转染SV40LT和hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的制作方法
【专利摘要】本发明涉及血液病研究领域的转染SV40LT和hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(-)DNA的产物，构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子；并以Ligation Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后转染体外培养的巨核细胞，G418筛选含阳性重组子的细胞并扩大培养，筛选符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT介导巨核细胞体外研究细胞模型，以建立在体外长期传代培养巨核细胞的方法并用于体外研究其发育、功能和病理机制。
【专利说明】转染SV40LT和hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库
【技术领域】
[0001]本发明涉及转染SV40LT (猴肾病毒40大T抗原基因)和hTERT (端粒酶逆转录酶催化亚基)重组子(SV40LT和hTERT介导)构建巨核细胞模型及其细胞库，主要用于血液病学研究领域，为开展巨核细胞或与巨核细胞相关的各种研究提供细胞模型并保存其科研资源。
【背景技术】
[0002]巨核细胞是正常骨髓中的一种能生成血小板的成熟细胞。该细胞体积巨大，成熟的巨核细胞边缘部分破裂脱落后形成血小板。巨核细胞按发育过程分为(I)原始巨核细胞:胞体较大，直径15?30 μ m,圆形或不规则形。胞核较大，圆形，不规则，核染色质呈粗大网状，排列紧密，核仁2?3个。胞质量较少，不均匀，边缘不规则，染深蓝色，无颗粒，核周着色浅淡。(2)幼稚巨核细胞:胞体明显增大，直径30?50μπι，外形常不规则。胞核不规贝1J，有重叠或扭转，核染色质呈粗颗粒状或小块状，排列紧密，核仁可有可无，胞质量增多，染蓝色或浅蓝色，近核处呈淡蓝色或浅粉红色，出现少量天青胺蓝颗粒。(3)颗粒型巨核细胞:胞体甚大，直径40?70 μ m,有时可达100 μ m,其形态不规则。胞核较大，形态不规则，核染色质较粗糙，排列紧密呈团块状，无核仁，胞质极丰富，染粉红色，夹杂有蓝色，质内含有大量细小的紫红色颗粒，常聚集成簇，但无血小板形成。(4)产生血小板型巨核细胞:胞体巨大，直径40?70 μ m，有时可达100 μ m，胞核不规则，高度分叶状，核染色质呈团块状。胞质呈均匀粉红色，质内充满大小不等的紫红色颗粒或血小板。胞膜不清晰，多呈伪足状，其内侧及外侧常有血小板的堆集。(5)裸核型巨核细胞:产生血小板型巨核细胞的胞浆解体后，释放出大量血小板，仅剩一胞核，称之为裸核。
[0003]巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少,仅占骨髓有核细胞总数的0.05%,但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。每个巨核细胞均可产生1000-6000个血小板。产血小板的巨核细胞也是从骨髓中的造血干细胞分化发展而来的。造血干细胞首先分化生成巨核系祖细胞，也称巨核系集落形成单位(colony formingunit-megakaryocyte, CFU-Meg)。祖细胞阶段的细胞核内的染色体一般是2-3倍体。当祖细胞是2倍体或4倍体时，细胞具有增殖能力，因此这是巨核细胞系增加细胞数量的阶段。当巨核系祖细胞进一步分化为8-32倍体的巨核细胞时，胞质开始分化，内膜系统逐渐完备。最后有一种膜性物质把巨核细胞的胞质分隔成许多小区。当每个小区被完全隔开时即成为血小板，一个个血小板通过静脉窦窦壁内皮间的空隙从巨核细胞脱落，进入血流。
[0004]据目前的研究所知，巨核细胞增殖、分化的调节机制类似于红细胞系生成的调节，至少受两种调节因子分别对两个分化阶段进行调节。这两种调节因子是:巨核系集落刺激因子(Meg-CSF)和促血小板生成素(thrombopoietin, ΤΡ0)。巨核系集落刺激因子是主要作用于祖细胞阶段的调节因子，它的作用是调节巨核系祖细胞的增殖。骨髓中巨核细胞总数减少时促使该调节因子的生成增加，Meg-CSF是一种低分子糖蛋白，分子量约为46000，它与促血小板生成素具有完全不同的免疫学性质。促血小板生成素也是一种糖蛋白，当血流中血小板减少时，促血小板生成素在血液中的浓度即增加。该调节因子的作用包括:①增强祖细胞的DNA合成和增加细胞多倍体的倍数；②刺激巨核细胞合成蛋白质；③增加巨核细胞的总数，结果增加了血小板的生成。根据去肾大鼠出现血小板减少时血液中促血小板生成素的浓度不增加的事实，推测肾可能是产生促血小板生成素的部位。
[0005]在某些不明原因或不明原因致上述调节紊乱的情况下，巨核细胞可出现⑴巨核细胞病态造血:如胞体、胞浆、胞核变小或畸型，功能障碍。(2)巨核细胞白血病:巨核细胞大量增殖而引起的恶性疾病。(3)巨核细胞成熟障碍:表现为外周血小板减少，骨髓巨核细胞成熟受阻。
[0006]为了在体外从细胞水平更进一步研究巨核细胞的发育、功能、病理机制或影响因素，就需要有一种可在体外长期传代培养的永生巨核细胞模型，但现在还没有这种巨核细胞模型。
[0007]国外文献报道，猴肾病毒40 (SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。
