一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。该高抗TuMV的RNA，是具有下述核苷酸序列之一：1）序列表中的SEQ?ID№.2所示的核苷酸序列；2）与1）限定的RNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。本发明的RNA和编码该RNA的RNAi载体，可用来增强植物对TuMV或草铵膦除草剂的抗性，同时也为高抗TuMV转基因植物的培育奠定了基础。
【专利说明】—种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体
【技术领域】
[0001]本发明属于植物抗病毒基因工程领域，具体涉及一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。
【背景技术】
[0002]完菁花叶病毒(TurnipMosaic Virus, TuMV)属马铃薯 Y 病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。TuMV寄主范围十分广泛，能够侵染43科156属超过318种植物。TuMV是十字花科作物中危害最大的病毒病。感染病毒后的作物还容易感染霜霉病和软腐病，造成复合侵染，直接影响到产量和商品价值。
[0003]油菜是我国最主要的油料作物。芜菁花叶病毒病是油菜的重要病害之一。近年来，在我国油菜主产区病毒病发生有日益流行加重趋势。据调查发病田块发病率一般为20%-30%，重的发病率在50%以上，造成油菜籽产量的重大损失。感病油菜不仅产量降低，而且产油率和种子萌芽率也明显降低，品质下降。此外，我国白菜因该病毒危害平均每年造成5%的产量损失，有些年份减产10%以上，病害严重的地块几乎绝收。
[0004]TuMV主要是靠蚜虫以非持久性的方式传播，据报道目前至少有89种蚜虫可传播，而采用杀虫剂不可能很快杀死全部的蚜虫以阻止病毒的传播，仅靠杀虫剂杀蚜防治病毒病的效果不明显，还易造成环境污染。因此寻求新的抗病方法成为了一项迫切的任务。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是 提供一种高抗芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus, TuMV)的RNA和编码该RNA的RNAi载体。
[0006]本发明提供的一种RNA,具有下述核苷酸序列之一:
[0007]I)序列表中的SEQ ID Na.2所示的核苷酸序列；
[0008]2)与I)限定的RNA序列具有90%以上同源性,且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
[0009]所述具有相同功能具体指具有下述任一功能:
[0010]I)增强植物对TuMV的抗性；
[0011]2)增强植物对草铵膦除草剂的抗性。
[0012]所述植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
[0013]所述TuMV 具体为 TUMV-C4 和 / 或 BJ-ROI。
[0014]所述RNA的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0015]含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明的保护范围。
[0016]所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。
[0017]所述重组表达载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片段为X正向一连接区一X反向；X正向为SEQ ID N0.1中第15-467位核苷酸所示，X反向为X正向的反向互补片段。
[0018]具体的，所述出发载体为pBBBast。
[0019]所述的重组表达载体中，所述X正向一连接区一X反向片段具有序列表中SEQ IDN2.3中第1371-3087位核苷酸所示的序列。
[0020]本发明的另一个目的是提供所述RNA、所述RNA的编码基因、所述含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌的如下至少一种应用:
[0021 ] I)制备抗TuMV的产品；
[0022]2)增强植物对TuMV的抗性；
[0023]3)增强植物对草铵膦除草剂的抗性。
[0024]所述应用中，所述植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
[0025]所述应用中，所述TuMV具体为TuMV_C4和/或BJ-ROI。
