一种提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法，具体过程是：利用改造的P450单加氧酶基因和合成的杨树UDP-葡萄糖苷糖基转移酶（UGT）基因来构建二价基因植物表达载体，然后将二价基因表达载体通过农杆菌介导转化到植物中。利用本发明，使获得的转基因植物对多环芳烃的耐受性和降解能力提高，种植这种转基因植物有利于修复被多环芳烃污染的土壤环境。
【专利说明】一种提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境科学领域，具体涉及一种提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法。
【背景技术】
[0002]多环芳烃(PAHs)大多是石油、煤等化石燃料以及木材、天然气、汽油、重油、有机高分子化合物、纸张、作物秸杆和烟草等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生成的。高分子量PAHs在环境中比较稳定，能以其为唯一碳源和能源进行代谢的降解菌的研究报道甚少。大多数微生物对四环及以上多环芳烃的矿化作用一般是以共代谢方式开始的。共代谢过程中微生物优先利用一种较易摄取的基质获取能量，进而完成另一种基质的代谢，只有在初级碳源和能源存在的条件下，微生物才能进行有机物降解。Mahaffey等的实验表明，在有联苯、水杨酸作为共代谢底物时，拜叶林克氏菌(Bei jerinckia,现在归属鞘氨醇单孢菌Sphingomonas yanoikuyae)可以分解原本不被其作为碳源和能源的苯并蒽。共代谢作用可以提高微生物降解多环芳烃的效率，增大微生物对碳源和能源的利用范围(Mahaffey 等 Applied and Environmental Microbiology1988，54,2415-2423)。
[0003]细胞色素P450是一类以血红素为辅基的B族细胞色素超家族蛋白酶。P450是一种末端加氧酶，从NAD (P) H获得电子后，催化单加氧反应。P450能够在生物体内催化多种内源性物质的生物合成，还参与许多外源性难降解有机物的生物氧化和降解。
[0004]P450在原核和真核生物中广泛存在。真核生物中的P450为膜结合状态，原核生物中的P450为游离状态，为一种可溶性蛋白。不同物种间P450具有同源性。如不同P450形成螺旋倾向的位置十分匹配，疏水性状也极为相似，对P450编码蛋白的分子结构的对比分析发现，在C末端的血红素结合区，存在高度保守的FXXGXXXCXG结构，螺旋K区存在保守的EXXR结构，螺旋I区有一高度保守的苏氨酸。根据氨基酸序列相似性，P450蛋白质分类并命名为家族(CYP1，2...)、亚家族(A,B^…入单个基因(Al，2...)，它们的氨基酸序列同源性分别为:>40%、>55%、>97%。截至2005年I月，已发现并命名4504条来自动物(1581条)、植物(1740条)和微生物(1180条)的P450基因序列。
[0005]Poulos 等首次报导了 P450CAM 的 X-晶体衍射结构(Journal of MolecularBiology 1987,195,687-700)。该分子为三角形，其中血红素平面与三角平面近似平行，血红素辅基深埋于疏水腔内，晶体结构显示Cys-357是血红素中Fe (III)的结合部位。氨基酸序列对比显示P450分子中有两段相似的核心序列存在活性中心区域。第一段含有Cys-357血红素中Fe(III)的结合部位，第二段含有Thr-252，与02结合密切相关。酶的活性中心为六配位，加入底物后，六配位变为五配位，Fe(III)由低自旋变为高自旋并引起条件电位的显著增加，最后还原为F (II)并与O2结合。不同P450底物结合区域的序列存在较大差异，P450底物结合部位的细微变化可以改变P450的底物特异性和催化效率，因此通过对P450酶底物结合部位进行重新设计，一方面可以使P450结合和作用于非天然底物，从而用于特定的环境污染物的生物净化；另一方面可以提高环境污染物的净化效率。
