一种小菜蛾天蚕素3及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小菜蛾天蚕素3及其制备方法与应用。所述小菜蛾天蚕素3（cecropin3）基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示；其相应的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。经序列分析发现小菜蛾天蚕素3的成熟肽的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。将小菜蛾天蚕素3基因或其成熟肽序列进行原核表达，获得的小菜蛾天蚕素3不仅对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，而且对病原真菌也有较强的抑制作用，尤其是对瓜果类的一些病原真菌有较强的抑制作用，有望发展成为新型的肽类抗生素。
【专利说明】—种小菜蛾天蚕素3及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种小菜蛾天蚕素3及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]抗菌肽是一类不易导致微生物耐药性的新型抗感染多肽。世界上发现的第一种抗菌肽是天蚕素(cecropins)。1980年由瑞典科学家Boman等用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生出抗菌活性的多肽物质，定名为天蚕素(cecropins)。天蚕素是第一种被发现的昆虫抗菌肽，广泛存在于昆虫中，现在已经从鳞翅目的蛾类、蝴蝶及双翅目的蝇类中分离纯化出20多种天蚕素类似物。随后又在其他生物体内陆续发现了多种抗菌肽，如娃皮素(magainins)、蜂毒素(melittins)、防御素(defensins)等。
[0003]目前世界上已知的抗菌肽共有1200多种。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为抗菌肽。随着研究工作的深入开展，发现某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有很强的杀伤作用。抗菌肽的抗菌谱较传统抗生素宽，传统抗生素通常只对细菌有效，而对真菌、病毒等病原体无效。抗菌肽既有抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的作用，又有抗真菌、抗病毒作用。抗菌肽不仅自身具有良好的抗菌活性，不同天蚕素抗菌肽与传统抗生素联用，还可提高各自的药物疗效，甚至拓宽传统抗生素的抗菌谱，这也是近年来对天蚕素抗菌肽研究中的一个新发现。
[0004]但是将抗菌肽发展成为抗菌药物的最大挑战是以具竞争力的成本大量生产高纯度的肽。从自然源分离抗菌 肽成本高，资源有限，且只对天然肽有用；化学合成能产生天然或经修饰的抗菌肽，但代价高，所以需要有效且经济的合成方法。用基因工程重组技术在宿主细胞内合成抗菌肽是目前较为经济且有效的方法，易于大规模生产，还可改造、合成抗菌肽基因。已有多种抗菌肽表达系统，如大肠杆菌、酵母菌、杆状病毒/昆虫细胞、转基因哺乳动物、转基因植物。原核表达因其速度快、产量高、操作简单、费用低廉而被广泛应用，但是，抗菌肽所携带的碱性氨基酸使其对蛋白酶非常敏感，且抗菌肽对宿主菌本身有毒性，或者表达的抗菌肽本身无活性，这些问题可通过将抗菌肽与一个较大的蛋白分子融合表达来克服。陈海旭等表达了 Diptericin cDNA，并利用麦芽糖结合蛋白融合表达系统将diptericin抗菌蛋白在大肠杆菌中得到高效的可溶性表达。表达产物经Xa因子酶切后显示出较强的抗菌活性(陈海旭等，2001)。李秀兰等对天然天蚕素的基因序列作了 50%的改动，根据大肠杆菌偏爱的密码子人工合成了肽基因片段，再将此片段重组到表达载体PET28上进行表达，融合蛋白经CNBr裂解后，释放出的抗菌肽具有与天然抗菌肽相同的生物活性(李秀兰等，1999)。谢维等根据已知家蚕抗菌肽CM4的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子，人工合成家蚕CM4基因，在大肠杆菌中表达融合蛋白，经裂解获得高活性的抗菌肽CM4 (谢维等，1997);袁榴娣等将抗菌肽X基因在大肠杆菌中获高效表达，表达量约占细胞总蛋白的20%,融合蛋白以可溶形式存在，融合蛋白经FXa切割后，产物有抗菌活性(袁榴娣等,2000)。Terry等在研究娃皮素(magainin)时发现，magainin在体内是以前体形式表达的，前体中的酸性小肽中和了 magainin的正电荷，保护了前体不受蛋白酶的降解，直到前体剪切产生成熟的多肽(Terry et al.，1998)。Yang等报道在E.coli中表达人源抗菌肽LL-37的变体GSLL-39时发现，将LL-37基因直接插入融合蛋白表达载体pET32c (+)中，没有检测到蛋白表达；而将LL-37的前体序列插入到载体中，获得了较高的表达。但由于获得的终产物GSLL-39只有39个氨基酸，在融合蛋白(307aa)中只占到12% (Yang etal.