真姬菇凝集素和脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于水果保鲜【技术领域】，具体提供了一种真姬菇凝集素和脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用。本发明提供了一种实施该应用的方法，将真姬菇凝集素或真姬菇脱蛋白多糖中的一种或两种，配制成涂膜保鲜液，将枇杷放在上述涂膜保鲜液中浸1~4min后取出，晾干，在常温条件下贮藏；所述涂膜保鲜液中真姬菇凝集素的质量百分比为：0.1％-0.2%，所述涂膜保鲜液中真姬菇脱蛋白多糖的质量百分比为：1％-2%。该应用采用生物天然提取物，应用到水果保鲜中，安全、无毒、有效，为鲜果保鲜开发有效方法。
【专利说明】真姬菇凝集素和脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于水果保鲜【技术领域】，具体涉及一种真姬菇凝集素和脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用。
【背景技术】
[0002]水果由于含有丰富的碳水化合物、有机酸、维生素及无机盐等，因而成为了人类重要的营养源。水果不仅味美可口，还具有降血压、减缓衰老、减肥瘦身、预癌症等优点。但水果生产存在较强的季节性、区域性以及水果本身的易腐性，这使得水果贮藏保鲜的问题日趋突出。目前，国内外在水果保鲜领域采用的保鲜手段主要有低温保鲜、气调保鲜、化学保鲜、生物保鲜等。虽然目前水果保鲜技术类型多样，但由于人们不仅对水果保鲜传统上的色、香、味要求提高，也更加关注食品的安全性，新型的保鲜技术主要集中在生物保鲜领域。生物保鲜技术在水果中的应用将主要集中在微生物菌体及其代谢产物的保鲜、生物天然提取物的保鲜及利用遗传基因进行保鲜三方面。目前，该类保鲜技术还处于研究阶段，作用机理不明确，相关技术也不成熟，还未得到广泛的应用。但是安全、无毒、环保的新型生物保鲜技术将会成为今后保鲜行业发展的重要方向。拟为开发安全、无毒、有效的天然抑菌齐?、保鲜剂提供一定的理论基础，为鲜果保鲜开发有效方法，于是研究一种真姬菇凝集素和脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用具有重要的意义。
【发明内容】
[0003]为了克服上述缺陷，本发明提供了一种真姬菇凝集素和脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用。
[0004]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
真姬菇凝集素在枇杷保鲜中的应用。
[0005]真姬菇脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用。
[0006]所述真姬菇凝集素是采用真姬菇为原料，结合硫酸铵盐析和PBS磷酸盐缓冲液透析技术提取得真姬燕凝集素粗品，利用DEAE-Sepharose Fast Flow (二乙胺乙基_琼脂糖凝胶)离子交换层析技术进行凝集素粗品纯化收集沉淀，经过脱盐后冷冻干燥得真姬菇凝集素。
[0007]所述真姬菇脱蛋白多糖是采用真姬菇为原料，利用水提醇沉法进行提取真姬菇抑菌多糖，经醇沉后收集多糖沉淀为菌丝粗多糖，将菌丝粗多糖应用Sevag法脱除其中的蛋白成分进行纯化，脱除蛋白后的多糖成分再经过真空冷冻干燥得真姬菇脱蛋白多糖。
[0008]所述的真姬菇凝集素或脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用，是将真姬菇凝集素或真姬菇脱蛋白多糖中的一种或两种，配制成涂膜保鲜液，将枇杷放在上述涂膜保鲜液中浸Ilmin后取出，晾干，在常温条件下贮藏；所述涂膜保鲜液中真姬菇凝集素的质量百分比为:0.1% -0.2%，所述涂膜保鲜液中真姬菇脱蛋白多糖的质量百分比为:1% -2%。
