖制备工艺中加入三氯乙酸等有机溶剂去蛋白所导致的残留困扰，其可作为一种新型的葡聚糖制备方法应用于科研、食品、制药和相关领域中，应用前景十分广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为28°C、180rpm的好氧条件下，不同接种量下乳酸菌葡聚糖产量的检测结果示意图。
[0033]图2为28°C、ISOrpm的好氧条件下，发酵液的pH不同时乳酸菌葡聚糖产量的检测
结果示意图。
[0034]图3为28°C、ISOrpm的好氧条件下，不同番茄汁浓度下乳酸菌葡聚糖产量的检测结果示意图。
[0035]图4为28°C、ISOrpm的好氧条件下，不同蔗糖浓度下乳酸菌葡聚糖产量的检测结果示意图。
[0036]图5为ISOrpm的好氧条件下，不同发酵温度下乳酸菌葡聚糖产量的检测结果示意图。
[0037]图6为乳酸菌葡聚糖糖基组成的色谱图。
[0038]图7为最佳条件下肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD1710在番爺汁蔗糖培养基和化学合成培养基中的产糖能力示意图。
【具体实施方式】[0039]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。[0040]本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。所述的发酵菌种为保藏号为CGMCC N0.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD1710,或丹尼克斯(中国)有限公司提供的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LM57、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)LM79、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)LD106中的一种。
[0041]下述实施例中:
[0042]番茄汁的制备:将成熟番茄清洗、去皮后，进行机械破碎，分离，取上清液，即可。其中，实施例1中的分离为多层纱布过滤，实施例2~6中的分离为抽滤，实施例7~10中的分离为2000g，20min离心。
[0043]发酵菌种(种子液)的制备:将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD1710的冻干粉以少量无菌蒸馏水溶解，用接种环挑取一环划线于M17蔗糖培养基(以5%(w/v)蔗糖取代M17培养基中0.5% (w/v)的乳糖，0X0IDLTD.，英国)上，28°C好氧培养24h后取出，用接种环挑取单菌落放入ImL M17蔗糖培养基中，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于该液体培养基内，28°C、180rpm摇床培养24h后取出，以2%( v/v)接种量接种于50mL上述M17鹿糖培养基中，再置于28°C、180rpm摇床培养24h,即可。肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) LM57、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LM79、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LD106的种子液的制备过程同上。
[0044]化学合成培养基的制备:将蛋白胨10g、酵母抽提物5g、蔗糖150g、K2HP0420g、MgSO4.7Η200.2g、MnSO40.01g、NaCl0.01g、CaCl20.02g、FeSO40.0lg 与 IL 蒸馏水均匀混合，充分溶解后，以碱调节pH至7.0,在100°C下灭菌IOmin,即可。
[0045]实施例1
[0046]将发酵菌种肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) BD1710 分别按 0.5%、
1.0%、2.0%、4.0%的接种量(所述的百分比为体积百分比)接入番茄汁蔗糖培养基中，所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁水溶液中番茄汁的浓度为100%，？!1为7.0，281:、180印111摇床培养，并在不同的好氧培养时间下，取发酵液制备葡聚糖并称重，实验结果见图1。
[0047]从图1可以看出，接种量为0.5% (v/v)的发酵液中葡聚糖含量为0.05g/L~29.84g/L，接种量为1.0% (v/v)的发酵液中葡聚糖含量为0.07g/L~30.50g/L，接种量为
2.0% (v/v)的发酵液中葡聚糖含量为0.12g/L~32.15g/L，接种量为4.0% (v/v)的发酵液中葡聚糖含量为0.13g/L~31.90g/L。由此可见，接种量较佳地为2.0% (v/v)~4.0%(v/v)，更佳的是2.0% (v/v)。发酵时间较佳地为30h~54h，更佳地为48h。
[0048]实施例2
[0049]将发酵菌种肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) BD1710 以 2.0% (v/v)的接种量分别接入初始PH为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0、10.0的番茄汁蔗糖培养基中，所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁水溶液中番茄汁的浓度为100%,28°C、180rpm摇床培养48h后取发酵液,制备葡聚糖并称重,实验结果见图2。[0050]从图2可以看出，采用初始pH为5.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为
7.20g/L，采用初始pH为6.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为26.72g/L，采用初始pH为7.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为32.15g/L，采用初始pH为8.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为26.00g/L，采用初始pH为9.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为25.30g/L，采用初始pH为10.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为24.80g/L。由此可见，番茄汁蔗糖培养基的初始pH较佳地为6.0~10.0，更佳的是7.0。
[0051]实施例3
[0052]将发酵菌种肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) BDl7IO 以 2.0% (v/v)的接种量分别接入番茄汁浓度为20%、40%、60%、80%、100% (v/v)，蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，初始pH为7.0的番茄汁蔗糖培养基中，28°C、180rpm摇床培养48h后取发酵液，制备葡聚糖并称重，实验结果见图3。
[0053]从图3可以看出，采用番茄汁的浓度为20% (v/v)的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为5.00g/L，采用番茄汁的浓度为40% (v/v)的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为
10.60g/L，采用番茄汁的浓度为60% (v/v)的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为14.40g/L，采用番茄汁的浓度为80% (v/v)的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为18.40g/L，采用番茄汁的浓度为100% (v/v)的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为32.15g/L。由此可见，番茄汁浓度较佳地为100% (v/v)。