[0026]本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将所述的重组表达载体转入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状:1)对TuMV的抗性增强；2)对草铵膦除草剂的抗性增强。
[0027]所述方法中，所 述TuMV具体为TuMV-C4和/或BJ-ROl。
[0028]所述方法中，所述目的植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为中间载体的酶切验证结果，其中M为分子量标记；泳道I为pHannibal+HC-Pro-RNAi载体的酶切结果；泳道2为连入反向片段pHannibal+HC-Pro (-)载体的酶切结果；泳道3为空pHannibal载体的酶切结果。
[0030]图2为载体pBBBTu-HC-Pro的结构示意图。
[0031]图3为植物表达载体pBBBTu-HC-Pro的MluI酶切检测结果图，其中M为分子量标记；泳道I为pBBBTu-HC-Pro载体的酶切结果。
[0032]图4为T1代苗喷洒草铵膦除草剂后结果，存活的为除草剂抗性株。
[0033]图5为转基因T1代苗PCR鉴定结果图，其中M为分子量标记；泳道I为阴性对照col-0的结果；泳道2-8为除草剂筛选出的转基因T1代苗的结果。
[0034]图6为不同转基因高抗株系接种TUMV-C4后的图片，其中col代表野生型col-0的结果。
[0035]图7为不同转基因高抗株系接种TUMV-C4后种子收获时的图片，其中col代表野生型col-0的结果。
[0036]图8为转基因高抗株系59接种BJ-R01后的图片，其中col代表野生型col-0的结果。
[0037]图9为高抗株系接种TuMV_C4后的病情指数统计结果，其中col代表野生型col_0的结果。
[0038]图10为TuMV-C4接种拟南芥后，RT-PCR半定量检测TuMV基因在转基因拟南芥中的表达，其中M为分子量标记；泳道I为H2O对照组结果；泳道2-5为转基因植株的结果；泳道6为对照Col-O的结果。
[0039]图11为TUMV-C4接种拟南芥后，荧光定量PCR分析结果，其中col代表野生型col-0的结果。
【具体实施方式】
[0040]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0041]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042]1、材料
[0043]本实验所用野生型拟南芥Col-O 购自 Arabidopsis Biological ResourceCenter0
[0044]北京地区芜菁花叶病毒TuMV主要的流行强致病株系TUMV-C4获自中国农业科学院蔬菜花卉所；参考文献:冯兰香、徐玲、刘佳、钮心格、李秀生，北京地区大白菜芜菁花叶病毒株系的鉴定，中国蔬菜，1988，4:11-13 ;公众可从北京农业生物技术研究中心获得该株系O
[0045]TuMV萝卜强致病株系BJ-ROl为发明人从田间采集并保存。参考文献“叶艳英、曾钢、闻晓红、马荣才、吴才君、姚磊，江西农业大学学报，2012,34(2):264 — 269”。公众可从北京农业生物技术研究中心获得。
[0046]大肠杆菌(E scherichia coli) DH5 α菌株购自Tiangen公司，产品目录号为CBlOl ；
[0047]农杆菌(Agrobacteriumtumefacieus) GV3101 (pMP90)，参考文献:Koncz, C.and Schell, J.(1986)The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specificexpression of chimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binaryvector.Mol.Gen.Genet.204, 383 - 396。公众可从北京农业生物技术研究中心获得。
[0048]RNAi 载体 pHannibal 公众可从 CSIRO (http:1Iwm.csir0.au/pi)获得；参考文献:Wesley S V, Helliwell C A, Smith N A.Construct design forefficient, effective and high-throughput gene silencing in plants[J].The PlantJournal, 2001，27(6):581-590。