[0008]但国外最近有研究发现,SV40Tag转染的细胞伴随着DNA损伤修复机制的丢失、核型的不稳定性以及少数细胞致瘤性转化。此外，长期体外培养发现部分转染SV40Tag的细胞只是延长了寿命，或仅仅渡过了衰老期(MI期)，多数细胞会最终进入危机期(M2期)而死亡，说明细胞并未获得永生化。同时SV40病毒具有致瘤性，与某些肿瘤的发生、发展有关，因此SV40Tag转染的细胞对某些研究也存在一定程度的限制性。
[0009]国外研究表明，导入外源性hTERT可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对“正常”的生长特征。可以用于人类和动物某些种类的细胞模型的建立，对借助于研究转基因永生化细胞模型而研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制，具有重要的意义。在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。因研究工作的需要，几乎每种疾病都有各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。
[0010]另有国外研究表明，人体组织细胞在体外培养时会在较短时间内死亡而无法传代，即在进入衰老期(Ml期)前就会死亡。但猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化，可使细胞渡过Ml期后继续存活、传代培养20-30代，然后细胞又会进入危机期(M2期)，细胞死亡率增加并伴染色体异常，分裂的细胞逐渐减少，绝大多数细胞发生死亡。而hTERT可以维持细胞染色体端粒的稳定，从而使细胞渡过危机期(M2期)，可继续存活、传代达100-300代以上。所以如果用SV40和hTERT同时转染人离体组织细胞建立永生化细胞系，那么SV40可以使细胞渡过Ml期，hTERT可以使细胞渡过M2期，比单独使用其中之一建立的细胞系更稳定、寿命更长。
[0011]但是，至今尚未见有关以猴肾病毒40大T抗原基因(SV40LT)和端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)同时导入巨核细胞以建立永生细胞并以此构建可用于在体外从细胞水平研究巨核细胞发病机制的永生细胞模型及其细胞库的文献报道，也无法开展相关项目的研究。为了解决这一问题，本发明人提出了本发明。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是要提供转染SV40LT和hTERT重组子(SV40LT和hTERT介导)构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，另一目的是为在体外从细胞水平研究巨核的发病机制提供SV40LT和hTERT介导的巨核细胞模型及其细胞库。
[0013]本发明的目的是这样实现的:以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体 pcDNA3.1 (-)DNA 的产物，构建 SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子；并以 Ligat1nMix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染体外培养的巨核细胞，使重组子与细胞的DNA整合，经G418筛选含阳性重组子的细胞并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、SV40LT和hTERT mRNA表达、免疫组化、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT介导巨核细胞体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。
[0014]本发明以PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳提纯SV40LT和hTERT，分别经基因载体pcDNA3.1(-)DNA和pLXSNneo以脂质体转染法导入巨核细胞而构建其细胞模型，转染时选用了含20mL / L胎牛血清、5?1nmol / L胰岛素的特定培养基，使细胞不会生长过快而影响SV40LT和hTERT基因的整合，也不会因缺少营养或细胞生长刺激因子而使细胞在未达到要求的汇合率、未进入对数生长期前就过早死亡，或对数生长期缩短；制备的细胞系在-196°C液氮中冻存I个月后复苏培养，均能生长出贴壁细胞；在作永生细胞染色体鉴定时，秋水仙素的用量及作用时间是常规的5?10倍，使染色体分裂相增加，足以计数和分析；此外，用SV40LT和hTERT同时转染人离体巨核细胞建立永生化细胞，SV40可以使细胞渡过Ml期，hTERT可以使细胞渡过M2期，比单独使用其中之一建立的细胞系更稳定、寿命更长。
【具体实施方式】
