SV40LT及hTERT基因转染构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库的制作方法
【专利摘要】本发明涉及心血管病研究领域的SV40LT及hTERT基因转染构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(-)DNA的产物，构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子；并以Ligation Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组化染色、细胞增殖周期及其凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT基因转染构建的先天性心脏病房间隔缺损体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。
【专利说明】SV40LT及hTERT基因转染构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库
【技术领域】
[0001]本发明涉及SV40LT (猴肾病毒40大T抗原基因)及hTERT (端粒酶逆转录酶催化亚基)基因转染(SV40LT和hTERT介导)构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库，主要用于心血管病研究领域，为先天性心脏病房间隔缺损的体外研究提供细胞模型并保存其科研资源。
【背景技术】
[0002]先天性心脏病房间隔缺损是发病率最高的出生缺陷之一，已成为严重的社会问题。我国每年新发先天性心脏病11.2万-16.0万例，将造成经济损失109亿-156亿；先天性心脏病的治疗费每年高达120亿元，给社会和家庭造成了严重的心理负担和精神痛苦，已严重影响我国的人口质量，已成为社会发展的沉重负担和可持续发展的严重障碍。
[0003]先天性心脏病等出生缺陷的研究及干预已成为我国政府行为，党中央《决定》自2006年开始实施“出生缺陷干预工程”；中华人民共和国主席令《1994年10月27日第三十三号》公布我国自1995年6月I日起施行(出生缺陷)产前诊断的有关法规标准；全国人民代表大会相继颁布了《中华人民共和国母婴保健法》、《中华人民共和国母婴保健法实施办法》等一系列法规，促进了出生缺陷产前诊断、干预工作的开展；在《国民经济和社会发展的第十一个五年规划纲要》中强调加大出生缺陷干预力度，改善出生人口素质；在《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》中将出生缺陷的研究列为优先主题。
[0004]目前认为先天性心脏病房间隔缺损是遗传和环境因素等复杂关系相互作用的结果，主要包括①.胎儿发育的环境因素:如妊娠前三个月患病毒或细菌感染尤其是风疹病毒，其次是柯萨奇病毒，其出生的婴儿先天性心脏病的发病率较高。其它如羊膜的病变，胎儿受压，妊娠早期先兆流产，母体营养不良、糖尿病、苯酮尿、高血钙，放射线和细胞毒性药物在妊娠早期的应用，母亲年龄过大等均有使胎儿发生先天性心脏病的可能。②遗传因素:多数的先天性心脏病是由多个基因与环境因素相互作用所形成。③其他因素:与地区、性别也有关系。
[0005]近年来，对先天性心脏病等出生缺陷的研究主要是针对遗传、生物、物理、化学因素与发病(率)的关系进行流行病学方面的调查研究。但是，由于没有可在体外长期培养的、可用于先天性心脏病发病机制研究的永生细胞模型及其细胞库，就难以从细胞水平在体外研究先天性心脏病房间隔缺损细胞受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制，从而严重限制了先天性心脏病房间隔缺损的进一步研究。
[0006]国外文献报道，猴肾病毒40 (SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。
[0007]但国外最近有研究发现,SV40Tag转染的细胞伴随着DNA损伤修复机制的丢失、核型的不稳定性以及少数细胞致瘤性转化。此外，长期体外培养发现部分转染SV40Tag的细胞只是延长了寿命，或仅仅渡过了衰老期(MI期)，多数细胞会最终进入危机期(M2期)而死亡，说明细胞并未获得永生化。同时SV40病毒具有致瘤性，与某些肿瘤的发生、发展有关，因此SV40Tag转染的细胞对某些研究也存在一定程度的限制性。
[0008]国外研究表明，导入外源性hTERT可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对“正常”的生长特征。可以用于人类和动物某些种类的细胞模型的建立，对借助于研究转基因永生化细胞模型而研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制，具有重要的意义。在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。因研究工作的需要，几乎每种疾病都有各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。
[0009]另有国外研究表明，人体组织细胞在体外培养时会在较短时间内死亡而无法传代，即在进入衰老期(Ml期)前就会死亡。但猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化，可使细胞渡过Ml期后继续存活、传代培养20-30代，然后细胞又会进入危机期(M2期)，细胞死亡率增加并伴染色体异常，分裂的细胞逐渐减少，绝大多数细胞发生死亡。而hTERT可以维持细胞染色体端粒的稳定，从而使细胞渡过危机期(M2期)，可继续存活、传代达100-300代以上。所以如果用SV40和hTERT同时转染人离体组织细胞建立永生化细胞系，那么SV40可以使细胞渡过Ml期，hTERT可以使细胞渡过M2期，比单独使用其中之一建立的细胞系更稳定、寿命更长。