，2004)。许小霞等在2004年构建了分泌型表达质粒(许小霞等，2004)。金丰良等将Mdcec和Mdcec/6His克隆到酵母表达载体pPICZ a A中，进行了表达，表达量分别为12mg/I和20mg/l。活性测定表明Mdcec对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性性菌和真菌均有杀菌活性，而Mdcec/6His对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性性菌和真菌均有杀菌活性，但是相对Mdcec，抗真菌活性更强。原因6His能增强阳离子肽的性质和稳定性(Jin et al，2006)。许小霞等将家蝇抗菌肽cecropin (Mdmcec)与硫氧还蛋白融合后在大肠杆菌BL21中得到高量可溶性蛋白，表达量为48mg/l。融合蛋白经肠激酶切割后释放出具有生物活性的Mdmcec，表达量为 11.2 mg/1 (Xu et al.，2007)。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种小菜蛾天蚕素3基因。
[0006]本发明另一目的在于提供一种小菜蛾天蚕素3蛋白。
[0007]本发明另一目的在于提供一种小菜蛾天蚕素3成熟肽蛋白的制备方法。
[0008]本发明另一目的在于提供一种小菜蛾天蚕素3和其成熟肽的应用。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案予以实现:
一种小菜蛾天蚕素3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。其中SEQ ID NO:I为小菜蛾天蚕素3基因的全基因序列(包括5’端非编码区、3’端非编码区和编码区序列)；SEQ ID NO:2为小菜蛾天蚕素3基因的ORF序列；0RF序列能编码61个氨基酸的蛋白。
[0010]一种小菜蛾天蚕素3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。SEQ ID NO:3为小菜蛾天蚕素3编码蛋白序列，该序列由61个氨基酸组成。
[0011]一种小菜蛾天蚕素3的成熟肽，成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；成熟肽对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0012]一对扩增小菜蛾天蚕素3的引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:11~12所示。
[0013]一种重组表达载体，由出发载体的多克隆位点插入如上SEQ ID NO:1~2所述小菜蛾天蚕素3的核苷酸序列或如上SEQ ID NO:5所述小菜蛾天蚕素3的成熟肽的核苷酸序列。
[0014]优选地，所述重组表达载体为pET32_PxCec3。
[0015]一种重组菌株，是由如上所述的重组表达载体转化受体菌株构建而成的，优选地，所述受体菌株为表达宿主菌BL21。
[0016]一种小菜蛾天蚕素3的成熟肽的制备方法，包括如下步骤:
51.将如上所述的重组菌株接种于发酵培养基中培养至0D600为0.8时，加入终浓度为0.4 mM IPTG，同时加入终浓度为0.2%的葡萄糖，25°C诱导表达9小时，离心收集菌体；
52.用预冷的TE缓冲液(pH8.0)洗涤菌体后，再用预冷的溶液I (300 mM KCl(pH8.0), 50 mM KH2PO4，5 mM咪唑)重悬菌体，超声破碎菌体，离心收集上清液；S3.上清液经Ni2+金属亲和层析HisTrap HP纯化，纯化的融合蛋白经肠激酶酶切，酶切产物先后用HisTrap HP柱和超滤装置进行纯化即得小菜蛾天蚕素3成熟肽。
[0017]具体地，所述小菜蛾天蚕素3的成熟肽的制备方法，包括如下步骤:
将如上所述的重组菌株接种于LB液体加富培养基(含lOOPg/ml Amp+)中，37°C剧烈振荡培养16小时，作为种子菌。取种子菌按1: 50体积比接种于新鲜的LB加富培养基(含100 μδ/πι1 Amp+)中，37°C剧烈振荡放大培养至0D600 =0.8时，加入终浓度为0.4 mMIPTG，同时加入终浓度为0.2%的葡萄糖，降低本底的表达。在25°C诱导表达9小时，4 °C、12, OOOg离心2min，收集菌体备用。用预冷的TE缓冲液(pH 8.0)洗涤菌体后，再用预冷的溶液 I (300 mM KCl (pH8.0)，50 mM KH2PO4，5 mM 咪唑)重悬菌体。采用 JY92-1I 型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所研制)以300W的功率，冰浴下超声4-5个循环(超声4s，间歇4s，重复90次为一个循环)破碎细菌细胞，4°C、12，OOOg离心30min后取上清液进行SDS-PAGE分析检测重组蛋白质的表达情况。将破碎菌体离心后收集的上清液，经Ni2+金属亲和层析HisTrap HP纯化融合蛋白，纯化的融合蛋白经肠激酶(EK)酶切，酶切产物先用HisTrap HP (5 ml)进行纯化，收集流出液，流出液再进行第二次HisTrap HP (5 ml)柱纯化，收集流出液，进一步用截留分子量为10.0 kDa的超率装置(Amicon)对重组蛋白进行纯化，除去10.0 kDa以上的大蛋白，进一步用截留分子量为2.0 kDa的超率装置(Amicon)对重组蛋白进行纯化，除去2.0 kDa以下的小蛋白，除去滤过液，冷冻干燥处理，即的天蚕素3成熟肽，-80°C保存备用。