[0009]所述真姬菇凝集素具体制备步骤为:真姬菇以质量/体积比为1:(3~7)g/ml加入浓度为0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，在4°C下浸提24h，4°C、转速为8000r/min下冷冻离心40 min,取上清液；上清液通过硫酸铵盐析，收集40%-75%硫酸铵饱和度沉淀部分，沉淀复溶于浓度为0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，装入透析袋中除盐，透析至外透析液无S042-检出为止，冷冻干燥后即为凝集素粗品；将凝集素粗品上DEAE-Sepharose Fast Flow (二乙胺乙基-琼脂糖凝胶)柱，以 0.05mol/L,ρΗ=7.8 的 PBS憐酸盐缓冲液进行洗脱并分管收集，检测波长280nm，以兔血红细胞检测洗脱峰的凝血活性，将具有凝血活性的通过CM-Sepharose Fast Flow (羧甲基-琼脂糖凝胶)层析纯化,收集、脱盐后冷冻干燥即得真姬菇凝集素纯品。
[0010]所述真姬菇脱蛋白多糖具体制备步骤为:采用热水浸提法提取真姬菇多糖，称取湿重为500 g的真姬菇，按质量/体积比为(1-3): lg/ml加入蒸馏水，用高速组织捣碎机匀衆10 min,而后置于90°C水浴锅浸提8 h,5000 rpm离心5 min,取上清液冷冻干燥浓缩至原体积的1/10，加入3倍体积的质量浓度为95%乙醇沉淀，8000 rpm离心10 min,收集沉淀为菌丝粗多糖；菌丝粗多糖经Sevag法脱蛋白后，浓缩，加入质量浓度为95%乙醇沉淀，8000rpm离心10 min,沉淀物冷冻干燥即为真姬燕去蛋白多糖。
[0011]所述真姬菇原料可以是真姬菇下脚料或子实体。
[0012]所述PBS磷酸盐缓冲液是将Na2HPO4.12H20溶于蒸馏水中配制得到浓度为0.2mo I/L的Na2HPO4,将NaH2PO4.2H20溶于蒸馏水中配置得到浓度为0.2 mo I/L NaH2PO4 ;将制备得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的体积比混合后，在温度为121° C下灭菌30min，得到浓度为0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，储存于冷暗处，备用。
[0013]真姬菇子实体中含有多种活性物质，同时具有多种重要的功能作用，真姬菇下脚料和子实体一样也具有多种活性物质，其中含有大量具有活性的多糖和活性蛋白，抑菌活性就是其中一种重要的功能作用。结合食品科学中高效的提取技术，对真姬菇中抑菌多糖与凝集素进行有效提取并分离纯化，制备复合涂膜保鲜剂，研究复合涂膜保鲜剂对枇杷的高效保鲜作用。前期对真姬菇、双胞蘑菇、竹荪、香菇等食用菌开展大量的活性物质提取的试验并进行抑菌活性的研究，在此基础上，以真姬菇为实验材料，对真姬菇多糖和凝集素进行高效提取和分离纯化，获得较高纯度的抑菌多糖和凝集素，进行抑制枇杷炭疽病菌活性的初步研究，制备真姬菇多糖与凝集素复合保鲜涂膜，开展复合涂膜保鲜剂对枇杷鲜果的保鲜效果。
[0014]本发明的显著优点在于:
(I)该应用原料易得，采用下脚料作为原料减小成本，提高工业产值。
[0015](2)采用生物天然提取物，应用到水果保鲜中，安全无毒，减少污染，对人体健康有
[0016]( 3 )本发明应用对于枇杷保鲜效果明显，能具有较好的社会经济效益。
[0017](4)为开发安全、无毒、有效的天然抑菌剂、保鲜剂提供一定的理论基础，为枇杷鲜果保鲜开发有效方法。
[0018](5)本技术达到菌业废弃物资源化再利用的目的，资源化利用手段绿色环保，利用效果显著，同时实现真姬菇有效活性物质首次应用于枇杷保鲜。
【专利附图】
【附图说明】[0019]图1是真姬菇涂膜保鲜剂对枇杷失重率的影响。
[0020]图2是真姬菇涂膜保鲜剂对枇杷好果率的影响。
[0021]图3是真姬菇涂膜保鲜剂对枇杷保鲜效果，处理组I涂膜配方A，处理组2涂膜配方B。
[0022]图4是真姬菇提取物涂膜对枇杷有机酸含量的影响。