[0049]高保真酶Fast pfu DNA Polymerase、Easy Taq酶和分子量标记购自全式金公司。质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。M-MLV反转录酶、定量PCR试剂、限制性内切酶和Klenow Fragment购自TaKaRa公司。T4连接酶购自Promega公司。TRIzol提取液购自Invitrogen公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
[0050]实施例1、RNAi载体的制备
[0051](一)HC-Pro基因保守片段的制备
[0052]提取TuMV-C4菌株的总RNA，并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，以下述HC-ProF和HC-Pro R (下划线部分为酶切位点EcoR1、XbaI和Kpnl、ClaI)为引物，用高保真酶Fastpfu DNA Polymerase 进行 PCR 扩增:
[0053]HC-Pro F 5， -cggaattctctagaGTTAGCAAGTTACAGGGTGAC_3’ ；[0054]HC-Pro R 5’ -ggggtaccatcgatGACGTGATATCCAGTTGACAGT-3'。
[0055]PCR 扩增程序:94 °C 5min ；94°C 45s, 52 °C 30s, 72 °C lmin，35 个循环；72 °C 延伸7min。
[0056]PCR产物经琼脂糖电泳纯化后回收。所得PCR产物经测序证明核酸序列正确，其核酸序列具有序列表中SEQ ID N0.1所示的核酸序列，其编码的RNA的具有序列表中SEQID N0.2所示的核酸序列。
[0057](二)RNAi载体的构建
[0058]1、中间载体 pHannibal+HC-Pro-RNAi 的制备
[0059]I)制备过程
[0060]用ClaI和XbaI分别酶切pHannibal载体和上述制备的PCR产物。酶切后经纯化回收约5800bp的载体骨架片段和约450bp的PCR产物片段，4°C连接过夜。连接产物经热击转化大肠杆菌DH5ci。挑取克隆，提取质粒并用XbaI和EcoRI酶切验证，获得含反向片段的中间载体 pHannibal+HC-Pro (-)。
[0061]用KpnI和EcoRI分别酶切上述制备的PCR产物和连入反向片段的pHannibal+HC-Pro (-)中间载体。酶切产物经纯化后回收约6200bp载体骨架片段和约470bp的PCR产物片段，4°C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取克隆，提取质粒并用XbaI和EcoRI双酶切验证，获得同时含反向和正向片段的中间载体pHannibal+HC-Pro-RNAi。
[0062]2)所构建载体的酶切验证过程
[0063]用XbaI和EcoRI分别双酶切pHannibal+HC-Pro-RNA1、连入反向片段的pHannibal+HC-Pro (-)和pHannibal空载体进行验证实验。实验结果见图1。图1结果显示:pHannibal+HC-Pro-RNAi载体被酶切成5001bp、1723bp和6bp的片段；连入反向片段的pHannibal+HC-Pro (-)载体被酶切成5001bp和1264bp的片段；pHannibal空载体被酶切成5001bp和823bp的片段。酶切结果表明，中间载体pHannibal+HC-Pro-RNAi构建正确。
[0064]2、植物表达载体pBBBTu-HC-Pro的制备
[0065]I)制备过程
[0066]pHannibal的发卡结构两端各含有I个NotI酶切位点。把含发卡结构的中间载体pHannibal+HC-Pro-RNAi用NotI酶切，再用Klenow和dGTP在酶切片段的两个粘性末端各补两个碱基G，产物于1%琼脂糖凝胶电泳纯化，胶回收含发卡结构的3870bp的片段备用。经测序，所述含发卡结构的片段具有序列表中SEQ ID N2.3所述的核酸序列。所述发卡结构具有序列表中SEQ ID Na.3中第1371-3087位核苷酸所示的序列。
[0067]植物表达双元载体pBBBast可为将具有序列表中SEQ ID Na.4所示核酸序列的双链DNA分子插入载体pBBRlMCS-2的SspI酶切位点，取代质粒pBBRlMCS_2的SspI酶切位点之间的小片段得到的重组质粒。
[0068]质粒pBBRlMCS-2公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献=KovachME, Elzer PHj Hill DS，Robertson GTj Farris MAj Roop RM 2nd，Peterson KM.Four newderivatives of the broad—host—range cloning vector pBBRlMCS，carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Gene.1995 Dec I;166(I):175-6。