[0006]Fowler ( Journal of the Chemical Society, ChemicalCommunications.1994，2761 - 2762)和 Stevenson (Journal of the American ChemicalSociety, 1996，118，12846-12847)发现P450cam的底物结合部位中酪氨酸Y96突变可以改变其底物的特异性。Y96A突变体能够氧化不被天然P450酶氧化的物质二苯基甲烷，Y96A突变体的底物结合部位具有更大的空间，表示它对底物的要求可能具有更大的可塑性。Y96F突变体使原来底物樟脑的氧化区域和立体选择性发生了变化，但是提高了多环芳烃萘和芘氧化区域专一性，I位和2位萘酚的比例达到93:3。另一个位点F87参与了蛋白质与底物的结合，F87A(L)与Y96F双突变体提高了 P450cam对多环芳烃菲、芘和苯并芘的氧化效率。P450BM-3在ω I和ω 3位催化C12-C20饱和或不饱和脂肪酸的氧化。对枯草杆菌(Bacillusmegaterium)的P450BM-3中底物结合位点R47L/Y51F进行双突变，使该区域疏水性加强后，对多环芳烃的氧化活性提高了 40倍；将3个位点A74G/F87V/L188Q进行突变，对多环芳烃萘、芴、二氢苊和苊的氧化活性分别提高到160、53、109和287/min，底物的氧化速率比野生型 P450BM-3 提高了数百倍(Li 等 Applied Biochemistry and Biotechnology 2008,144，27-36)。P450BM-3能在大肠杆菌中高效表达，并具有结构稳定性，因此，该基因被认为最适合用于构建多环芳烃氧化的工程菌株。最近,Brezna等又从分枝杆菌(Mycobacteriumvanbaalenii PYR-1)中克隆获得了 3 个 P450 基因 cypl51 (pipA)、cypl50 和 cyp51,将这些基因在大肠杆菌中表达后，能够有效地分解二苯并噻吩、7-甲基苯并[α]蒽和芘。表明Ρ450在很多细菌中参与了多环芳经的代谢(Applied Microbiology and Biotechnology2006，71，522-532)。
[0007]哺乳动物细胞色素P450单加氧酶在肝脏解毒中作用巨大，将这些基因转化到植物中能降解很多有机污染物。研究发现人P450单加氧酶CYPlAl能够有效地氧化苯并[a]芘等高分子量PAHs，因此根 据Gleba等人的方法，用分泌性信号肽使该基因在植物中大量表达后，分泌到根表面及土壤中，使根系周围PAHs羟化，从而提高植物对高分子量PAHs吸收效率(Proceedings of the National Academy of Sciences 1999,96,5973-5977)。此外，羟化的多环芳烃一般都会通过与葡萄糖醛酸、葡萄糖或甲基结合转移到细胞器中进一步代谢，其中依赖UDP-葡萄糖苷糖基转移酶(UGT)是酚类化合物转移的重要酶类。拟南芥中存在118个不同的UGT，三氯苯酚和四氯苯酚等酚类化合物都能通过UGT催化糖基化后转移分解。本实验室通过基因芯片和表达谱分析，确证3个UGT基因受到萘的诱导，表明这些基因可能参与萘在植物细胞中的转运。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种提高植物对多环芳烃耐受性和降解能力的方法，通过该方法能够拓宽植物修复多环芳烃污染土壤的范围，加快吸收效率。
[0009]为达到上述目的，本发明的技术方案是:
[0010]一种提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法:将改造的P450单加氧酶基因和杨树UDP-葡萄糖苷糖基转移酶(UGT)基因构建二价基因植物表达载体；将所述构建的二价基因植物表达载体通过农杆菌介导转化到植物中。
[0011]优选地，所述P450单加氧酶基因来自于人肝。[0012]优选地，所述P450单加氧酶基因的改造方法是:通过定点突变方法消除P450单加氧酶(cyplAl)基因的129位NcoI切点和1436位EcoRI切点。
[0013]优选地，所述杨树UDP-葡萄糖苷糖基转移酶(UGT)基因按植物偏爱密码通过合成方法获得，所合成的杨树Μ)Ρ-葡萄糖苷糖基转移酶(UGT)中的388和1104位EcoRI，460位HindIII，428位NcoI酶切位点全部消除。
[0014]所述P450单加氧酶基因和UDP-葡萄糖苷糖基转移酶基因构建二价基因植物表达载体的方法为:通过T4DNA连接酶将两个基因与含有双35S启动子和NOS终止子的PYPX245 (Genbank AY178049.1)质粒连接；酶切鉴定和序列测定表明获得了 P450单加氧酶基因和UDP-葡萄糖苷糖基转移酶基因植物表达单元；将两个表达单元酶切后依次插入PCAMBIA1301植物表达载体，构建二价基因植物表达载体pCYPUGT。