[0023]图5是真姬菇涂膜保鲜剂对枇杷VC含量的影响。
[0024]图6是枇杷鲜果储藏期间呼吸强度的变化。
[0025]图7是真姬菇涂膜保鲜剂对枇杷可溶性固形物的影响。
【具体实施方式】
[0026]下面的实例是为了进一步阐明本发明特征而非限制本发明。以下实施例为本发明较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应本发明的涵盖范围。
[0027]实施例1
真姬菇凝集素在枇杷保鲜中的应用。
[0028]真姬菇脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用。
[0029]所述真姬菇凝集素是采用真姬菇为原料，结合硫酸铵盐析和PBS磷酸盐缓冲液透析技术提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE离子交换层析技术进行凝集素粗品纯化收集沉淀，经过脱盐后冷冻干燥得真姬菇凝集素。
[0030]所述真姬菇脱蛋白多糖是采用真姬菇为原料，利用水提醇沉法进行提取真姬菇抑菌多糖，经醇沉后收集多糖沉淀为菌丝粗多糖，将菌丝粗多糖应用Sevag法脱除其中的蛋白成分进行纯化，脱除蛋白后的多糖成分再经过真空冷冻干燥得真姬菇脱蛋白多糖。
[0031]所述的真姬菇凝集素或脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用，是将真姬菇凝集素或真姬菇脱蛋白多糖中的一种或两种，配制成涂膜保鲜液，将枇杷放在上述涂膜保鲜液中浸Imin后取出，晾干，在常温条件下贮藏；所述涂膜保鲜液中真姬菇凝集素的质量百分比为:0.1%，所述涂膜保鲜液中真姬菇脱蛋白多糖的质量百分比为:2%。
[0032]所述真姬菇凝集素具体制备步骤为:真姬菇以质量/体积比为1:3g/ml加入浓度为0.05mol/L,pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，在4°C下浸提24h，4°C、转速为8000r/min下冷冻离心40 min,取上清液；上清液通过硫酸铵盐析，收集40%硫酸铵饱和度沉淀部分,沉淀复溶于浓度为0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，装入透析袋中除盐，透析至外透析液无S042-检出为止,冷冻干燥后即为凝集素粗品；将凝集素粗品上DEAE-Sepharose FastFlow柱，以0.05mol/L,pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液进行洗脱并分管收集，检测波长280nm，以兔血红细胞检测洗脱峰的凝血活性,将具有凝血活性的通过CM-Sepharose Fast Flow层析纯化，收集、脱盐后冷冻干燥即得真姬菇凝集素纯品。
[0033]所述真姬菇脱蛋白多糖具体制备步骤为:采用热水浸提法提取真姬菇多糖，称取湿重为500 g的真姬菇，按质量/体积比为1: lg/ml加入蒸馏水，用高速组织捣碎机匀浆10min,而后置于90°C水浴锅浸提8 h,5000 rpm离心5 min,取上清液冷冻干燥浓缩至原体积的1/10，加入3倍体积的质量浓度为95%乙醇沉淀，8000 rpm离心10 min,收集沉淀为菌丝粗多糖；菌丝粗多糖经Sevag法脱蛋白后，浓缩，加入质量浓度为95%乙醇沉淀，8000 rpm离心10 min，沉淀物冷冻干燥即为真姬菇去蛋白多糖。[0034]所述真姬菇原料为真姬菇下脚料。
[0035]所述PBS磷酸盐缓冲液是将Na2HPO4.12H20溶于蒸馏水中配制得到浓度为0.2mo I/L的Na2HPO4,将NaH2PO4.2H20溶于蒸馏水中配置得到浓度为0.2 mo I/L NaH2PO4 ;将制备得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的体积比混合后，在温度为121° C下灭菌30min，得到浓度为0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，储存于冷暗处，备用。