[0015]1、SV40LT和hTERT的提取:(I)酶切SV40LT和hTERT:①酶切SV40LT:从市售购买含有大T抗原基因的SV40冰冻干粉或SV40质粒，溶解于适量的H2O或TE缓冲液中，加2uL10X 酶切缓冲液、18uL H2O 和限制性内切酶 BamH I (1-5U / ugDNA)，37°C温育 Ih, 75°C加热15min,灭活酶,加入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0.5mol / L EDTA)终止反应以备电泳。②酶切hTERT:hTERT位于质粒pCIneo-hTERT的EcoRI与SalI位点之间，pLXSNneo载体多克隆位点(MCS)含EcoRI与XhoI酶切位点。从市售购买pCIneo-hTERT质粒，溶解于适量的超净H2O或TE缓冲液中，加2uL10X酶切缓冲液和18uL H2O,加入限制性内切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37°C温育lh，75°C加热15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0.5mol / L EDTA)终止反应，按常规PCR法扩增hTERT后，收取扩增物以备电泳。(2) SV40LT和hTERT电泳:①SV40LT (SV40DNA)电泳:取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10%琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm，用适量的1X加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的DNA分子量标准对照物，接通电极，使DNA向阳极移动，在I 一 1V /cm凝胶的电压下电泳至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。②hTERT电泳:取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10%琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm，用适量的1X加样缓冲液制备hTERT酶切样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的标准对照物，接通电极，使hTERT向阳极移动，在1-10V /cm(80V)凝胶的电压下电泳至足够分离hTERT片段的距离时(30min)，关闭电源。(3) SV40LT和hTERT纯化与回收:①SV40LT纯化与回收:从琼脂糖中分离出约2600bp SV40大T抗原DNA:在300-360nm长波紫外光源下(使用长波紫外光源以防止DNA损伤)将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行)，加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7_)，接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶，改变电场方向继续通电I分钟，从透析袋中吸出缓冲液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍体积正丁醇，混匀抽提去EB，在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，在下层DNA的溶液中加入等体积酚氯仿(2个)抽提2次，上清液转入到另一 Eppendorf管中加入I / 10倍体积3M NaAc,2倍体积预冷无水乙醇，于20°C过夜，12000g，4°C下离心10分钟，得DNA沉淀，弃上清，加入70%乙醇洗涤2次后弃干乙醇，加入50 μ I TE溶解DNA。此夕卜，还可用低熔点琼脂糖凝胶法、DNA滤膜插片法等将目的DNA片段从凝胶中分离、纯化出来。②hTERT纯化与回收:从琼脂糖中分离hTERT条带:在长波紫外光源下将含目标hTERT片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行)，加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm)，接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待hTERT全部移出凝胶，改变电场方向继续通电I分钟，从透析袋中吸出缓冲液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍体积正丁醇，混匀抽提去EB，在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，自下层hTERT的溶液中加入等体积酹氯仿(2个)抽提2次,上清转入另一 Eppendorf管中加入I / 10倍体积3M NaAc,2倍体积预冷无水乙醇，于20°C过夜，12000g，4°C下离心10分钟，得hTERT沉淀，弃上清，加入70%乙醇洗涤2次后弃干乙醇，加入50 μ I TE溶解hTERT。此夕卜，还可用低熔点琼脂糖凝胶法、hTERT滤膜插片法等将目的hTERT片段从凝胶中分离、纯化出来。
[0016]2、SV40LT 和 hTERT 分别与载体 pcDNA3.1 和 pLXSNneo 构建重组子:(I)SV40LT / pcDNA3.1 重组子的构建:取 9 μ I 上述 DNA 成份(0.1-5 μ g)、10 μ 12 X 连接缓冲液、I μ 11OmmoI/LATP, T4DNA连接酶(20?500粘性末端单位)或大肠杆菌DNA连接酶、pcDNA3.1空载体混合，15 V温育24h，构建成SV40LT / pcDNA3.1重组子。(2) pLXSNneo-hTERT重组子的构建:取9 μ I上述纯化的hTERT成份(0.1_5 μ g)、