[0015]所述构建的二价基因植物表达载体pCYPUGT通过电击法导入到根癌农杆菌中，所述根癌农杆菌优选为EHA105或LBA4404或GV3101。
[0016]优选地，通过所述根癌农杆菌将构建的二价基因植物表达载体pCYPUGT转化到拟南芥和水稻中。
[0017]本发明的有益效果如下:
[0018]1，当植物中转化了 P450单加氧酶基因(cyplAl)和UDP-葡萄糖苷糖基转移酶(UGT)基因的表达载体后，通过表达产生的P450单加氧酶将多环芳烃氧化，然后再通过表达产生的m)P-葡萄糖苷糖基转移酶将其和葡萄糖连接，转移到植物细胞器中进一步分解。因此利用本发明构建的体系可以提高植物对菲或芘的耐受性和降解能力。
[0019]2，该套体系能在植物中安全高效表达，对环境影响较小。
`[0020]3，利用该套体系获得的转基因植物能够有效修复被多环芳烃污染的土壤环境。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明实施例中构建的P450单加氧酶基因(cyplAl)和UDP-葡萄糖苷糖基转移酶(UGT)基因双价基因植物表达载体。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例中涉及的构建二价基因植物表达载体pCYPUGT，其具体的构建方法如下:
[0023]1、构建改造的P450单加氧酶基因(cyplAl)
[0024]从人肝中克隆P450单加氧酶基因并利用定点突变方法将129位NcoI切点，1436位EcoRI切点消除。
[0025]129 位 NcoI 切点突变引物:129Z:AGGGCCTTGGGGCTGGCCTCTGATTGG (SEQ ID N0.1所示)；129F:CCAATCAGAGGCCAGCCCCAAGGCCCT (SEQ ID N0.2 所示)。
[0026]1436 位 EcoRI 切点突变引物:1436Z:ACGGGTGGAGTTCAGCGTGCCACTGG(SEQ ID N0.3所示)；1436F:CCAGTGGCACGCTGAACTCCACCCGT (SEQ ID N0.4 所示)。
[0027]人肝总RNA，cDNA合成试剂盒为Clontech公司产品；DNA柱回收试剂盒购置Amersham公司；试剂RNA抽提试剂盒RNeasy Plant Mini Kit为QIAGEN公司产品；各种限制性内切酶和T4DNA Ligase均购自上海Takara公司。总RNA采用QIAGEN公司的RNeasyPlant Mini Kit 提取。
[0028]取约50 μ I人肝总RNA进行cDNA合成，cDNA的合成按Clontech公司SMART cDNALibrary Construction Kit说明书操作进行第一链合成。
[0029]以合成的cDNA 第一链为模板，以此 cyplOlZ:AAGGATCCATGCTTTTCCCAATCTCCATG(SEQ ID N0.5 所示)和 cyplOlF:AAGAGCTCCTAAGAGCGC AGCTGCATTTGGAAGTG (SEQ ID N0.6所示)为引物，利用PCR进行cDNA扩增，扩增条件为:94°C，预热Imin ;94°C，30s，60°C，30s，72°C，3min。共25个循环。PCR结束后，采用酚:氯仿抽提，再加入2倍体积的无水乙醇进行沉淀。沉淀用30 μ I水溶解，取I μ I为模板，以引物cyplOlZ和129F ；129Z和1436F ；1436Z 和 cyplOlF 进行 PCR 扩增，扩增条件为:94°C 预热 Imin ;94°C，30s，60°C，30s，72°C，lmin。共25个循环，PCR结束后，DNA片断用10%丙烯酰胺胶回收，将上述3个回收的DNA片断取IO-1OOng为模板混合，以cyplOlZ和cyplOlF为引物将上述片断拼接，扩增条件为:94°Cd；^^lmin;94°C，30s，60°C，30s，72°C，4min。共 25 个循环。
[0030]PCR结束后，酚:氯仿抽提，再加入2倍体积的无水乙醇进行沉淀。各加入SacI和BamHI酶切消化，DNA柱回收酶切片断。将酶切处理好片段进行定向克隆，获得质粒Tl，并将质粒Tl高效转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中。
[0031]2、合成杨树UDP-葡萄糖苷糖基转移酶基因