[0010]但是，至今尚未见有关以猴肾病毒40大T抗原基因(SV40LT)和端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)同时导入细胞以建立永生细胞系并以此构建可用于在体外从细胞水平研究先天性心脏病房间隔缺损发病机制的永生细胞模型及其细胞库的文献报道，也无法开展相关项目的研究。为了解决这一问题，本发明人提出了本发明。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是要提供SV40LT及hTERT基因转染(SV40LT和hTERT介导)构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法，另一目的是为在体外从细胞水平研究先天性心脏病房间隔缺损的发病机制提供SV40LT和hTERT基因转染构建的房间隔缺损细胞模型及其细胞库。
[0012]本发明的目的是这样实现的:以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体 pcDNA3.1 (-)DNA 的产物，构建 SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子；并以 Ligat1nMix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染入先天性心脏病房间隔缺损组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT介导先天性心脏病房间隔缺损体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。
[0013]本发明以PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳提纯SV40LT和hTERT，分别经基因载体pcDNA3.1 (-)DNA和pLXSNneo以脂质体转染法导入先天性心脏病房间隔缺损细胞而构建其细胞模型，其组织细胞用0.01%胶原酶II消化而不用常规的胰蛋白酶消化，以仅使引起细胞粘连的胶原被消化或使细胞悬浮，减少了细胞壁的蛋白质被消化而伤及细胞，使细胞培养的成功率由一般的约85%提高到95%以上；选用了含20mL/L胎牛血清、5?lOnmol/L胰岛素的特定培养基，使细胞不会生长过快而影响hTERT基因的整合，也不会因缺少营养或细胞生长刺激因子而使细胞在未达到要求的汇合率、未进入对数生长期前就过早死亡，或对数生长期缩短；制备的细胞系在_196°C液氮中冻存I个月后复苏培养，均能生长出贴壁细胞；在作细胞系染色体鉴定时，秋水仙素的用量及作用时间是常规的5?10倍，使染色体分裂相增加，足以计数和分析；此外，用SV40LT和hTERT同时转染人离体组织细胞建立永生化细胞系，SV40可以使细胞渡过Ml期，hTERT可以使细胞渡过M2期，比单独使用其中之一建立的细胞系更稳定、寿命更长。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是本发明制备的先天性心脏病房间隔缺损细胞模型(贴壁生长)图。
[0015]如图1，细胞传代至第135代、培养至第7天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达96%以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏。
【具体实施方式】
[0016]1、SV40LT和hTERT的提取:(I)酶切SV40LT和hTERT:①酶切SV40LT:从市售购买含有大T抗原基因的SV40冰冻干粉或SV40质粒，溶解于适量的H2O或TE缓冲液中，加2uL10X酶切缓冲液、18uL H2O和限制性内切酶BamH I (l_5U/ugDNA)，37°C温育lh，75°C加热15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0.5mol/L EDTA)终止反应以备电泳。②酶切hTERT:hTERT位于质粒pClneo-hTERT的EcoRI与SalI位点之间，pLXSNneo载体多克隆位点(MCS)含EcoRI与XhoI酶切位点。从市售购买pCIneo-hTERT质粒，溶解于适量的超净H2O或TE缓冲液中，加2uL10X酶切缓冲液和18uL H2O,加入限制性内切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37°C温育lh，75°C加热15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0.5mol/L EDTA)终止反应，按常规PCR法扩增hTERT后，收取扩增物以备电泳。(2) SV40LT和hTERT电泳:①SV40LT (SV40DNA)电泳:取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10%琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm，用适量的1X加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的DNA分子量标准对照物，接通电极，使DNA向阳极移动，在1-lOV/cm凝胶的电压下电泳至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。②hTERT电泳:取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10%琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm，用适量的1X加样缓冲液制备hTERT酶切样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的标准对照物，接通电极，使hTERT向阳极移动，在l-10V/cm(80V)凝胶的电压下电泳至足够分离hTERT片段的距离时(30min)，关闭电源。