Iμ 110mmol / L ATP、10ul Ligat1n Mix 或大肠杆菌 DNA 连接酶、2ul pLXSNneo 空载体混合，15°C温育24h，构建pLXSNneo-hTERT重组子。
[0017]3、重组子的纯化、扩增、鉴定:(1)SV40LT / pcDNA3.1重组子的扩增、分离与鉴定:
①大肠杆菌感受态的制备:其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化，用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌，本法适用于大多数大肠杆菌菌株，操作过程简述如下:从37°C培养16?20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52)，或Iml新鲜的16?20h过夜培养物，转到一个含有10mlLB培养基的IL或500ml烧瓶中，于37°C剧烈振摇培养约2?3h (旋转摇床200?300r / min)，每隔20?30min测量0D600值& 0.4，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10?20min后，于4°C用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r / min离心lOmin，以回收细胞，倒数培养液，将管倒置Imin以使最后残留的痕量培养液流尽，以1ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r / min离心lOmin，以回收细胞，倒出培养液，将管倒置Imin以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，_70°C贮存备用，用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 μ I转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物(体积彡10 μ 1，DNA彡50ng)，轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min，将离心管放到预加温到40°C的循环水浴中的试管架上，放置90s?2min，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却I?2min，每离心管加800 μ 1S0C培养基，用水浴将培养基加温到37°C，然后将管转移到37°C摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积(每个90mm平板可达200 μ I)已转化的感受态细胞转移到含200mmol / LMgS04和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37°C培养，12?16h后可出现菌落。②重组子的筛选、扩增与提取:用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)中，培养过夜后，再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中，再于37°C培养至饱和状态(0D_?4，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400r / min)，于4°C，6000g离心lOmin，用4mL GTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积彡20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在_20°C或一 70°C无限期保存)，加入ImL新配的含25mg / mL溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置lOmin，加入1mL新配NaOH / SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g离心lOmin，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混勻，室温放置5?1min,于室温，1500g离心1min,加入211^70%乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C长期保存)。③重组子的鉴定:上述从感受态大肠杆菌中提取的DNA(含SV40T / pcDNA3.1)，同上法用限制性内切酶BamH I进行酶切，1g / L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得大小约2600bp及5600bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。