[0018]如上所述小菜蛾抗菌肽cecropin3的应用，用于制备抑制或杀死金黄色葡萄球菌的制剂。如上所述小菜蛾抗菌肽CeCropin3的成熟肽的应用，用于制备抑制或杀死金黄色葡萄球菌的制剂。
[0019]本专利是在现有基础上对其原核系统进行改进，并对我们这类抗菌肽的后续纯化进行深入研究后，设计了一套原核表达系统。首先利用分子生物学技术获得了小菜蛾体内的天蚕素3基因完整开放阅读框的cDNA序列。通过软件对其进行分析获得了成熟肽序列，选用原核系统PET32载体对其进行表达。利用肠激酶切割纯化后，获得具有广谱杀菌活力的成熟肽cecropin3。重组的小菜蛾抗菌肽cecropin3不仅对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，而且对病原真菌也有较强的抑制作用，尤其是对瓜果类的一些病原真菌有较强的抑制作用，有望发展成为新型的肽类抗生素。
[0020]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明利用农业重要害虫小菜蛾作为研究对象，利用深度测序获得小菜蛾725条免疫相关的unigenes,从中筛选了 cecropin3unigene,并利用3’ -RACE和5’ RACE技术获得了 cecropin3的全长cDNA序列，并在原核细胞中高效表达了有活力的重组蛋白cecropin3。重组的小菜蛾抗菌肽cecropin3不仅对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，而且病原真菌也有较强的抑制作用，尤其对瓜果类的一些真菌有较强的抑制作用，有望发展成为新型的肽类抗生素。
[0021]说明书附图
图1.SDS-PAGE分析重组蛋白Pxcec3的结果。
[0022]图2.不同浓度重组蛋白Pxcec3对金黄色葡萄球菌的抑制活性；1:5 μβ/μ? ；2:10μδ/μ? ；3:15 Pg/^L ;4:20 Pg/^L。【具体实施方式】
[0023]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法为本领域常规使用的试剂和方法。
[0024]实施例1小菜蛾天蚕素3基因的克隆
S1.实验室饲养小菜蛾(/7wii?77a幼虫,用大肠杆菌coli)
和金黄色葡萄球菌作为供试菌种。
[0025]S2.小菜蛾转录组序列的测定:收集小菜蛾I龄到4龄幼虫，预蛹、蛹、成虫，抽取总RNA后进行利用RNA-seq技术测定其转录组序列，总RNA的提取方法参照Trizol(Invitrogen，USA)试剂盒说明书操作。共测定了 34，522，812 条 clean reads, reads 平均长度为90bp，获得3，107，053，080个碱基。最后组装成107710个Unigene，长度范围为20(T3000bp。COG,GO,KEGG注释和分析后共获得68984条具较高注释可信度的Unigene，与昆虫免疫直接相关的Unigenes 725条,其中cecropin的Unigene I条,其序列为131 bp,SEQ ID NO:6 所示。
[0026]S3.根据cecropin的Unigene设计3 '端和5 '端RACE末端快速扩增反应的特异引物，3 ' RACE 引物序列为:5 ' -GCTCCCAGGTGGAAAGGC-3 '，如 SEQ ID NO:7 所示，5' RACE 引物为 5' -CTCCATCCCGGATGTGTCGTCC-3'，如 SEQ ID NO:8 所示。3'端和Y端RACE分别和UPMs配对进行RACE末端快速扩增反应，UPMs引物序列为:UPM_L:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(如 SEQ ID NO:9 所示)和UPM-S:5’ -CTAATACGAC TCACTATAGGGC-3’(如 SEQ ID NO:10 所示)。
[0027]S4.cDNA 第一链合成:
首先，提取小菜蛾总RNA:用OD值为0.8~1.0的大肠杆菌菌液刺激小菜蛾4龄幼虫，进行肽聚糖识别蛋白的诱导。取0.5~Ig经6小时诱导后的小菜蛾，液氮中研磨，用Trizol法提取小菜蛾总RNA ;总RNA的提取方法参照Trizol (Invitrogen，USA)试剂盒说明书操作。
[0028]按照CL0NTECH公司RACE试剂盒说明书进行，10微克总RNA，加反应液20微升42°C反应90分钟。72°C 10分钟终止反应。反应液组成:50毫摩尔氯化钾，3毫摩尔氯化镁，10毫摩尔Tris-HCL pH8.3，I毫摩尔DTT, 5微摩尔d NTP, 25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶。