[0069]用XmaI酶切植物表达双元载体pBBBast，再用Klenow在两个粘性末端各补两个碱基C，产物于1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收载体片段6559bp，再与上述制备的含发卡结构的3870bp片段连接，即得植物表达RNAi质粒pBBBTu-HC-Pro，其结构示意图见图2。
[0070]2)所构建载体的酶切验证过程
[0071 ] 将上述制备的植物表达载体pBBBTu-HC-Pro进行MluI酶切检测。pBBBast载体本身有一个MluI酶切位点，连接上述含发卡结构的片段的CaMV启动子上另有一个MluI酶切位点，酶切后显示2条带的为阳性克隆。因是单酶切位点插入，根据酶切条带大小可判断插入是顺时针正向连接或逆时针反向连接。正向连接酶切条带为3935bp和6494bp，反向连接条带为542bp和9889bp条带。MluI酶切检测结果见图3。图3结果表明针对HC-Pro基因保守片段的RNAi结构已经连入植物表达双元载体pBBBast的XmaI酶切位点中，并且为正向连接。
[0072]实施例2、高抗TuMV的RNA及编码该RNA的RNAi载体的功能验证
[0073](—)拟南芥的遗传转化及阳性苗的筛选
[0074]利用电击法将pBBBTu-HC-Pro载体转入农杆菌GV3101 (pMP90)中，采用农杆菌介导的花序浸溃法侵染拟南芥。将收获的拟南芥Ttl代种子播种于盛有营养土的培养托盘中，置于22°C (昼)/18V (夜)，光照周期为16h (光)/8h (暗)的人工气候室。待幼苗长出两片子叶后喷洒用水按体积数稀释500倍的草铵膦除草剂(所述草铵膦除草剂为市场购买的商品化的除草剂，其中草铵膦浓度为200mg/L)，筛选阳性苗。
[0075]经喷洒2-3次草铵膦除草剂筛选后，共获得60株除草剂抗性植株，筛选的部分抗性株见图4。将能够继续生长且长势良好的植株用小量快速法提取植物基因组DNA。用引物 HC-Pro F 和 HC-Pro R 进行 PCR 扩增检测。反应条件为:94°C 5min ；94°C 45s, 52°C 30s,72°C 30s，35个循环；7 2°C 7min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，扩增出目的基因片段481bp的为转基因阳性苗，共有26株为阳性苗。部分幼苗的PCR鉴定结果见图5。
[0076]选取鉴定为阳性苗的转基因T1代苗自交留种，T2幼苗喷洒用水按体积数稀释500倍草铵膦除草剂(所述草铵膦除草剂为市场购买的商品化的除草剂，其中草铵膦浓度为200mg/L)后统计存活率。有13个株系符合3:1分离比，初步确定为单拷贝植株，并单株自交留种。后代继续筛选至不分离株系即为纯合株系。
[0077](二)转基因植株的抗病鉴定
[0078]将13个单拷贝的纯合株系的T3代幼苗、野生型Col-O和转空载体拟南芥同时进行抗病接种鉴定。将T3代幼苗与野生型Col-O播种，待幼苗长至8-10片莲座叶时期摩擦接种TuMV的TuMV-C4或BJ-ROl株系。接种液按病叶重/磷酸缓冲液体积(pH=7.0)约lg/10mL比例配制。每个株系接种12-16株，每株接种两片较大叶片。以非转基因野生型拟南芥Col-O和转空载体拟南芥作为对照接种。接种几分钟后立即用清水冲洗叶片。在人工气候室中网罩隔离观察，约20天后进行抗病鉴定及病情指数统计。病情等级划分:0级完全无症状；1级1-2片未接种叶花叶或发黄，能抽薹；3级3-4片未接种叶花叶或发黄能抽薹；5级5-6片未接种叶花叶或发黄,影响抽薹；7级多数叶片花叶或发黄,不能抽薹；9级大部分叶片枯死，植株濒临死亡。
[0079]病情指数=100 X Σ (各级病株数X各级代表值)/ (调查总株数X最高级代表值)
[0080]抗病接种结果见图6、7、8，鉴定结果见图9。图6结果显示，接种TuMV-C4后20天左右，对照野生型Col-O已基本枯萎死亡,转空载体对照结果与Col-O基本一致,而转基因株系表现出不同的抗性，其中4个株系(12#，14#, 50#, 59#,)表现出较好的长势。高抗株系除部分叶片发黄外，整株生长健壮，且能正常抽苔结实，表现出对TuMV-C4的高度抗性。图7结果显示，到种子收获时期接种TUMV-C4的高抗转基因株系可以正常结籽；而对照Col-O的植株已经全部死亡，无种子可收获。图9结果显示，接种TUMV-C4后，病情指数统计显示高抗株系的抗病性比对照提高约80%，转空载体对照结果与Col-O基本一致。
[0081]高抗转基因株系59#接种BJ-ROl后，图8结果显示，对照野生型Col-O发病显症，而高抗转基因株系59#表现出较好的长势，其对BJ-ROl同样具有高度的抗性。说明本发明对TuMV不同株系的抗性具有一定的广谱性。