(3) SV40LT和hTERT纯化与回收:①SV40LT纯化与回收:从琼脂糖中分离出约2600bp SV40大T抗原DNA:在300_360nm长波紫外光源下(使用长波紫外光源以防止DNA损伤)将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行)，加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm)，接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶，改变电场方向继续通电I分钟，从透析袋中吸出缓冲液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍体积正丁醇,混勻抽提去EB,在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，在下层DNA的溶液中加入等体积酹氯仿(2个)抽提2次,上清液转入到另一 Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc>2倍体积预冷无水乙醇，于20°C过夜，12000g, 4°C下离心10分钟，得DNA沉淀，弃上清，加入70%乙醇洗涤2次后弃干乙醇，加入50μ I TE溶解DNA。此外，还可用低熔点琼脂糖凝胶法、DNA滤膜插片法等将目的DNA片段从凝胶中分离、纯化出来。②hTERT纯化与回收:从琼脂糖中分离hTERT条带:在长波紫外光源下将含目标hTERT片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行)，加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7_)，接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待hTERT全部移出凝胶，改变电场方向继续通电I分钟，从透析袋中吸出缓冲液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍体积正丁醇,混勻抽提去EB,在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，自下层hTERT的溶液中加入等体积酹氯仿(2个)抽提2次,上清转入另一 Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc>2倍体积预冷无水乙醇，于20°C过夜，12000g，4°C下离心10分钟，得hTERT沉淀，弃上清，加入70%乙醇洗涤2次后弃干乙醇，加入50 μ I TE溶解hTERT。此外，还可用低熔点琼脂糖凝胶法、hTERT滤膜插片法等将目的hTERT片段从凝胶中分离、纯化出来。
[0017]2、SV40LT 和 hTERT 分别与载体 pcDNA3.1 和 pLXSNneo 构建重组子:(I) SV40LT/pcDNA3.1重组子的构建:取9 μ I上述DNA成份(0.1-5 μ g)、10 μ 12X连接缓冲液、1μ 110mmol/L ATP、T4DNA连接酶(20?500粘性末端单位)或大肠杆菌DNA连接酶、pcDNA3.1 空载体混合，15°C温育 24h，构建成 SV40LT/pcDNA3.1 重组子。(2) pLXSNneo-hTERT重组子的构建:取9 μ I上述纯化的hTERT成份(0.1-5 μ g)、I μ 110mmol/L ATP、1ulLigat1n Mix或大肠杆菌DNA连接酶、2ul pLXSNneo空载体混合，15 °C温育24h，构建pLXSNneo-hTERT 重组子。
[0018]3、重组子的纯化、扩增、鉴定:(I) SV40LT/pcDNA3.1重组子的扩增、分离与鉴定:①大肠杆菌感受态的制备:其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化，用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌，本法适用于大多数大肠杆菌菌株，操作过程简述如下:从37°C培养16?20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52)，或Iml新鲜的16?20h过夜培养物，转到一个含有10mlLB培养基的IL或500ml烧瓶中，于37°C剧烈振摇培养约2?3h(旋转摇床200?300r/min)，每隔20?30min测量0D600值^ 0.4，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10?20min后，于4°C用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心lOmin，以回收细胞，倒数培养液，将管倒置Imin以使最后残留的痕量培养液流尽，以1ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心1min,以回收细胞，倒出培养液，将管倒置Imin以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，_70°C贮存备用，用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 μ I转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物(体积彡10 μ 1，DNA彡50ng)，轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min，将离心管放到预加温到40°C的循环水浴中的试管架上，放置90s?2min，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却I?2min，每离心管加800 μ ISOC培养基，用水浴将培养基加温到37°C，然后将管转移到37°C摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积(每个90mm平板可达200 μ I)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/LMgS04和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37°C培养，12?16h后可出现菌落。