(2) pLXSNneo-hTERT重组子的纯化、扩增、鉴定:①大肠杆菌感受态的制备:其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化，用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌，本法适用于大多数大肠杆菌菌株，操作过程简述如下:从37°C培养16?20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52)，或Iml新鲜的16?20h过夜培养物，转到一个含有10mlLB培养基的IL或500ml烧瓶中，于37°C剧烈振摇培养约2?3h (旋转摇床200?300r / min)，每隔20?30min测量0D600值& 0.4，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r / min离心lOmin,以回收细胞,倒数培养液，将管倒置Imin以使最后残留的痕量培养液流尽，以1ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上，于4°C用Sorvall6S3转头(或与其相应的转头)以4000r / min离心lOmin，以回收细胞，倒出培养液，将管倒置Imin以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70°C贮存备用。②以感受态大肠杆菌纯化和扩增pLXSNneo-hTERT重组子:用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中分别取200 μ I转移到无菌的微量离心管中，在每管中加DNA或连接反应混合物(体积彡10 μ 1，DNA彡50ng)，轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min，将离心管放到预加温到40°C的循环水浴中的试管架上，放置90s?2min，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却I?2min，每离心管加800 μ ISOC培养基，用水浴将培养基加温到37°C，然后将管转移到37°C摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积(每90mm平板可达200 μ I)已转化的感受态细胞转移到含200mmol / LMgS04和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37°C培养，12?16h后可出现菌落。③筛选、扩增重组子:用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)中，培养过夜后，再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中，再于37°C培养至饱和状态(0D_?4，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400r / min)，于4°C，6000g离心lOmin，用4mL GTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积彡20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在_20°C或_70°C无限期保存)，加入ImL新配的含25mg / mL溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置lOmin，加入1mL新配NaOH / SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g离心lOmin，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混勻，室温放置5?1min,于室温，1500g离心1min,加入211^70%乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C长期保存)。④重组质粒的鉴定与扩增:挑取平皿上的单菌落，接种于3ml含10ug / ml氨节青霉素LB培养基中，37°C，250r / min摇床中培养，14h后收集培养物，4°C、10000r / min离心5min，按试剂盒说明书小量提取并纯化重组质粒；以EcoRI和HindIII双酶切重组质粒反应体系:限制性内切酶各0.5ul、10Xbuffer2ul、重组质粒10ul、加水补足至20ul，37°C酶切Ih。酶切产物于80V电压条件下进行0.8%琼脂糖电泳，时间30min，凝胶成像系统拍照；按常规测定重组质粒的序列；重组质粒经酶切、测序鉴定准确后，将含有该质粒的细菌接种至LB培养液中，扩增培养，按大剂量质粒抽提试剂盒说明书进行大剂量质粒抽提纯化，紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度后备用。
[0018]4、巨核细胞的收集:①以无菌操作提取在作其他实验后多余、废弃的含有巨核细胞的标本(如骨髓细胞学等检查后剩余的标本)。②将标本与等量1640培养液混匀后，沿管壁渐渐加入到含有4ml淋巴细胞分离液的离心管中(混合血:淋巴细胞分离液=6:4)，3000转离心10分钟。③去红细胞层，吸取白细胞层，重复上述步骤②，分离巨核细胞，移入另一支离心管中，加入不含血清的1640培养液6ml,轻轻混勻,进行第一次洗漆。1500转离心15分钟。④弃上清液，再加6mll640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟，弃上清液。