[0054]实施例4
[0055]将发酵菌种肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) BD1710 以 2.0% (v/v)的接种量接入蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比分别为lg:20mL (以5.0%表示)、lg:1OmL(以10.0%表示)、3g:20mL (以 15.0%表示)、lg: 5mL (以20.0%表示)，番茄汁的浓度为100%,pH为7.0的番爺汁鹿糖培养基中，28°C、180rpm摇床培养,并于不同的好氧培养时间下,取发酵液，制备葡聚糖并称重，实验结果见图4。
[0056]从图4可以看出，采用蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为lg:20mL的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为0.02g/L~18.90g/L，采用蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为lg:1OmL的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为0.04g/L~29.10g/L，采用蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为0.03g/L~32.15g/L，采用蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为lg:5mL的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为0.04g/L~29.80g/L。由此可见，蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积较佳地为lg:1OmL~lg:5mL,更佳地为 3g:20mL。
[0057]实施例5
[0058]将发酵菌种肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) BD1710 以 2% (v/v)的接种量接入番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g: 20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0,分别置于25°C、28°C、31°C、34°C的好氧培养温度下、转速为ISOrpm的摇床培养48h发酵，取发酵液，制备葡聚糖并称重，实验结果见图5。
[0059]从图5可以看出，25°C的好氧培养条件下获得的发酵液中葡聚糖含量为29.40g/L，28°C的好氧培养条件下获得的发酵液中葡聚糖含量为32.15g/L，31°C的好氧培养条件下获得的发酵液中葡聚糖含量为28.20g/L，34°C的好氧培养条件下获得的发酵液中葡聚糖含量为16.72g/L。由此可见，好氧培养的温度较佳地为25°C~31 °C，更佳的为28°C。
[0060]实施例6
[0061]将发酵菌种肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD1710 以 2%(v/v)接种量接入番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g: 20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，28°C，并置于120rpm、180rpm、240rpm摇床培养48h,或以发酵罐通气培养的方式控制发酵液溶氧1.0mg02/L、3.0mg02/L、5.0mgO2/L进行好氧培养48h，发酵结束后取发酵液按上述方法制备葡聚糖，结果分别见表1和表2。
[0062]表1摇床培养测试结果
[0063]
【权利要求】
1.一种发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基为番茄汁蔗糖培养基，所述的番茄汁蔗糖培养基包括蔗糖和番茄汁水溶液。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积比为lg:20mL~lg:5mL,较佳地为lg:1OmL~lg:5mL,更佳地为3g:20mL;所述的番茄汁水溶液中番茄汁的浓度为20%~100%，较佳地为100%，所述的百分比为体积百分比。
3.—种如权利要求1或2所述的发酵培养基的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤:将番茄汁水溶液与蔗糖混合至溶解，用碱调节PH，灭菌，即可；所述的番茄汁蔗糖培养基的pH为5.0~10.0。
4.如权利要求3所述的发酵培养基的制备方法，其特征在于，所述的番茄汁蔗糖培养基的pH为6.0~10.0，较佳地为7.0。
5.如权利要求3所述的发酵培养基的制备方法，其特征在于，所述的番茄汁水溶液中的番茄汁由下述方法制得:将成熟番茄洗净、去皮后，进行机械破碎，分离，取上清液，即可；所述的分离为过滤、抽滤和离心中的一种或多种；其中，所述的过滤的介质为多层纱布或无纺布；所述的离心为2000g~3000g, IOmin~20min离心。
6.如权利要求3所述的发酵培养基的制备方法，其特征在于，所述的碱为食品级碱，较佳地为Na2C03、NaHC03和NaOH中的一种或多种；所述的灭菌的温度为95°C~125°C;所述的灭菌的时间为5min~30min。
7.—种如权利要求1或2所述的发酵培养基在制备乳酸菌葡聚糖中的应用。
8.一种乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤: (1)将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)发酵菌种接种于发酵培养基中，好氧培养，得发酵液；所述的发酵培养基为如权利要求1或2所述的发酵培养基； (2)将所述的发酵液加热，冷却，稀释，离心，取上清液直接加入乙醇，静置，收集沉淀物并溶于水，直接干燥，即可。
9.如权利要求8所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的发酵菌种为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LM57、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) LM79、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LD106 和保藏号为CGMCC N0.6432 的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) BD1710 中的一种或多种；所述的发酵菌种以种子液的形式接种，其中活菌数为1.0X IO9~3.0X 109CFU/mL;所述的发酵菌种的接种量为0.5%~4.0%，较佳地为2.0%~4.0%，更佳地为2.0%，所述的百分比为种子液占发酵培养基的体积百分比。
10. 如权利要求8或9所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的好氧培养的温度为25°C~34°C，较佳地为25 V~31°C，更佳地为28°C ;所述的好氧培养的时间为24h~54h，较佳地为30h~54h，更佳地为48h ;所述的好氧培养的方式为摇床培养或发酵罐通气培养； 步骤(2)中，所述的加热的温度为95°C~100°C;所述的加热的时间为IOmin~30min ；所述的冷却的终温为15°C~25°C ;所述的稀释的稀释剂为无菌水；所述的无菌水与所述的发酵液的体积比为3:1~5:1 ;所述的离心为7000g~13000g, IOmin~20min离心;所述的乙醇的浓度为80%~100%，所述的百分比为体积百分比；所述的乙醇与所述的上清液的体积比为2:1~4:1 ;所述的静置的时间为4h~24h ;所述的干燥为直接冷冻干燥、在温度不超过115°C下干燥或 真空冷冻干燥。
【文档编号】C12R1/01GK103468611SQ201310396237
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】韩瑨, 吴正钧, 刘振民, 郭本恒 申请人:光明乳业股份有限公司