②重组子的筛选、扩增与提取:用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)中，培养过夜后，再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中，再于37°C培养至饱和状态(OD6c4，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400r/min)，于4°C，6000g离心lOmin，用4mL GTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积彡20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在_20°C或_70°C无限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g离心lOmin，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混勻，室温放置5?1min,于室温，1500g离心1min,加入211^70%乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C长期保存)。③重组子的鉴定:上述从感受态大肠杆菌中提取的DNA(含SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性内切酶BamH I进行酶切，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得大小约2600bp及5600bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。(2) pLXSNneo-hTERT重组子的纯化、扩增、鉴定:①大肠杆菌感受态的制备:其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化，用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌，本法适用于大多数大肠杆菌菌株，操作过程简述如下:从37°C培养16?20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52)，或Iml新鲜的16?20h过夜培养物，转到一个含有10mlLB培养基的IL或500ml烧瓶中，于37°C剧烈振摇培养约2?3h (旋转摇床200?300r/min)，每隔20?30min测量0D600值& 0.4，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心lOmin，以回收细胞，倒数培养液，将管倒置lmin以使最后残留的痕量培养液流尽，以1ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心1min,以回收细胞，倒出培养液，将管倒置Imin以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70°C贮存备用。②以感受态大肠杆菌纯化和扩增pLXSNneo-hTERT重组子:用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中分别取200 μ I转移到无菌的微量离心管中，在每管中加DNA或连接反应混合物(体积< 10 μ 1，DNAS 50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min，将离心管放到预加温到40°C的循环水浴中的试管架上，放置90s?2min，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却I?2min，每离心管加800 μ I SOC培养基，用水浴将培养基加温到37°C，然后将管转移到37°C摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积(每90mm平板可达200μ I)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/LMgS04和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37°C培养，12?16h后可出现菌落。③筛选、扩增重组子:用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)中，培养过夜后，再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中，再于37°C培养至饱和状态(0D_ ^ 4，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400r/min)，于4°C，6000g离心lOmin，用4nL GTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积彡20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在_20°C或_70°C无限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g离心lOmin，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5?lOmin，于室温，1500g离心1minJPA 2mL70%乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C长期保存)。④重组质粒的鉴定与扩增:挑取平皿上的单菌落，接种于3ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中，37°C，250r/min摇床中培养，14h后收集培养物，4°C、10000r/min离心5min,按试剂盒说明书小量提取并纯化重组质粒；以EcoRI和HindIII双酶切重组质粒反应体系:限制性内切酶各0.5ul、10Xbuffer2ul、重组质粒1ul、加水补足至20ul，37°C酶切Ih。酶切产物于80V电压条件下进行0.8%琼脂糖电泳，时间30min，凝胶成像系统拍照；按常规测定重组质粒的序列；重组质粒经酶切、测序鉴定准确后，将含有该质粒的细菌接种至LB培养液中，扩增培养，按大剂量质粒抽提试剂盒说明书进行大剂量质粒抽提纯化，紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度后备用。