[0036]实施例2
真姬菇凝集素在枇杷保鲜中的应用。
[0037]真姬菇脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用。
[0038]所述真姬菇凝集素是采用真姬菇为原料，结合硫酸铵盐析和PBS磷酸盐缓冲液透析技术提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE离子交换层析技术进行凝集素粗品纯化收集沉淀，经过脱盐后冷冻干燥得真姬菇凝集素。
[0039]所述真姬菇脱蛋白多糖是采用真姬菇为原料，利用水提醇沉法进行提取真姬菇抑菌多糖，经醇沉后收集多糖沉淀为菌丝粗多糖，将菌丝粗多糖应用Sevag法脱除其中的蛋白成分进行纯化，脱除蛋白后的多糖成分再经过真空冷冻干燥得真姬菇脱蛋白多糖。
[0040]所述的真姬菇凝集素或脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用，是将真姬菇凝集素或真姬菇脱蛋白多糖中的一种或两种，配制成涂膜保鲜液，将枇杷放在上述涂膜保鲜液中浸4min后取出，晾干，在常温条件下贮藏；所述涂膜保鲜液中真姬菇凝集素的质量百分比为:0.2%，所述涂膜保鲜液中真姬菇脱 蛋白多糖的质量百分比为:1%。
[0041]所述真姬菇凝集素具体制备步骤为:真姬菇以质量/体积比为1:7g/ml加入浓度为0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，在4°C下浸提24h，4°C、转速为8000r/min下冷冻离心40 min,取上清液；上清液通过硫酸铵盐析，收集75%硫酸铵饱和度沉淀部分,沉淀复溶于浓度为0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，装入透析袋中除盐，透析至外透析液无S042-检出为止,冷冻干燥后即为凝集素粗品；将凝集素粗品上DEAE-Sepharose FastFlow柱，以0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液进行洗脱并分管收集，检测波长280nm，以兔血红细胞检测洗脱峰的凝血活性,将具有凝血活性的通过CM-Sepharose Fast Flow层析纯化，收集、脱盐后冷冻干燥即得真姬菇凝集素纯品。
[0042]所述真姬菇脱蛋白多糖具体制备步骤为:采用热水浸提法提取真姬菇多糖，称取湿重为500 g的真姬菇，按质量/体积比为3: lg/ml加入蒸馏水，用高速组织捣碎机匀浆10min,而后置于90°C水浴锅浸提8 h,5000 rpm离心5 min,取上清液冷冻干燥浓缩至原体积的1/10，加入3倍体积的质量浓度为95%乙醇沉淀，8000 rpm离心10 min,收集沉淀为菌丝粗多糖；菌丝粗多糖经Sevag法脱蛋白后，浓缩，加入质量浓度为95%乙醇沉淀，8000 rpm离心10 min，沉淀物冷冻干燥即为真姬菇去蛋白多糖。
[0043]所述真姬菇原料为真姬菇下脚料。
[0044]所述PBS磷酸盐缓冲液是将Na2HPO4.12H20溶于蒸馏水中配制得到浓度为0.2mo I/L的Na2HPO4,将NaH2PO4.2H20溶于蒸馏水中配置得到浓度为0.2 mo I/L NaH2PO4 ;将制备得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的体积比混合后，在温度为121° C下灭菌30min，得到浓度为0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，储存于冷暗处，备用。
[0045]实施例3
真姬菇凝集素在枇杷保鲜中的应用。[0046]真姬菇脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用。