[0032]以基因合成方法(NucleicAcids Research, 2004, 32, e98)获取杨树 UDP-葡萄糖苷糖基转移酶基因。合成的杨树Μ)Ρ-葡萄糖苷糖基转移酶基因中388和1104位EcoRI，460位HindIII，428位NcoI酶切位点全部消除。
[0033]设计的引物为:
[0034]PtUGTl:
[0035]GGATCCATGGCAGAGACTGACTCTCCACCACATGTTGCCATCTTGCCATCTCCAGGTATG (SEQ ID N0.7 所示)
[0036]PtUGT2:
[0037]CMGTCTCTTAGCCMCTCMCCAGTGGGATCAGATGACCCATACCTGGAGATGGCMGA (SEQ ID N0.8 所示)
[0038]PtUGT3:
[0039]TGAGTTGGCTMGAGACTTGTTCACCMCACMCCTGTCOGTCACCTTCATCATTCCMC (SEQ ID N0.9 所示)
[0040]PtUGT4:
[0041]TCCAAGAAOGCTTCTTTGAGCTTTGGATGGAGAGCCATOGGTTGGAATGATGAAGGTGACCSEQ ID N0.10 所示)
[0042]PtUGT5:
[0043]CTCMAGMGCGTTCTTGGATCTCTTCCATCTACCATTCACTCOGTCTTTCTTCCACCAG(SEQ ID N0.11 所示)
[0044]PtUGT6:
[0045]GTCTOGATCTTGACATCTTCTGGAAGATCAGACAAGTTGACTGGTGGAAGAAAGAOGGAGCSEQ ID N0.12 所示)
[0046]PtUGT7:
[0047]GMGATGTCMGATOGAGAOOCTGATCTCTCTGACTGTTGCTAGATOC CTT0CTTCTCTC (SEQ ID N0.13 所示)
[0048]PtUGT8:
[0049]CTCTGCTTOCAGAGGCGACMGAGMGACAGMCATCTCTGAGAGMGGMGGGATCTAG (SEQ ID N0.14 所示)
[0050]PtUGTO:
[0051]TGTOXrrCTGGAACCAGAGTTGTTGCCTTGGTTGTTGATCTGTTTGGCACTGATGCATTCSEQ ID N0.15 所示)
[0052]PtUGTlO:
【权利要求】
1.一种提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法，包括如下步骤: 步骤1，将改造的P450单加氧酶基因和杨树UDP-葡萄糖苷糖基转移酶(UGT)基因构建二价基因植物表达载体； 步骤2，将所述构建的二价基因植物表达载体通过农杆菌介导转化到植物中。
2.如权利要求1所述的提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述P450单加氧酶基因来源于人肝。
3.如权利要求1或2所述的提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述P450单加氧酶基因的改造方法是，消除P450单加氧酶(cyplAl)基因的129位NcoI切点和1436位EcoRI切点。
4.如权利要求1所述的提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述杨树Μ)Ρ-葡萄糖苷糖基转移酶(UGT)基因按植物偏爱密码通过合成方法获得，其中388和1104位EcoRI，460位HindIII，428位NcoI酶切位点全部消除。
5.如权利要求1所述的提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述农杆菌为根癌农杆菌EHA105或根癌农杆菌LBA4404或根癌农杆菌GV3101。
6.如权利要求1所述的提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述多环芳烃为菲、芘。
7.如权利要求1所述的提高植物对多环芳烃的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述植物为拟南芥、水稻。`
【文档编号】C12N15/84GK103509819SQ201310410523
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】彭日荷, 姚泉洪, 王荣谈, 付晓燕, 田永生, 赵伟, 严培兰, 丁卫星 申请人:上海市农业科学院, 上海瑞丰农业科技有限公司