[0019]4、重组子SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT导入先天性心脏病房间隔缺损细胞及其阳性克隆的筛选:(I)先天性心脏病房间隔缺损细胞的收集与培养:以无菌操作提取在作其他实验或其他检查后多余、废弃的先天性心脏病房间隔缺损患者的羊水脱落组织细胞，以细胞终浓度约为lX105/mL备用，取上述呈单个分散的细胞或经处理后成为单个分散的细胞接种于含5?10nmol/L胰岛素、20%胎牛血清的RPMI1640液中或接种于含20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，置于37°C，体积分数5% C02培养箱内，细胞贴壁培养约3?4天、细胞形态为梭形、小园形细胞不到10%、贴壁细胞的汇合率达75%?85%、处于刚进入对数生长期时，即考虑收集培养细胞，先吸干净培养瓶中的培养液，加入l-2ml0.01%的胶原酶II液或胰酶(以消化液能覆盖整个瓶底为准)，静置2-10min (显微镜下动态监测)，吸去胶原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI1640培养液，用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使成细胞悬液，离心沉淀，去上清液，细胞沉淀用上述培养液清洗2次后，制成悬液，用作重组子导入。(2)重组子SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT导入先天性心脏病房间隔缺损细胞:方法1:选用脂质体转染法，取上法分离所得细胞的2X 15个细胞接种于35mm培养皿中，在37°C CO2培养箱培养24?36h，使细胞生成单层、细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10%小园形细胞、贴壁细胞的汇合率达55%?65%、处于刚进入对数生长期时，即可转染SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT。在1.5ml微量离心管中制备下列溶液:管A，将重组子SV40LT/pcDNA3.1溶于50 μ I无血清培养液中；管B，将重组子pLXSNneo-hTERT溶于50 μ I无血清培养液中；管C，将20 μ I脂质体Lipofectamine溶解于80 μ I无血清培养液中，管Α、管B和管C混勻，置室温下45min。吸去上述细胞培养液后，用无血清培养液洗涤细胞2次，在LipOfectamine-SV40LT/pcDNA3.1和Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入Iml无血清培养液，轻轻混勻，再滴加至细胞培养皿内，然后加入Iml无血清培养液，在CO2培养箱培养10h，吸出转染液，加4ml完全培养液继续培养16h，弃去培养液，更换浓度为400mg° Γ1的G418培养液继续培养，8?10天后选择单个细胞集落进行亚克隆，扩大培养后再加大G418浓度到800mg° L—1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的克隆进行传代扩增。方法2:吸取1/10-1/40细胞悬液，配制成终浓度为IX 105/mL细胞悬液，接种于培养瓶内，选择低糖DMEM或RPMI1640培养基，其中含20mL/L胎牛血清、lOnmol/L胰岛素，培养48h后，使细胞生成单层、细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10%小园形细胞、贴壁细胞汇合率达55%?65%、处于将进入或刚进入对数生长期时，采用脂质体转染的方法，将重组子pLXSNneo-hTERT和SV40LT/pcDNA3.1转染至先天性心脏病房间隔缺损细胞内，用含700mg/L G418的培养液筛选lw，将G418浓度改为300mg/L，至出现阳性克隆，将其转移至新培养瓶进行扩大、传代培养；方法3:将上述细胞悬液以低糖DMEM或RPMI1640培养液配成5X 108/L终浓度的细胞悬液接种于24孔的培养板中，待细胞长至90%左右融合时用于转染，将各含0.2μ g的重组子SV40LT/pcDNA3.1 和 pLXSNneo-hTERT，分别用 DMEM 或 RPMI1640 调整体积为 50 μ 1，室温放置5min ;脂质体15 μ 1，用DMEM调整体积为50 μ 1，然后室温放置5min，将上述试剂轻轻混匀，然后室温放置20min，将24孔板内的细胞用DMEM洗3次，每孔加入培养液100 μ I后，再加入 Lipofectamine_SV40LT/pcDNA3.1 和 Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT 混合物轻轻在细胞表面铺均匀后，于37°C 5% C02培养箱放置6h，随后用0.01g/L胶原酶将细胞消化，转入6孔板内，加入完全培养基，次日加G418抗生素使终浓度为500mg/L，直到有单克隆细胞长出。约1d后有单克隆细胞集落长出，挑取并置于24孔板内继续培养，以300mg/L的G418维持并稳定传代扩增培养。以此建立可在体外反复传代培养的永生化先天性心脏病房间隔缺损细胞模型。