[0019]5、巨核细胞预培养:将上述细胞接种于含5?1nmol / L胰岛素、25%胎牛血清的RPMI1640液中，或接种于含25%胎牛血清、5?1nmol / L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，一般接种于3ml新鲜配制的培养基(1.6% IM HEPES缓冲液；15%胎牛血清(FBS)；I %青霉素和链霉素;PRMI1640补足到100% )，置于37°C，5% C02培养箱内，培养1-2天，离心，去上清液，备用。
[0020]6、重组子SV40LT / pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT导入巨核细胞及扩大培养:在1.5ml微量离心管中制备下列溶液:取管A，将重组子SV40LT / pcDNA3.1溶于50 μ I无血清培养液中；取管B，将重组子pLXSNneo-hTERT溶于50 μ I无血清培养液中；然后取管C，将20 μ I脂质体Lipofectamine溶解于80 μ I无血清培养液中，管Α、管B和管C混匀，室温下置45min。用无血清培养液洗涤上述巨核细胞2次。在Lipofectamine-SV40LT /pcDNA3.1和Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入Iml无血清培养液，轻轻混勻，再滴加至上述巨核细胞中，然后加入Iml无血清培养液(胎牛血清浓度为20ml / L)，在CO2培养箱培养10h，吸出转染液，加4ml完全培养液(胎牛血清浓度为25% )，继续培养20h，弃去培养液，更换浓度为400mg° Γ1的G418培养液继续培养，7-8天后选择活细胞作扩大培养后，再加大G418浓度到800mg° L—1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的细胞继续进行扩增培养。培养9天左右镜下观察，可见巨核细胞明显增大，出现聚集现象。如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液PH值呈酸性，吸出半量培养液，进行等量换液。当总量达到14ml左右时转移到75ml培养瓶中，每2_3周加入5_10ml新鲜培养基。细胞培养至第15-19周(约第130代)，仍处于对数生长期，即细胞增加数量与培养时间呈倍增关系，死亡细胞少于10% (通过读取培养容器的刻度判断细胞数量的增加情况；通过台盼蓝染色法鉴别死细胞和活细胞。因为正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥，使台盼蓝不能够进入胞内；而丧失活性的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色，可判断为细胞已经死亡。方法是每周吸取一定量的细胞培养悬液，与台盼蓝染色剂混合后置室温5?10分钟，然后制成细胞薄片，在显微镜下计数1000个细胞总数，计算着色的死细胞和不着色的活细胞的百分比)。此后随着培养代数的增加和培养时间的延长，细胞数量的增加变慢、死亡细胞越来越多，直至细胞不再增加，甚至溶解、减少、全部死亡。当总量达到45ml左右时，置50ml离心管中，离心1500转，10分钟，弃上清，加入3ml冻存培养基(5%二甲基亚枫(dimethylsufoxide), 95% FBS)混匀，成细胞悬浮液(细胞浓度约为15 / ml)。冻存管分装，Iml /管，置一 20°C 2h，再置一 70°C 2h，然后冻存在-196°C液氮中(或立即置零下80度，1_2小时后移入液氮罐中)。以此构建永生化巨核细胞模型。
[0021]7、巨核细胞模型生物学特性的鉴定:鉴定的关键问题有:一是要求该细胞具有持续的增殖能力，即SV40LT和hTERT在细胞中稳定表达；二是要求其形态、基本生物学特性等保持不变。①观察细胞形态:可见巨核细胞明显增大，出现聚集现象，具有巨核母细胞化特征。②观察细胞生长曲线:取生长较好的转染细胞，制成细胞悬液，经计数，分别取1.4X 14细胞接种于30个含15FBS低糖DMEM培养基培养瓶。每天取2瓶细胞进行计数，计算均值，连续观察直至细胞数量明显下降，培养3天后每隔2天给未计数的细胞换液，采用同样方法观察转染细胞在h印ato ZYME — SFM无血清培养基中的生长情况。结果以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴(对数)，描绘在半对数座标上制成曲线后即成该细胞的生长曲线，永生化细胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③检查染色体:通过分析染色体核型，如果染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”，或与原代细胞的核型相同，则说明该细胞系没有发生恶性转化(同时可用流式细胞仪分析细胞系中是否出现异常的DNA群体，如果没有，也说明细胞系未出现瘤性特征)。