[0047]所述真姬菇凝集素是采用真姬菇为原料，结合硫酸铵盐析和PBS磷酸盐缓冲液透析技术提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE离子交换层析技术进行凝集素粗品纯化收集沉淀，经过脱盐后冷冻干燥得真姬菇凝集素。
[0048]所述真姬菇脱蛋白多糖是采用真姬菇为原料，利用水提醇沉法进行提取真姬菇抑菌多糖，经醇沉后收集多糖沉淀为菌丝粗多糖，将菌丝粗多糖应用Sevag法脱除其中的蛋白成分进行纯化，脱除蛋白后的多糖成分再经过真空冷冻干燥得真姬菇脱蛋白多糖。
[0049]所述的真姬菇凝集素或脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用，是将真姬菇凝集素或真姬菇脱蛋白多糖中的一种或两种，配制成涂膜保鲜液，将枇杷放在上述涂膜保鲜液中浸
2.5min后取出，晾干，在常温条件下贮藏；所述涂膜保鲜液中真姬菇凝集素的质量百分比为:0.15%，所述涂膜保鲜液中真姬菇脱蛋白多糖的质量百分比为:1.5%。
[0050]所述真姬菇凝集素具体制备步骤为:真姬菇以质量/体积比为1:5g/ml加入浓度为0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，在4°C下浸提24h，4°C、转速为8000r/min下冷冻离心40 min,取上清液；上清液通过硫酸铵盐析，收集57.5%硫酸铵饱和度沉淀部分，沉淀复溶于浓度为0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液,装入透析袋中除盐,透析至外透析液无S042-检出为止,冷冻干燥后即为凝集素粗品；将凝集素粗品上DEAE-SepharoseFast Flow柱，以0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液进行洗脱并分管收集，检测波长280nm,以兔血红细胞检测洗脱峰的凝血活性,将具有凝血活性的通过CM-Sepharose FastFlow层析纯化，收集、脱盐后冷冻干燥即得真姬菇凝集素纯品。
[0051]所述真姬菇脱蛋白 多糖具体制备步骤为:采用热水浸提法提取真姬菇多糖，称取湿重为500 g的真姬菇，按质量/体积比为2: lg/ml加入蒸馏水，用高速组织捣碎机匀浆10min,而后置于90°C水浴锅浸提8 h,5000 rpm离心5 min,取上清液冷冻干燥浓缩至原体积的1/10，加入3倍体积的质量浓度为95%乙醇沉淀，8000 rpm离心10 min,收集沉淀为菌丝粗多糖；菌丝粗多糖经Sevag法脱蛋白后，浓缩，加入质量浓度为95%乙醇沉淀，8000 rpm离心10 min，沉淀物冷冻干燥即为真姬菇去蛋白多糖。
[0052]所述真姬菇原料为真姬菇下脚料。
[0053]所述PBS磷酸盐缓冲液是将Na2HPO4.12H20溶于蒸馏水中配制得到浓度为0.2mo I/L的Na2HPO4,将NaH2PO4.2H20溶于蒸馏水中配置得到浓度为0.2 mo I/L NaH2PO4 ;将制备得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的体积比混合后，在温度为121° C下灭菌30min，得到浓度为0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，储存于冷暗处，备用。
[0054]实施例4
本实施例以真姬菇菇脚样品为例进一步阐述本发明的一种具体实施方法，本发明包括但不限于本实施例。
[0055]试验菌株:真姬燕(Hypsizygusmarmoreus (Peck) H.E.Bigelow)燕脚，由福建省顺昌神农燕业有限公司提供；枇杷炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),由福建师范大学生命科学院提供。
[0056]试验水果:枇杷购买于福州市水果市场，运回实验室后剔除次果，选择大小、颜色一致，没有机械损伤的果实进行冷藏。