[0082]高抗转基因株系留种，后代继续进行抗病鉴定。结果显示这些转基因株系对TuMV的高抗性可以稳定遗传。
[0083](三)半定量和相对定量检测病毒的累积
[0084]4个高抗株系12# ，14#, 50#, 59#接种TuMV_C4后约15天，选取各株系未接种叶片分别提取总RNA，用M-MLV反转成cDNA。分别以TuMV-CP的196bp片段为检测对象，以拟南芥SAND基因(AT2G28390)的298bp片段为内参进行半定量和荧光定量分析。
[0085]扩增TuMV-CP基因的196bp保守区段的引物序列如下所示:
[0086]CP F 5，-AAAGCGTAACCAAGACCGACCAT-3，；
[0087]CPR 5， -TCCATCCAAGCCGAACAAAT-3’ 。
[0088]扩增内参基因SAND基因298bp片段的引物序列如下所示，上游引物跨过内含子(一条下划线是外显子a，两条下划线是外显子b)，以避免因基因组DNA污染所造成的影响:
[0089]SAND F 5，- MGGCAGGAMTCACCAGGTTGTC -3:
[0090]SANDR 5’-TTAACGCATATGGAAGGGGAAGAC-3’ 。
[0091]RT-PCR 反应程序:94°C 5min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s，30 个循环；72°C 7min。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
[0092]荧光定量PCR的反应以稀释40倍的cDNA为模板，SYBR-green I做荧光指示剂，反应程序采用两步法扩增。扩增条件为:95°C 30s ；95°C 5s, 57°C 30s, 72°C 30s，40个循环。每个株系样品进行3次重复，取平均值。
[0093]半定量RT-PCR检测结果见图10。图10结果显示，在内参基因表达量差不多一致的情况下，对照Col-O植株体内能检测到大量的病毒累积，转空载体对照结果与Col-O基本一致，而在高抗转基因株系体内只能检测到微量的病毒。
[0094]荧光定量PCR的检测结果见图11。图11结果显示，与半定量的结果一致，在对照Col-O体内检测到大量的病毒，转空载体对照结果与Col-O基本一致，而4个高抗株系植物体内几乎检测不到病毒的复制。说明构建的RNAi载体在抗病毒中发挥了作用，转基因植株的抗病性显著提高。
【权利要求】
1.一种RNA,具有下述核苷酸序列之一: 1)序列表中的SEQID Na.2所示的核苷酸序列； 2)与I)限定的RNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
2.权利要求1所述的RNA的编码基因。
3.含有权利要求2所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌；所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片段为X正向一连接区一X反向；X正向为SEQ ID N0.1中第15-467位核苷酸所示，X反向为X正向的反向互补片段。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述X正向一连接区一X反向片段具有序列表中SEQ ID Na.3中第1371-3087位核苷酸所示的序列。
6.权利要求1所述的RNA、权利要求2所述的编码基因、权利要求3-5任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌的如下至少一种应用: O制备抗TuMV的产品； 2)增强植物对TuMV的抗性； 3)增强植物对草铵膦除草剂的抗性`。
7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求4或5所述的重组表达载体转入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状:1)对TuMV的抗性增强；2)对草铵膦除草剂的抗性增强。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述目的植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
【文档编号】C12N15/63GK103451197SQ201310397713
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】姚磊, 叶艳英, 曾钢, 曹鸣庆, 马荣才 申请人:北京农业生物技术研究中心