染色体核型分析方法是:按5mL培养液中加入预热的250ug / ml秋水仙素lOOul，混匀后置37°C培养箱4小时，经离心、去上清液、低渗、固定、制片、G显带后分析染色体核型裸鼠致瘤试验:将SV40LT和hTERT永生化的细胞以3X 17接种裸鼠背部皮下，2个月后，4只裸鼠均未见肿瘤形成，证明此细胞为非恶化细胞；⑤转染细胞DNA中SV40LT和hTERT检测:如以免疫组织化学检测，SV40转染的细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明SV40T抗原已整合入细胞内；也可用RT-PCR法检测T抗原在细胞中的表达，其中T抗原的引物:上游引物(A4239)5，-GTT AT6ATT ATA ACT GTT ATG-3，，下游引物(S4496)5，-GAAAT6CCA TCT AGT GAT - 3，;扩增产物长度为268bp，扩增条件为 94°C,5min,即:(94°C, lmin ；55°C, lmin, — 0.5°C / 循环；72°C, lmin) X30、(94°C,30S ；40°〇，305，721:，305)\15，扩增体系为5(^1:[]\%2+]2臟01 / L、dNTPs200ymol / L、引物浓度0.4 μ mol / L、Taq 1U、模板5 μ I ;实验组以第19代细胞的cDNA为模板(参照市售cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA第一链合成，产物一 20°C保存)；阴性对照设两个，分别以无菌水、原代细胞的cDNA做模板，阳性对照以SV40DNA为模板(参照SDS —蛋白酶K法提取SV40DNA，因为SV40病毒无包膜，不使用SDS破膜，取5 μ I进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，其余_20°C保存备用)；?mRNA表达产物测定:T抗原mRNA RT-PCR产物测序:取100 μ I体系的扩增产物，用凝胶回收试剂盒(Takara，日本)回收产物，取2μ I DNA溶液稀释100倍，测浓度，余下的DNA及上、下游引物各10 μ I进行测序。⑦流式细胞术检测:检测第19代细胞系中合成、分裂的细胞比例，如果其增殖能力明显比未建系的正常细胞增强，说明是SV40LT或hTERT整合、表达的结果。⑧DNA序列测定:按常规测序仪检测，符合SV40LT和hTERT基因序列。
[0022]所以，本发明的细胞模型为①巨核细胞同时转染了 SV40LT和hTERT基因而成为可长期传代培养的永生化巨核细胞模型；②巨核细胞模型的染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY” ;③巨核细胞模型的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepatoZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；④巨核细胞模型不能在软琼脂内生长(形成克隆)为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；⑥巨核细胞模型的DNA同时整合了SV40LT和hTERT基因，同时表达SV40LT和hTERT基因的mRNA产物；⑦胞培养至第15-19周(约第130代)，仍处于对数生长期；⑧能反复冻存、传代培养130代以上；@用于研究巨核细胞的功能；⑩可再生性地保存SV40LT和hTERT介导巨核细胞相关的遗传资源。
[0023]8、SV40LT和hTERT介导巨核细胞模型及其细胞库:筛选并扩大培养经上述鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的细胞，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞，经过消化、终止和离心分离(1200r / min，6min)，用含二甲亚砜的冻存液0.5?Iml重悬细胞，细胞密度为5X 15个/ ml，加入冻存管，分装、标注，经4°C，0.5h ；-20°C,2h ;-70°C，过夜，入_196°C液氮冻存。以此法构建生物学特性稳定的永生化巨核细胞模型及其细胞库，以集中保存遗传资源，为其他研究提供科研材料，并作为巨核细胞相关疾病发病机制体外研究的细胞模型，以加速拓展巨核细胞相关研究的新途径、从细胞水平在体外长期研究巨核细胞受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制。
[0024]9、巨核细胞模型的应用:
[0025]I)使巨核细胞模型处于人为制造的具有不同含量或浓度的有害物如物理(如X射线)、化学(如甲醛、汽油、铅、汞)、生物(如风疹病毒，巨细胞病毒，疱疹病毒)的条件下培养，然后取体外长期传代的不同周期的活细胞、传代过程的凋亡细胞、含有传代培养中所产生的代谢产物的培养液，应用常规方法如基因芯片、miRNA芯片、比较基因组杂交芯片(CGH)、差异甲基化杂交芯片(DMH)和SNPs等筛选差异的基因及其多态性、甲基化水平；运用原位杂交(FISH)、Northern blot、Real-time PCR、CHIP、EMSA等技术检测基因所在研究细胞模型中的基因转率表达、定位及调控；利用酶反应学、代谢组学技术鉴定细胞模型长期传代中蛋白质代谢过程和关键的代谢产物；应用双向电泳、MALD1-T0F质谱鉴定、酵母双杂交和免疫共沉淀等技术研究细胞模型在长期传代中的蛋白质功能及蛋白质间的相互作用，从活细胞培养过程动态、长期研究巨核细胞模型在各种情况下的耐受性及产血小板的功倉泛。