[0057]药品试剂:葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、琼脂、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、维生素B1、抗坏血酸、2，6- 二氯酚靛酚、草酸、碳酸氢钠、石油醚60-90、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、无水乙醇、甲醛、戊二醛、醋酸异戊酯、锇酸、醋酸双氧铀、柠檬酸铅，以上试剂均为普通国产分析纯。CM-纤维素钠盐300-800 (上海润捷化学试剂有限公司)，薄层层析硅胶GF254化学纯(青岛海洋化工有限公司)，层析硅胶(100-200目，国药试剂)，Sephadex LH-20 凝胶(瑞典 GE Healthcare), Epon812 环氧树脂。
[0058]实验仪器:电热恒温培养箱；旋转蒸发仪RE52-1 ;SHB-1IIS循环水式多用真空泵；奥豪斯电子天平CPl 14 ；LMQ-R3260自动高压灭菌锅；UD_650型桌上式洁净工作台；恒温培养振荡器ZHWY-200B ；ZF-1型石英紫外检测仪(上海顾村电光仪器厂)；层析柱(Φ1.6cmX60cm、Φ2.6cmX40cm) ;HL_2N恒流泵(上海沪西分析仪器厂)；冷冻干燥机FD-1A-50B ；S-100N自动分部收集器(上海沪西分析仪器厂)；Leica EM UC6超薄切片机JE0L/E0扫描电子显微镜JEOL透视电子显微镜。HWF-1型红外二氧化碳分析仪金坛市现代仪器厂；酸碱滴定管。
[0059]培养基:
(I) PDA培养基:马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，水lOOOmL，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000 mL。
[0060](2)孟加拉红培养基:孟加拉红培养基为广东环凯微生物科技有限公司生产，孟加拉红培养基31.6g，水lOOOmL。
[0061]涂膜保鲜剂配方:配方A: 1%真姬菇脱蛋白多糖+0.1%真姬菇凝集素；配方B:1%真姬菇脱蛋白多糖；c K:对照组。
[0062]试验方法
(I)真姬菇菇脚去蛋白多糖的制备
采用热水浸提法提取真姬菇菇脚多糖，称取500 g (湿重)真姬菇菇脚，按质量/体积比为2:1 (即w:v=2:1)加入蒸馏水，用高速组织捣碎机匀浆10 min，而后置于90°C水浴锅浸提8 h, 5000 rpm离心5 min,取上清液冷冻干燥浓缩至1/10, 3倍95%乙醇沉淀,8000 rpm离心10 min，收集沉淀为菌丝粗多糖。粗多糖经Sevag法脱蛋白后，浓缩，95%乙醇沉淀，8000 rpm离心10 min,沉淀物冷冻干燥即为真姬燕燕脚去蛋白多糖。
[0063](2)真姬菇凝集素的制备
各种真姬菇以质量/体积比为1:5加入PBS磷酸盐缓冲液(0.05mol/L, pH=7.8)在4°C下浸提24h,4°C下冷冻离心(8000r/min,40 min),取上清液。上清液通过硫酸铵盐析，收集40%?75%硫酸铵饱和度沉淀部分。沉淀复溶于少量的PBS磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH=7.8)装入透析袋中除盐，透析至外透析液无S042-检出为止，冷冻干燥后即为凝集素粗品。将凝集素粗品上DEAE-Sepharose Fast Flow柱，以PBS磷酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH=7.8)进行洗脱并分管收集，检测波长280nm，以兔血红细胞检测各峰的凝血活性，收集活性峰，再将活性峰通过CM-Sepharose Fast Flow层析纯化,收集、脱盐后冷冻干燥即得真姬菇凝集素纯品，将所得凝集素经SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测，显示为约35kDa大小的单一条带。