[0020]5、SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT转染先天性心脏病房间隔缺损细胞模型的传代扩增:收集上述经脂质体转染法导入SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT的阳性单克隆细胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培养基配成约I X 105/mL的细胞悬液，接种于数瓶20?50cm2培养瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、10nmol/L胰岛素的低糖DMEM或RPMI1640培养基，至细胞贴壁生长、汇合率达到80?85%、处于对数生长期的前期时收集细胞，再按上述步骤传代培养，如此反复传代接种、培养，记录代数并观察细胞生长特点，如图1，细胞传代至第135代、培养至第7天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达96%以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏。其中对数生长是指细胞生长速度快，细胞数量的增加与培养时间呈倍增关系，通常按常规按种细胞进行培养时，培养I?2天便可在显微镜下找到生长的单个细胞；4?5天时可见细胞集落，贴壁生长细胞铺盖培养瓶底的1/3，培养7?13天时可见贴壁生长细胞铺盖培养瓶底的2/3以上，甚至细胞重叠、几乎不留空隙(汇合率达95?100% )，细胞光亮，无颗粒、无粗糙感等老化现象，也可据细胞计数与培养时间的关系来判断；死亡的细胞少，每周因死亡而漂浮的细胞少于10% [通过台盼蓝染色法鉴别死细胞和活细胞，因为正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥，使台盼蓝不能够进入胞内；而丧失活性的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色，可判断为细胞已经死亡，方法是每周吸取一定量的细胞培养悬液，与台盼蓝染色剂混合后置室温5?10分钟，然后制成细胞薄片，在显微镜下计数1000个细胞总数，计算着色的死细胞和不着色的活细胞的百分比]。
[0021]6、永生化先天性心脏病房间隔缺损细胞模型生物学特性的鉴定:使用SV40LT/peDNA3.1和pLXSNneo-hTERT建立的细胞模型(细胞系)，鉴定的关键问题有:一是要求该细胞具有持续的增殖能力；二是要求其形态、基本生理功能等保持不变。①观察细胞形态:在倒置光学显微镜下每日观察细胞是否呈典型的上皮细胞样贴壁生长，是否呈梭形、或小园形生长。本细胞系传代扩增培养的细胞形态与正常人成纤维细胞形态无明显差异；②观察细胞生长曲线:取生长较好的转染细胞，采用0.25胰蛋白酶液消化，制成细胞悬液，经计数，分别取1.4X 14细胞接种于30个含15FBS低糖DMEM-培养基培养瓶。每天取2瓶细胞进行计数，计算均值，连续观察直至细胞数量明显下降，培养3天后每隔2天给未计数的细胞换液，采用同样方法观察转染细胞在h印ato ZYME-SFM无血清培养基中的生长情况。结果以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴(对数)，描绘在半对数座标上制成曲线后即成该细胞的生长曲线，永生化细胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③检查染色体:通过分析染色体核型，如果染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”，或相同于本发明采集的原代细胞，则说明该细胞系没有发生恶性转化(同时可用流式细胞仪分析细胞系中是否出现异常的DNA群体，如果没有，也说明细胞系未出现瘤性特征)。染色体核型分析方法是:在细胞生长密度达85-95% (其中小园形细胞占10% )、处于对数生长期的培养物中按5mL培养液中加入预热的250ug/ml秋水仙素lOOul，混匀后置37°C培养箱4小时，吸干培养液，加入预热的2-3mL EDTA-胰酶消化液，37°C作用5分钟，终止消化，洗下贴壁细胞，经离心、低渗、固定、制片、G显带后分析染色体核型软琼脂集落生长试验:将细胞以5X 104/ml接种于直径为35mm软琼脂平皿内，观察三周后，未发现克隆形成，说明本实验的永生化细胞不能在软琼脂内形成克隆，符合永生化特点裸鼠致瘤试验:将永生化细胞以3X107接种裸鼠背部皮下，2个月后，4只裸鼠均未见肿瘤形成，证明此细胞为非恶化细胞；⑥转染细胞hTERT mRNA表达产物测定:按试剂盒做PCR扩增后电泳，检出hTERT mRNA条带。如以免疫组织化学检测，hTERT转染的细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明hTERT已整合入细胞内转染细胞端粒酶活性:收集细胞系，按试剂盒说明制备裂解液，作PCR扩增和电泳分析，以302nm紫外光观察结果，可见呈端粒酶阳性条带。⑧流式细胞术检测:检测第19代细胞系中合成、分裂的细胞比例，如果其增殖能力明显比未建系的正常细胞增强，说明是hTERT和SV40LT整合、表达的结果；另外以流式细胞术检测细胞增殖周期及细胞凋亡率，本细胞系的细胞增殖指数较转染前无明显改变，转染后细胞凋亡率较转染前明显降低转染细胞SV40大T基因检测:如以免疫组织化学检测，SV40转染的细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明SV40T抗原已整合入细胞内；也可用RT-PCR法检测T抗原在细胞中的表达，其中T抗原的引物:上游引物(A4239)5，-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496)5，-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3，;扩增产物长度为 268bp，扩增条件为 94°C，5min,即:(94°C，lmin ；55°C, lmin, -0.5°C / 循环；72°C，lmin) X 30、(94°C，30S ；40°C，30S,72°C，30S) X15，扩增体系为 50 μ 1: [Mg2+] 2mmol/L、dNTPs200 μ mol/L、引物浓度 0.4 μ mol/L、TaqlU、模板5 μ I ;实验组以第19代细胞的cDNA为模板(参照市售cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA第一链合成，产物_20°C保存)；阴性对照设两个，分别以无菌水、原代细胞的cDNA做模板，阳性对照以SV40DNA为模板(参照SDS-蛋白酶K法提取SV40DNA，因为SV40病毒无包膜，不使用SDS破膜，取5μ I进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，其余-20°C保存备用)SV40大T基因mRNA表达产物测定:T抗原mRNA RT-PCR产物测序:取100 μ I体系的扩增产物，用凝胶回收试剂盒(Takara，日本)回收产物，取2μ I DNA溶液稀释100倍，测浓度，余下的DNA及上、下游引物各10 μ I进行测序，符合SV40大T基因mRNA表达产物的序列。