[0029]S5.3' RACE和5' RACE反应:以步骤S4反转录得到的cDNA第一链为模板，S3所示的引物进行PCR反应，链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件如下:
首先将下列试剂混合在一起
10xTaq DNA聚合酶缓冲液5μ? ；
模板 cDNA2μ? ；
正向引物(1.25 Pg/^L)2μ? ；
反向引物(1.25Pg/^L)2μ? ；
脱氧核苷酸混合物(dNTP )4μ? ；
Taq DNA 聚合酶0.5μ? ；
灭菌水34.5μ? ；
总体积50μ? ；在:V -RACE中，正向引物和反向引物分别为:V -RACE(如SEQ ID NO:7所示)和UPMs引物(如SEQ ID NO:9和SEQ ID N0:10所示)W -RACE中，正向引物和反向引物分别为3' -RACE (如 SEQ ID NO:8 所示)和 UPMs 引物(如 SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 所示)。
[0030]PCR反应条件为:首先94°C变性5分钟，然后进入下列循环:94°C 30秒，65°C 30秒，72°C 50秒，共进行35个循环，最后72 °C延伸10分钟。
[0031]S6.反应产物纯化:利用OMEGA BIO-TEK公司产品(Gel Extraction Kit)操作步骤按产品说明书进行。取纯化产物5μ?，与pMD18-T载体(TaKaRa)连接。转化到大肠杆菌DH5 α菌株，在含有lOOmg/mL的氨苄青霉素和0.1moL/mL的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG )的平板上生长过夜，挑取6个白斑，在LB液体培养基(5mL,含lOOPg/mL氨苄青霉素)培养过夜。收取过夜培养菌液f 2mL，离心(1000Orpm, Imin)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(0MEGA BIO-TEK )纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。
[0032]序列测序与同源检索:取500μ?含阳性质粒的菌液，送上海invitrogen公司进行测序。将所得序列拼接后与基因库序列进行比较。
[0033]S7.小菜蛾抗菌肽moricin基因全长cDNA的获得
根据RACE结果，设计一对引物ORFF和0RFR，引物序列SEQ ID NO:11和EQ ID NO:120
[0034]以小菜蛾4龄幼虫的cDNA为模板，反应条件如下:
所述混合液组成如下:
【权利要求】
1.一种小菜蛾天蚕素3基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。
2.一种小菜蛾天蚕素3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
3.一种小菜蛾天蚕素3的成熟肽，其特征在于，成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，成熟肽对应核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.一对扩增小菜蛾天蚕素3的引物，其特征在于，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，由出发载体的多克隆位点插入权利要求1所述小菜蛾天蚕素3的核苷酸序列或权利要求3所述小菜蛾天蚕素3的成熟肽的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为原核载体pET32-PxCec3 。
7.—种重组菌株，其特征在于，是由权利要求5或6所述的重组表达载体转化受体菌株构建所得。
8.一种小菜蛾天蚕素3成熟肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.将权利要求7所述的重组菌株接种于发酵培养基中培养至0D600为0.8时，加入终浓度为0.4 mM IPTG，同时加入终浓度为0.2%的葡萄糖，25°C诱导表达9小时，离心收集菌体； 52.用预冷的TE缓冲液(pH8.0)洗涤菌体后，再用预冷的溶液I (300 mM KCl(pH8.0), 50 mM KH2PO4，5 mM咪唑)重悬菌体，超声破碎菌体，离心收集上清液； 53.上清液经Ni2+金属亲和层`析HisTrapHP纯化，纯化的融合蛋白经肠激酶酶切，酶切产物先后用HisTrap HP柱和超滤装置进行纯化即得小菜蛾天蚕素3成熟肽。
9.权利要求2所述小菜蛾天蚕素3的应用，其特征在于，用于制备抑制或杀死金黄色葡萄球菌的制剂。
10.权利要求3所述小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽的应用，其特征在于，用于制备抑制或杀死金黄色葡萄球菌的制剂。
【文档编号】C12N15/12GK103484467SQ201310411630
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】金丰良, 许小霞, 徐洪芝 申请人:华南农业大学