[0064]所述PBS磷酸盐缓冲液是先进行母液的配制:0.2M Na2HPO4:称取71.6gNa2HPO4.12H20，溶于 1000ml 水；0.2M NaH2PO4:称取 31.2g NaH2PO4.2H20，溶于 1000ml水。再进行PBS磷酸盐缓冲液(pH=7.8 0.05mol/L)的配制:先配0.2M PBS磷酸盐缓冲液(ρΗ=7.8，100ml):取 8.5ml 0.2mol/L 的 NaH2PO4, 91.5ml 0.2mol/L 的 Na2HPO4,即可；然后将配得的0.2M PBS磷酸盐缓冲液(pH=7.8)稀释四倍，在温度为121° C下灭菌30min，即得0.05M PBS磷酸盐缓冲液(pH=7.8)，储存于冷暗处，备用。
[0065](3)抑枇杷炭疽病菌活性检测
采用菌丝生长速率法(林陈强，林戎斌，蔡海松，等.虎奶菇抑菌物质与食品防腐剂抑菌活性的比较[J].食用菌学报，2007，14(3):62-66.):
①菌饼制备:取活化的枇杷炭疽病菌，接于PDA培养基上，于28°C ±1培养5?6d，用无菌水洗下分生孢子，制成孢子悬液(浓度约为106个/mL)。取5mL孢子悬液，倒入熔化并冷却至45°C?50°C的孟加拉红培养基中，摇匀后，迅速分装培养皿中，每个培养皿中倒入10mL，待凝固后置于恒温培养箱中，28°C ± I倒置培养2?3d至菌丝长满全皿。用直径为
0.9cm的打孔器制成若干菌饼备用。
[0066]②含药培养基平板制备:准确将0.1mL药液涂布孟加拉红培养基上制成含药培养基平板，在对照上则涂布相同体积的溶剂。
[0067]③抑制菌丝生长实验:用接种针挑取菌饼轻放于含药培养基中央(每皿一块菌饼，菌丝面朝下)，每个处理设3个平行，并设对照。28°C ± I恒温培养一段时间后用十字交叉法测菌落直径，计算供试真菌菌丝生长相对抑制率，比较抑制效果。计算公式:相对抑制率(％)=(对照菌落平均直径一处理菌落平均直径)+ (对照菌落平均直径一菌饼直径)X 100%ο
[0068]根据药剂浓度的对数值(X)和菌丝生长抑制率的几率值(y)，用0rigin8.0软件拟合直线毒力回归方程，并求出半数抑制浓度(IC50)，比较真姬菇多糖和真姬菇凝集素对枇杷炭疽病菌的抑制作用。
[0069](4)涂膜方法及枇杷生理指标测定
涂膜方法:每组样品选用大小均匀的枇杷10颗，分别在不同的保鲜液中浸Imin后取出，凉干，放入搪瓷盘中，在常温条件下贮藏，每组重复4次，并每隔2d进行随机取样分析。
[0070](5)生理指标测定
1)失重率[10]=(失重克数/原克数)X100%
2)好果率=(完好果数/检查总果数)X100%
当烂斑直径大于IOmm时，则认定该果实为腐烂果；
3)可溶性固形糖的测定:用WYA阿贝折光仪测定；
4)VC测定:2，6- 二氯靛酚滴定法；
5)有机酸测定:酸碱滴定法；
6)呼吸强度测定:用红外二氧化碳分析仪测定。
[0071]试验结果与分析
(I)真姬菇去蛋白多糖抑制枇杷炭疽病活性
采用菌丝生长速率法测定了 0.3125,0.6250、1.250,2.500,5.0OOmg.mL_l 5个梯度浓度的真姬菇去蛋白多糖对枇杷炭疽病菌菌丝生长的抑制活性(表I)。经0rigin8.0软件拟合直线毒力回归方程(该步骤由实验人员指导通过计算机软件完成，下同)，可知72h后，真姬菇去蛋白多糖对枇杷炭疽病菌菌丝生长的P IC50为0.56 mg.mL_l。
[0072]
【权利要求】
1.真姬菇凝集素在枇杷保鲜中的应用。
2.真姬菇脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用。
3.根据权利要求1所述的真姬菇凝集素在枇杷保鲜中的应用，其特征在于:所述真姬菇凝集素是采用真姬菇为原料，结合硫酸铵盐析和PBS磷酸盐缓冲液透析技术提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE离子交换层析技术进行凝集素粗品纯化收集沉淀，经过脱盐后冷冻干燥得真姬菇凝集素。