[0022]所以，本发明的细胞模型为(I)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长；(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepatoZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”，或相同于本发明采集的原代细胞；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；
(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)细胞的DNA中同时整合了 SV40LT和hTERT基因，同时表达SV40LT和hTERT基因的mRNA产物；(7)细胞传代至第135代、培养至第7天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达96%以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏；(8)能反复冻溶、传代培养135代以上；(9)作为细胞模型用于体外从细胞水平研究先天性心脏病房间隔缺损的病理机制；(10)可再生性地保存SV40LT和hTERT同时整合的先天性心脏病房间隔缺损的遗传资源。
[0023]7、SV40LT和hTERT介导先天性心脏病房间隔缺损细胞模型及其细胞库:筛选并扩大培养经上述鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的细胞，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞，经过消化、终止和离心分离(1200r/min，6min)，用含二甲亚砜的冻存液0.5?Iml重悬细胞，细胞密度为5 X 15个/ml，加入冻存管，分装、标注，经4°C，0.5h ；~20V,2h ;-70°C，过夜，入_196°C液氮冻存。以此法构建生物学特性稳定的永生化先天性心脏病房间隔缺损细胞模型及其细胞库，以集中保存遗传资源，为其他研究提供科研材料，并作为先天性心脏病房间隔缺损发病机制体外研究的细胞模型，以加速拓展先天性心脏病房间隔缺损研究的新途径、从细胞水平在体外长期研究先天性心脏病房间隔缺损细胞受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制。
[0024]8、细胞模型应用:先天性心脏病房间隔缺损细胞模型作为科研细胞:使先天性心脏病房间隔缺损细胞模型处于人为制造的具有不同含量或浓度的有害物如物理(如X射线)、化学(如甲醛、汽油、铅、汞)、生物(如风疹病毒，巨细胞病毒，疱疹病毒)的条件下培养，然后取体外长期传代的不同周期的活细胞、传代过程的凋亡细胞、含有传代培养中所产生的代谢产物的培养液从不同角度和水平，对比研究先天性心脏病房间隔缺损细胞模型、正常对照细胞模型对有害物的耐受性的差异、有害物致先天性心脏病房间隔缺损的机制。例如应用常规方法如基因芯片、miRNA芯片、比较基因组杂交芯片(CGH)、差异甲基化杂交芯片(DMH)和SNPs等筛选差异的基因及其多态性、甲基化水平；运用原位杂交(FISH)、Northern blot,Real-time PCR、CHIP、EMSA等技术检测基因所在研究细胞模型中的基因转率表达、定位及调控；利用酶反应学、代谢组学技术鉴定细胞模型长期传代中蛋白质代谢过程和关键的代谢产物；应用双向电泳、MALD1-T0F质谱鉴定、酵母双杂交和免疫共沉淀等技术研究细胞模型在长期传代中的蛋白质功能及蛋白质间的相互作用，从活细胞培养过程动态、长期研究先天性心脏病房间隔缺损细胞对环境有害因素的耐受性和适应性，例如:①环境中常见的毒性物质苯并芘致先天性心脏病房间隔缺损的研究:使先天性心脏病房间隔缺损细胞模型和对照细胞分别在含有0.1、1.0,5.0、10.0,20.0pmoI/L苯并芘的培养液中培养，检测在培养2周、4周、6周、8周、16周等不同培养时间的可作为细胞毒性指标的细胞凋亡、坏死、双核细胞率和可作为遗传毒性指标的微核率、核质桥率、核芽率，即在光学显微镜下计数10000个双核细胞中的微核数、核质桥数和核芽数；500个活细胞中的凋亡和坏死细胞数、双核细胞数，以及检测细胞存活率，即应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)，在吸去原培养液后，在96孔板上加入20 %的5mg/mlMTT的无血清培养液，继续培养4h，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150yL 二甲亚砜，振荡lOmin，使紫色结晶物充分溶解，本酶标仪以490nm测定各孔的吸光度值，计算出细胞存活率。还可以其他常规实验方法检测不同培养时间的含毒性物与不含毒性物、先天性心脏病房间隔缺损细胞模型与正常细胞中各组细胞的基因突变、蛋白质组学、细胞分泌功能、染色体畸变、细胞存活率(寿命)等，以从活细胞培养过程中从细胞水平动态、长期研究环境有害因素对先天性心脏病房间隔缺损细胞的作用机制。②以某种病源微生物替换毒性物质苯并芘做同样的研究，即可从活细胞培养过程中从细胞水平动态、长期研究先天性心脏病房间隔缺损细胞对生物因素的耐受性和适应性及作用机制。③将配成浓度梯度的治疗药物与配成浓度梯度的病源微生物或毒性化学物质以及细胞模型共同培养，检测细胞培养过程寿命、基因突变、各种分子变化等，即可从活细胞培养过程中从细胞水平动态、长期研究药物对先天性心脏病房间隔缺损的治疗效果及干预效果。④同样可用先天性心脏病房间隔缺损细胞模型研究基因治疗的方法，替代某些以人体直接做试验。⑤以细胞模型的形式保存先天性心脏病房间隔缺损者的遗传资源。