[0026]2)使细胞模型和对照细胞分别在含有0.1、1.0、5.0、10.0、20.0pmol / L苯并芘的培养液中培养，检测在培养2周、4周、6周、8周、16周等不同培养时间的可作为细胞毒性指标的细胞凋亡、坏死、双核细胞率和可作为遗传毒性指标的微核率、核质桥率、核芽率，即在光学显微镜下计数10000个双核细胞中的微核数、核质桥数和核芽数；500个活细胞中的凋亡和坏死细胞数、双核细胞数，以及检测细胞存活率，即应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)，在吸去原培养液后，在96孔板上加入20%的5mg / mlMTT的无血清培养液，继续培养4h，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150yL 二甲亚砜，振荡lOmin，使紫色结晶物充分溶解，本酶标仪以490nm测定各孔的吸光度值，计算出细胞存活率。还可以其他常规实验方法检测不同培养时间的含毒性物与不含毒性物、巨核细胞模型与正常细胞中各组细胞的基因突变、蛋白质组学、细胞分泌功能、染色体畸变、细胞存活率(寿命)等，以从活细胞培养过程中从细胞水平动态、长期研究环境有害因素对巨核细胞功能、机制的影响。
【权利要求】
1.一种用于医学领域的转染SV40LT和hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(-) DNA的产物，构建SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重组子；并以Ligat1n Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染体外培养的巨核细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、SV40LT和hTERT mRNA表达、免疫组化、细胞增殖周期及其凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT介导巨核细胞体外研究细胞模型冻存于液氮中，以建立在体外长期传代培养巨核细胞的方法并用于体外研究巨核细胞发育、功能和病理机制。
2.根据权利要求1所述的转染SV40LT和hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所指细胞模型为①巨核细胞同时转染了 SV40LT和hTERT基因而成为可长期传代培养的永生化巨核细胞模型；②巨核细胞模型的染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY” ;③巨核细胞模型的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepatoZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；④巨核细胞模型不能在软琼脂内生长(形成克隆)为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；⑥巨核细胞模型的DNA同时整合了SV40LT和hTERT基因，同时表达SV40LT和hTERT基因的mRNA产物；⑦胞培养至第15-19周(约第130代)，仍处于对数生长期；⑧能反复冻存、传代培养130代以上；@用于研究巨核细胞的功能；⑩可再生性地保存SV40LT和hTERT介导巨核细胞相关的遗传资源。
3.根据权利要求1所述的转染SV40LT和hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是原代巨核细胞取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后剩余、废弃的含有巨核细胞的标本。
4.根据权利要求1所述的转染SV40LT和hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所用的培养液为含有20%胎牛血清、5?1nmol / L胰岛素的RPMI1640或含有20mL / L胎牛血清、5?1nmol / L胰岛素的低糖DMEM培养液。
5.根据权利要求1所述的转染SV40LT和hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是用作脂质体转染法导入重组子的巨核细胞，处于预培养后1-2天。
6.根据权利要求1所述的转染SV40LT和hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是作染色体核型分析时，每5mL培养液中加入250ug / ml秋水仙素10ul，混匀后置37°C培养箱4小时。
7.根据权利要求1所述的转染SV40LT和hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是细胞库的构建包括(I)筛选经鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的SV40LT和hTERT介导的巨核细胞；(2)作传代、扩大培养，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞；(3)经消化、终止、离心(1200r / min,6min)步骤收获细胞；(4)用含二甲亚砜的冻存液配制密度为5 X 15个/ ml的细胞悬液；(5)按照4°C,0.5h ；-20°C,2h ;-70°C，过夜；入_196°C液氮的程序冻存细胞；(6)可再生性地长期保存SV40LT和hTERT重组子转染法构建的巨核细胞模型，备作遗传资源和科研材料。
【文档编号】C12N15/85GK104419725SQ201310404008
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月1日 优先权日:2013年9月1日
【发明者】翁炳焕, 鲁林荣, 蔡志坚, 毛愉婵, 潘玲, 黄荷凤 申请人:翁炳焕