4.根据权利要求2所述的真姬菇脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用，其特征在于:所述真姬菇脱蛋白多糖是采用真姬菇为原料，利用水提醇沉法进行提取真姬菇抑菌多糖，经醇沉后收集多糖沉淀为菌丝粗多糖，将菌丝粗多糖应用Sevag法脱除其中的蛋白成分进行纯化，脱除蛋白后的多糖成分再经过真空冷冻干燥得真姬菇脱蛋白多糖。
5.根据权利要求1或2所述的真姬菇凝集素或脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用，其特征在于:将真姬菇凝集素或真姬菇脱蛋白多糖中的一种或两种，配制成涂膜保鲜液，将枇杷放在上述涂膜保鲜液中浸Ilmin后取出，晾干，在常温条件下贮藏；所述涂膜保鲜液中真姬菇凝集素的质量百分比为:0.1%-0.2%，所述涂膜保鲜液中真姬菇脱蛋白多糖的质量百分比为:1% -2%ο
6.根据权利要求3所述的真姬菇凝集素在枇杷保鲜中的应用，其特征在于:所述真姬菇凝集素具体制备步骤为:真姬菇以质量/体积比为1:(3~7)g/ml加入浓度为0.05mol/L，pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，在4°C下浸提24h，4°C、转速为8000r/min下冷冻离心40min,取上清液；上清液通过硫酸铵盐析，收集40%~75%硫酸铵饱和度沉淀部分,沉淀复溶于浓度为0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，装入透析袋中除盐，透析至外透析液无SO42-检出为止，冷冻干燥后即为凝集素粗品；将凝集素粗品上DEAE-S印harose Fast Flow柱，以0.05mol/L,pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液进行洗脱并分管收集，检测波长280nm，以兔血红细胞检测洗脱峰的凝血活性，将具有凝血活性的通过CM-Sepharose Fast Flow层析纯化，收集、脱盐后冷冻干燥即得真姬菇凝集素纯品。
7.根据权利要求4所述的真姬菇脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用，其特征在于:所述真姬菇脱蛋白多糖具体制备步骤为:采用热水浸提法提取真姬菇多糖，称取湿重为500 g的真姬燕，按质量/体积比为(1~3): lg/ml加入蒸懼水,用高速组织捣碎机匀衆10 min,而后置于90°C水浴锅浸提8 h,5000 rpm离心5 min,取上清液冷冻干燥浓缩至原体积的1/10，加入3倍体积的质量浓度为95%乙醇沉淀，8000 rpm离心10 min,收集沉淀为菌丝粗多糖；菌丝粗多糖经Sevag法脱蛋白后，浓缩，加入质量浓度为95%乙醇沉淀，8000 rpm离心10 min，沉淀物冷冻干燥即为真姬菇去蛋白多糖。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述真姬菇原料为真姬菇下脚料。
9.根据权利要求3或6所述的应用，其特征在于:所述PBS磷酸盐缓冲液是将Na2HPO4? 12H20溶于蒸馏水中配制得到浓度为0.2 mo I/L的Na2HPO4，将NaH2PO4.2H20溶于蒸馏水中配置得到浓度为0.2 mo I/L NaH2PO4 ;将制备得到NaH2PO4、Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的体积比混合后，在温度为121° C下灭菌30min，得到浓度为0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸盐缓冲液，储存于冷暗处，备用。
【文档编号】A23B7/154GK103461471SQ201310396752
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】林勇, 毛方华, 张迪, 肖冬来, 王宏雨, 曾辉 申请人:福建省农业科学院食用菌研究所