【权利要求】
1.一种用于医学领域的SV40LT及hTERT基因转染构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(-)0嫩的产物，构建5￥401^1。0嫩3.I (-)重组子；并以Ligat1n Mix连接经EcoRI和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染导入先天性心脏病房间隔缺损组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT基因转染构建的先天性心脏病房间隔缺损体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究其发病机制奠定基础。
2.根据权利要求1所述的SV40LT及hTERT基因转染构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所指细胞模型为(I)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长；(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepatoZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”，或相同于本发明采集的原代细胞；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)细胞的DNA中同时整合了 SV40LT和hTERT基因，同时表达SV40LT和hTERT基因的mRNA产物；(7)细胞传代至第135代、培养至第7天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达96 %以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏；(8)能反复冻溶、传代培养135代以上；(9)作为细胞模型用于体外从细胞水平研究先天性心脏病房间隔缺损的病理机制；(10)可再生性地保存SV40LT和hTERT同时整合的先天性心脏病房间隔缺损的遗传资源。
3.根据权利要求1所述的SV40LT及hTERT基因转染构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法，其特征是取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后多余、废弃的先天性心脏病房间隔缺损患儿羊水脱落细胞构建之。
4.根据权利要求1所述的SV40LT及hTERT基因转染构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所用的培养液为含有20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰岛素的RPMI1640或含有20mL/L胎牛血清、5?10nmol/L胰岛素的低糖DMEM培养液。
5.根据权利要求1所述的SV40LT及hTERT基因转染构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法，其特征是用作传代培养以备脂质体转染法导入重组子的先天性心脏病房间隔缺损组织细胞，在原代扩增培养中，其收集指标是细胞贴壁培养约3?4天、细胞形态为梭形、小园形细胞不到10%、贴壁细胞的汇合率达75%?85%、处于刚进入对数生长期时收集细胞；用作脂质体转染法导入重组子的传代先天性心脏病房间隔缺损组织细胞，其时机选择的指标是细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10%小园形细胞、贴壁细胞的汇合率达55%?65%、处于将进入或刚进入对数生长期时的培养细胞；传代细胞系收集的指标是选择细胞贴壁生长的汇合率达80?85%、处于对数生长期的前期时收集细胞；染色体核型分析的细胞收集指标是细胞生长密度达85-95%、小园形细胞占10%以上、处于对数生长期的细胞。
6.根据权利要求1所述的SV40LT及hTERT基因转染构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法，其特征是以0.01%胶原酶II消化贴壁生长的组织细胞，作染色体核型分析时，每5mL培养液中加入250ug/ml秋水仙素lOOul，混匀后置37°C培养箱4小时。
7.根据权利要求1所述的SV40LT及hTERT基因转染构建房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法，其特征是细胞库的构建包括(I)筛选经鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的SV40LT和hTERT基因转染构建的先天性心脏病房间隔缺损细胞；(2)作传代、扩大培养，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞；(3)经消化、终止、离心(1200r/min，6min)步骤收获细胞；(4)用含二甲亚砜的冻存液配制密度为5X 15个/ml的细胞悬液；(5)按照4°C，0.5h ；-20°C,2h ;_70°C，过夜；入_196°C液氮的程序冻存细胞；(6)可再生性地长期保存SV40LT和hTERT基因转染构建的先天性心脏病房间隔缺损细胞模型，备作遗传资源和科研材料。
【文档编号】C12N5/10GK104419662SQ201310403789
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月1日 优先权日:2013年9月1日
【发明者】翁炳焕, 罗玉琴, 金帆, 黄荷凤, 朱瑞建, 陈雁 申请人:翁炳焕